Lipocalin liên kết với Neutrophil Gelatinase được tiết ra cho thấy khả năng ức chế sự phát triển nang của tế bào ADPKD mạnh hơn so với dạng không tiết Ⅱ
Jun 24, 2024
3. Kết quả
3.1. So sánh biểu hiện NGAL và sự tăng sinh tế bào giữa các tế bào loại hoang dã M-1 và 2L3 ADPKD
Dòng tế bào 2L3 được thiết lập bằng sự tải nạp virus SV40 của các tế bào biểu mô thận nguyên phát từ chuột Pkd1L3/L3 [17]. Tế bào M-1 (dòng tế bào biểu mô thận loại hoang dã của chuột) được mua từ BCRC (Hsinchu, Đài Loan) đã được sử dụng làm đối chứng. Kiểu gen PCR của các bản phiên mã Pkd1 của các tế bào 2L3 và M{12}} đã được tiến hành để kiểm tra các kiểu gen bằng cách sử dụng các đoạn mồi trước và sau vị trí loxP đầu tiên trong intron 30 của alen mục tiêu (Hình 1A). Các mô chuột Pkd1+/+, Pkd1L3/+ và Pkd1L3/L3 được sử dụng làm đối chứng kiểu gen. Các sản phẩm PCR từ các tế bào M-1 cho thấy một dải Pkd1+/+ kiểu hoang dã (WT) duy nhất (473 bp), trong khi các sản phẩm PCR từ các tế bào 2L3 cho thấy một dải Pkd1L3/L3 duy nhất (507 bp) do có thêm phân đoạn loxP (34 bp) (Hình 1B).
Để mô tả xem các ô M-1 và 2L3 có phải từống thận có nguồn gốc tương tự, trước tiên chúng tôi so sánh hình thái giữa 2 dòng tế bào; Tế bào M-1 và tế bào 2L3 có hình thái rất giống nhau (Hình 1C). Ngoài ra, nhuộm lectin bằng Lotus tetragonolobus lectin (LTL, một dấu hiệu của các ống lượn gần biệt hóa, được dán nhãn fluorescein) và Dolichos biflorus agglutinin (DBA, một dấu hiệu của các ống lượn xa và ống góp khác biệt, được dán nhãn rhodamine) để kiểm tra nguồn gốc của chúng từ ống thận (Hình 1D). Kết quả nhuộm màu cho thấy các tế bào M-1 và 2L3 đều là LTL- (chủ yếu được tập trung hóa bằng DAPI) và dương tính với DBA (được định vị trong tế bào chất) (Hình 1D). Kết quả này cho thấy các tế bào M-1 và 2L3 có nguồn gốc từống thậncó nguồn gốc tương tự và có thể có đặc điểm tương tự. Kết quả PCR thời gian thực cho thấy các tế bào 2L3 có mức biểu hiện Pkd1 mRNA giảm nhiều so với các tế bào M-1 (Hình 1E), phù hợp với dữ liệu từ chuột 2L3 có mức biểu hiện protein Pkd1 chỉ bằng 25% của chuột hoang dã [17]. Chuột 2L3 đã được chứng minh là có hàm lượng protein NGAL và thụ thể NGAL (NGAL-R) trong thận cao hơn so với chuột hoang dã [31]. Kết quả PCR thời gian thực cho thấy mức biểu hiện Lcn2 mRNA là 15.96-lớn hơn gấp 15 lần trong 2L3 so với trong tế bào M-1 (Hình 1F), phù hợp với dữ liệu được báo cáo cho chuột 2L3 [31], trong khi không có sự khác biệt đáng kể về biểu hiện Slc22a17 mRNA giữa hai nhóm (Hình 1G). Kết quả Western blot cũng cho thấy các ô 2L3 có mức biểu hiện NGAL cao hơn các ô M-1, trong khi không có sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện NGAL-R giữa hai nhóm (Hình 1H). Các tế bào và chất nổi trên bề mặt của tế bào M-1 và 2L3 đều được thu hoạch sau khi nuôi cấy trong 48 giờ để định lượng NGAL trong các chất ly giải và chất nổi trên bề mặt tế bào (đại diện cho NGAL được tiết ra) bằng ELISA. Phù hợp với kết quả Western blot, ELISA cho thấy 2L3 có NGAL nội bào và bài tiết NGAL ở phần nổi cao hơn đáng kể so với M-1 (Hình 1I).
