Sidt2 là một protein quan trọng trong con đường thoái hóa autophagy-lysosomal và rất cần thiết cho việc duy trì cấu trúc và chức năng lọc của thận Ⅱ
Nov 07, 2023
CUỘC THẢO LUẬN
Một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LMP có liên quan đến chức năng thận hoặc cân bằng nội môi cấu trúc [21–25]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy LMP Sidt2 ảnh hưởng đến đường truyền tín hiệu viêm và gây tổn thương cho các tế bào trung mô cầu thận của chuột [28]. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi đã nghiên cứu những ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của thận chuột do LMP Sidt2 gây ra. Người ta phát hiện ra rằng việc xóa Sidt2 dẫn đến sự hợp nhất của các quá trình chân thận chuột, làm dày màng đáy, phù tế bào biểu mô ống thận, tổn thương vi nhung mao và tăng protein niệu sau 24 giờ, cho thấy mất Sidt2 dẫn đến suy giảm chức năng lọc và cấu trúc của thận chuột, nhưng cơ chế chi tiết của nó vẫn chưa rõ ràng.
Bởi vì LMP là đơn vị chức năng quan trọng của lysosome [17] vàrối loạn chức năng lysosomelà một trong những yếu tố gây bệnh phổ biến của nhiều bệnh thận mãn tính (CDK) (ref. [4, 29]), chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu liên quan về lysosome sau khi xóa Sidt2 và thấy rằng số lượng lysosome có tính axit giảm và độ pH của lysosome tăng lên trong ống nghiệm. Tuy nhiên, không có sự thay đổi rõ ràng về số lượng lysosome chính liên kết với autophagosome và tổng số lysosome bằng phân tích kính hiển vi điện tử. Cathepsin đại diện cho nhóm enzyme phân giải protein lớn nhất trong lysosome [30], trong đó CTSB là một trong những protease lysosomal phong phú nhất [31].
Vì cathepsin cần được axit hóa để trưởng thành (kích hoạt), sự thay đổi độ pH cuối cùng sẽ dẫn đến giảm đáng kể sự thoái hóa protein [32]. Mức độ in vivo và in vitro cho thấy hoạt động và hàm lượng hydrolase axit lysosomal giảm, xác nhận thêm rằng Sidt2 ức chế chức năng lysosomal bằng cách ảnh hưởng đến sự trưởng thành của protease trong lysosome.
CLICK VÀO ĐÂY ĐỂ XEM CÔNG THỨC THẢO DƯỢC CISTANCHE CHO THẬN
Trong khi đó, lysosome hoạt động như một trung tâm tái chế để phân hủy các chất chuyển hóa và chất thải của tế bào khi kết thúc quá trình tự thực [1]. Chức năng thoái hóa lysosomal bình thường là cần thiết cho quá trình tự thực, duy trì cân bằng nội môi tế bào và cho phép tế bào tồn tại ở trạng thái sinh lý [33–36]. Sự xuất hiện và phát triển của nhiều bệnh thận đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh tự thực bất thường [37–39]. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng Sidt2 là chất vận chuyển DNA/RNA lysosomal. Các loại autophagy độc đáo thông qua RNautophagy và DNautophagy (RDA) rất quan trọng đối với sự thoái hóa RNA/DNA có chọn lọc [40]. Trước đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng việc xóa Sidt2 làm hỏng sự hợp nhất của autophagosome và lysosome, khiến ty thể bị tổn thương không thể bị thoái hóa, dẫn đến tổn thương cấu trúc và chức năng của cơ xương [41]. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khám phá bệnh tự thực khi tổn thương thận do xóa Sidt2. Chúng tôi quan sát thấy các autophagolysosome được tích lũy trong thận của chuột Sidt2-/- qua kính hiển vi điện tử. Autophagy là một quá trình năng động, bao gồm sự hình thành các autophagosome cũng như sự hình thành và thoái hóa của autophagolysosome. Sự hình thành các autophagosome sớm được kiểm soát bởi gen Atg và sự hình thành LC{11}}II là dấu hiệu của sự hình thành autophagosome [42]. Chúng tôi nhận thấy rằng biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình tự thực là Atg và LC{14}}II đều tăng sau khi xóa Sidt2, cho thấy rằng hoạt động tự thực có thể được tăng cường. Tuy nhiên, sự tích tụ LC{16}}II cũng có thể là do sự tắc nghẽn của con đường autophagolysosomes ở cuối quá trình autophagy
Để tìm hiểu thêm về tác dụng của Sidt2 đối với trạng thái tự thực ở thận, người ta đã đo lường sự biểu hiện và hình thành protein hàng hóa P62, đồng thời nghiên cứu tác dụng của các loại thuốc nhắm vào bệnh tự thực (CQ và RAPA). P62 cần được kết hợp với LC3B và sau đó bị phân hủy trong lysosome. Sự gia tăng mức độ protein P62 thường thể hiện sự tắc nghẽn của dòng autophagy [43]. Để loại trừ nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng sản xuất P62, chúng tôi đã đo mức mRNA của P62 và nhận thấy rằng việc sản xuất P62 đã giảm, do đó sự tích lũy LC3-II có thể là do sự thoái hóa bị cản trở. Để khám phá sâu hơn về quá trình tự thực bào, chúng tôi đã tiến hành một thí nghiệm lật chloroquine. Chloroquine có thể vô hiệu hóa môi trường axit của lysosome, sau đó phá hủy chức năng của lysosome và ức chế quá trình tự thực bào [44]. Sự gia tăng protein LC{11}}II trước và sau khi điều trị bằng CQ phản ánh số lượng autophagosome bị phân hủy bởi lysosome, có thể phản ánh hoạt động của quá trình autophagy. Thử nghiệm lật CQ tương tự cũng có thể được sử dụng để xác định mức độ phân hủy P62 thông qua con đường autophagolysosome. Phù hợp với kết quả của chúng tôi, việc xóa Sidt2 đã dẫn đến giảm lưu lượng tự thực do sự kết thúc của quá trình tự thực bị chặn. Đồng thời, trong thí nghiệm RAPA, mức protein LC{14}}II và P62 đã tăng đáng kể trong nhóm Sidt2−/−, điều này có thể hỗ trợ thêm rằng việc thiếu Sidt2 làm suy yếu giai đoạn cuối của quá trình tự thực.