Chuột 2L3 đã được chứng minh là có khả năng tăng sinh tế bào cao hơn chuột hoang dã [17]. Các thử nghiệm kết hợp MTT và BrdU đã được tiến hành để điều tra xem liệu dòng tế bào 2L3 có cho thấy khả năng tồn tại và tăng sinh tốt hơn so với các tế bào hoang dã hay không (Hình 2A tựa C). Hình ảnh đại diện cho thấy sự hợp lưu của các tế bào 2L3 lớn hơn các tế bào M{10}} sau khi nuôi cấy trong 48 giờ với cùng số lượng gieo hạt ban đầu (Hình 2A). Các thử nghiệm MTT cho thấy tế bào 2L3 có khả năng sống sót tốt hơn đáng kể so với tế bào M-1 được nuôi cấy trong 24 và 48 giờ (Hình 2B). Để so sánh khả năng tăng sinh của tế bào M-1 và 2L3, các tế bào được nuôi cấy trong 24 giờ sau thử nghiệm kết hợp BrdU, cho thấy các tế bào 2L3 có khả năng tăng sinh tốt hơn đáng kể so với tế bào M-1 (Hình 2C) .
3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung mNGAL đến khả năng tồn tại và tăng sinh của tế bào 2L3
Sử dụng NGAL ngoại sinh đã được chứng minh là làm giảm sự phát triển của u nang trong ống nghiệm [25]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức NGAL trong mô hình chuột ADPKD (chuột Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg) làm giảm sự tiến triển của u nang kèm theo những thay đổi trong một loạt các con đường phân tử liên quan đếntăng sinh tế bào, quá trình chết theo chương trình, Vàsự xơ hóa[31]. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của mNGAL tái tổ hợp đến khả năng tồn tại của tế bào 2L3 bằng xét nghiệm MTT (Hình 3). Độ tinh khiết của mNGAL tái tổ hợp (không có peptit tín hiệu) được tinh chế từ E. coli lần đầu tiên được xác định bằng TRANG WEB SDS và nhuộm màu xanh Coomassie, cho thấy một dải 20-kD duy nhất và một dải mờ rất nhẹ ở nồng độ cao ( Hình 3A). Ngoài ra, độ ổn định của mNGAL trong môi trường nuôi cấy tế bào được phân tích bằng phương pháp Western blot, chứng minh tính ổn định của mNGAL trong môi trường ít nhất 48 giờ (Hình 3B). Chúng tôi nhận thấy rằng mNGAL làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào 2L3 so với nhóm đối chứng sau 8 giờ điều trị (Hình 3C). Rapamycin đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực trong thí nghiệm này, được công nhận là chất ức chế mTOR và được biết là có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào biểu mô và sự phát triển của u nang trong mô hình chuột PKD [32]. Ngoài ra, thử nghiệm hợp nhất BrdU cũng cho thấy rằng điều trị bằng mNGAL trong 24 giờ đã ức chế đáng kể sự tăng sinh của các tế bào 2L3 (Hình 3D). Sự tăng sinh tế bào là đặc điểm chính của ADPKD và phát hiện rằng mNGAL có thể làm giảm sự tăng sinh tế bào 2L3 cho thấy mNGAL có thể ức chế hơn nữa sự hình thành nang trong các tế bào 2L3.
3.3. Đường dẫn tín hiệu bị ảnh hưởng khi bổ sung mNGAL vào các tế bào 2L3
Sự kết hợp NGAL và NGAL-R đã được chứng minh là có khả năng cô lập sắt nội bào và tiếp tục gây ra apoptosis [29]. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng NGAL có thể gây ra apoptosis trong mô hình ADPKD in vitro và in vivo [25,31]. Để tìm hiểu xem liệu mNGAL có thể gây ra hiện tượng apoptosis của các tế bào 2L3 hay không, chúng tôi đã phân tích quá trình apoptosis của tế bào 2L3 bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Dựa trên phát hiện rằng mNGAL đã ức chế sự tăng sinh của các tế bào 2L3 sau khi điều trị bằng mNGAL trong 8 giờ (Hình 3D), chúng tôi đã phân tích tác động của mNGAL lên các tế bào 2L3 ở cả hai thời điểm trước đó (4 giờ) và sau đó (12 giờ).
Để phân tích tế bào học dòng chảy, cần có số lượng tế bào cao hơn nhiều và thời gian nuôi cấy ngắn hơn so với các xét nghiệm MTT được tiến hành trước đó; do đó, các tế bào 2L3 được gieo vào các đĩa 6-giếng và nồng độ mNGAL cao hơn (600–1200 µg/mL) được áp dụng cho các tế bào. Kết quả cho thấy 1200 µg/mL mNGAL ức chế đáng kể khả năng sống của tế bào sau 4 và 12 giờ điều trị, trong khi 600 µg/mL mNGAL ức chế khả năng sống của tế bào chỉ sau 4 giờ điều trị (Hình 3E). Các xét nghiệm apoptosis được thực hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy để phát hiện các tế bào nhuộm màu Phụ lục V-FITC- và PI. Annexin V có ái lực cao với phosphatidylserine (PS) và được sử dụng để xác định các tế bào chết theo chương trình có PS tiếp xúc [33]. Theo kết quả nhuộm màu, các tế bào có thể được phân loại là bình thường (AV−/PI−), chết theo chương trình sớm (AV+/PI−), chết theo chương trình muộn (AV+/PI+) và hoại tử (AV−/PI+), và được thể hiện trong sơ đồ tứ giác (Hình 3F). Các tế bào ở giai đoạn apoptotic sớm giữ lại màng nguyên vẹn, khác với các tế bào ở giai đoạn apoptotic muộn với màng tan rã [34]. Kết quả cho thấy tỷ lệ apoptosis của tế bào 2L3 (bao gồm apoptosis AV+/PI− sớm và apoptosis AV+/PI+ muộn) tăng đáng kể so với nhóm đối chứng sau 12 giờ điều trị bằng mNGAL (1200 µg/mL; Hình 3F, G ).
hình 1. So sánh biểu thức NGAL giữa loại hoang dã M-1 và các ô ADPKD 2L3. (A) Cấu trúc của kiểu hoang dã và các alen L3 của gen Pkd1. Kiểu gen PCR được tiến hành bằng cách sử dụng các đoạn mồi trước và sau loxP đầu tiên trong intron 30 của Pkd1. Hình tam giác đầy: loxP; một gen kháng neomycin được điều khiển bởi chất xúc tác mc1 (mc1-neo) nằm cạnh hai vị trí loxP đã được chèn vào intron 34 của Pkd1.(B) kiểu gen PCR của bản phiên mã Pkd1 của tế bào M-1 (473 bp) và tế bào 2L3 (507 bp). Bản phiên mã Pkd1 của chuột hoang dã (+/+), dị hợp tử (L3/+) và chuột đồng hợp tử (L3/L3) được sử dụng làm đối chứng. RT–qPCR cho thấy 2L3 có các tế bào Pkd1 (C) M-1 thấp hơn đáng kể và 2L3 có hình thái tương tự. Thanh tỷ lệ: 100 µm. (D) Các tế bào M-1 và 2L3 được nhuộm bằng Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL, được dán nhãn Fluorescein, màu xanh lá cây) và Dolichos biflorus agglutinin (DBA, được dán nhãn Rhoda Mine, màu đỏ) và DAPI (màu xanh) và được quan sát bởi một kính hiển vi đồng tiêu. Thanh tỷ lệ: 50 µm. RT–qPCR cho thấy 2L3 có mức biểu hiện Pkd1 (E) và Lcn2 (NGAL) (F) thấp hơn đáng kể so với các tế bào loại hoang dã M-1. (G) Không có sự khác biệt đáng kể về mức biểu thức Slc22a17 (NGAL-R) giữa các ô M-1 và 2L3. RQ: định lượng tương đối=2 −ΔΔCt; Gapdh được sử dụng làm kiểm soát nội bộ của từng mẫu. Các giá trị đã được chuẩn hóa thành M-1. (H) Kết quả Western blot cho thấy 2L3
(AV−/PI−) được hiển thị ở góc phần tư phía dưới bên phải (Q1). Các sự kiện apoptosis sớm (AV +/PI−) được hiển thị ở góc phần tư phía dưới bên phải (Q2). Các sự kiện apoptosis muộn (AV+/PI+) được hiển thị ở góc phần tư phía dưới bên phải (Q3). Các hiện tượng hoại tử (AV−/PI+) được hiển thị ở góc phần tư phía dưới bên phải (Q4). M-1 và M2 trong biểu đồ lần lượt biểu thị các tế bào không trải qua quá trình apoptosis (AV−) và các tế bào trải qua quá trình apoptosis (AV+). (G) Định lượng sơ đồ bậc hai và biểu đồ tương ứng là 4 và 12 giờ. (H) Kết quả Western blot cho thấy điều trị mNGAL trong 24 giờ làm tăng dấu hiệu apoptosis trong các tế bào 2L3. Vinculin được sử dụng làm chất kiểm soát nội bộ. Các giá trị đã được chuẩn hóa cho nhóm kiểm soát. ANOVA một chiều hoặc bài kiểm tra t của Học sinh đã được thực hiện để xác định tầm quan trọng giữa các nhóm (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 so với nhóm kiểm soát của từng nhóm.
Ngoài ra, các dấu hiệu của apoptosis, các dạng caspase-3 bị phân cắt và poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), được phân tích bằng phương pháp Western blot. Caspase-3 được phân tách thành dạng hoạt động (các đoạn 17- và 19-kD) thông qua hai con đường chính của quá trình apoptosis, bên ngoài và bên trong [35]. Caspase bị cắt-3 sẽ tuần tự cắt PARP (các đoạn 89 và 24 kD), một enzyme hạt nhân liên quan đến sửa chữa DNA, để làm bất hoạt PARP và tiếp tục gây ra apoptosis [35,36]. Kết quả Western blot (Hình 3H) phù hợp với dữ liệu tế bào học dòng chảy (Hình 3F, G). Việc xử lý các tế bào 2L3 bằng mNGAL trong 24 giờ tạo ra tỷ lệ phân cắt/pro-caspase-3 và phân cắt/pro-PARP (Hình 3H).
Người ta đã chứng minh rằng các con đường Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] và AKT/mTOR [37,38] được điều hòa trong các tế bào ADPKD, dẫn đến tăng sinh tế bào và mở rộng nang. Các đường dẫn tín hiệu MEK/ERK và PI3K/AKT dẫn đến tăng quá trình phosphoryl hóa protein liên kết với yếu tố phản ứng cAMP (CREB, S133) [39,40], một yếu tố phiên mã nhắm vào các gen liên quan đến sự sống và tăng sinh tế bào [41]. Để nghiên cứu cơ chế mà mNGAL ức chế sự tăng sinh tế bào, phương pháp làm mờ phương Tây đã được thực hiện để phân tích tác động của mNGAL lên các đường truyền tín hiệu ERK và AKT trong các tế bào 2L3 (Hình 4). Kết quả Western blot cho thấy rằng việc xử lý mNGAL (1200 µg/mL) đối với các tế bào 2L3 trong 24 giờ làm giảm đáng kể tỷ lệ p-ERK (T202/Y204)/ERK (Hình 4A), p-AKT (S473)/AKT (Hình 4B) và p-CREB (S133)/CREB (Hình 4C). Những kết quả này (Hình 3 và 4) cho thấy mNGAL có thể làm giảm khả năng sống sót của tế bào 2L3 bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra apoptosis. Người ta đã chứng minh rằng rối loạn chức năng tự thực xảy ra ở mô hình chuột và cá ngựa vằn ADPKD, trong khi điều trị bằng các chất kích hoạt quá trình tự thực, chẳng hạn như rapamycin và carbamazepine có thể làm giảm đáng kể sự hình thành u nang [12]. Để nghiên cứu tác động của mNGAL đối với quá trình tự thực bào ở các tế bào 2L3, hai dấu hiệu tự thực bào nổi tiếng, các protein liên quan đến vi ống 1A/1B chuỗi nhẹ 3 (LC3B) và p62, đã được phân tích bằng phương pháp làm mờ phương Tây (Hình 5). Lượng LC3B II có tương quan với sự hình thành autophagosome và thường được sử dụng làm dấu hiệu của bệnh autophagy [42]. Protein p62 liên kết trực tiếp các chất nền được gắn thẻ ubiquitin và LC3B II và cuối cùng bị phân hủy, do đó sự phân hủy của p62 là một dấu hiệu tự thực được sử dụng rộng rãi [43]. Theo kết quả Western blot, việc xử lý mNGAL đối với các tế bào 2L3 trong 24 giờ đã làm tăng đáng kể tỷ lệ LC3B II/LC3B I (Hình 5A) và giảm mức p62 (Hình 5B) so với nhóm đối chứng. Phát hiện này cho thấy mNGAL đã kích hoạt quá trình tự thực bào trong các tế bào 2L3.
Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950
Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật
https://www.xjcistanche.com/cistanche-cửa hàng
NHẤP VÀO ĐÂY ĐỂ NHẬN CHIẾT XUẤT CISTANCHE HỮU CƠ TỰ NHIÊN VỚI 25% ECHINACOSIDE VÀ 9% ACTEOSIDE CHO CHỨC NĂNG THẬN