Giai đoạn cuối của quá trình autophagy bao gồm sự hình thành và suy thoái của autophagolysosome. Chúng tôi đã sử dụng các thí nghiệm đồng địa hóa miễn dịch huỳnh quang LAMP1 và LC3B để phát hiện sự kết hợp giữa autophagosome và lysosome [45, 46], và kết quả cho thấy rằng sự kết hợp giữa autophagosome và lysosome đã bị chặn sau khi xóa Sidt2. Thí nghiệm dán nhãn kép Ad-mCherry-GFP-LC3B phát hiện sự hình thành và suy thoái của autophagolysosome [27]. Nó xác nhận thêm rằng sự tắc nghẽn của sự hình thành và thoái hóa của autophagolysosome là nguyên nhân chính gây ra tổn thương cấu trúc và chức năng thận sau khi xóa Sidt2.
Từ kết quả trên, chúng ta có thể kết luận rằng sự vắng mặt của Sidt2 làm giảm số lượng lysosome có tính axit và rối loạn chức năng axit hóa của lysosome ảnh hưởng đến sự trưởng thành của các enzyme thủy phân. Đây có thể là nguyên nhân quan trọng nhất gây ra thiệt hại cho con đường thoái hóa autophagy-lysosome bên cạnh các rối loạn phản ứng tổng hợp autophagosome và lysosome. Trong khi đó, quá trình autophagy bị suy yếu có thể liên quan chặt chẽ đến cấu trúc thận và chức năng lọc bị tổn thương sau khi xóa Sidt2 (Hình 8). Nghiên cứu của chúng tôi chỉ đề cập đến một phần tác động của Sidt2 lên cấu trúc và chức năng của thận, nhưng điều thú vị là sự tích tụ các protein tự thực quan trọng và sự suy giảm cấu trúc và chức năng của thận do xóa Sidt2 tương tự như những thay đổi trong các protein tự thực chính và protein niệu tăng đáng kể ở bệnh thận đái tháo đường [37, 47]. Việc sửa chữa chức năng lysosome có thể là một chiến lược mới tiềm năng để điều trị bệnh thận đái tháo đường [37]. Chúng tôi hy vọng rằng Sidt2 sẽ cung cấp một cách để khám phá cơ chế bệnh sinh và cách điều trị các bệnh về thận trong tương lai.
Xét nghiệm protein nước tiểu ở chuột Những con chuột WT 12-tuần tuổi được chọn ngẫu nhiên và chuột đực Sidt2−/− được đặt vào các lồng trao đổi chất và nhịn ăn nhưng được cung cấp nước. Mẫu nước tiểu trong 24 giờ đã được thu thập và sau đó được kiểm tra protein trong nước tiểu (Viện kỹ thuật sinh học Jian Jian Nam Kinh, CHN, C035-2-1) (vui lòng tham khảo Tài liệu bổ sung để biết các phương pháp chi tiết). Tế bào tế bào tế bào cầu thận chuột MPC5 được mua từ Bộ sưu tập văn hóa BeNa và nuôi cấy với 10% FBS (Excell Bio, Nam Mỹ, FSP500) và DMEM glucose thấp (Sigma-Aldrich, 6046). Tế bào trung mô cầu thận chuột SV40 MES 13 được mua từ ngân hàng tế bào ủy ban bảo tồn văn hóa điển hình của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc và nuôi cấy với 10% FBS (Excell Bio, Nam Mỹ, FSP500) và DMEM glucose cao (Sigma-Aldrich, 6429) . Nồng độ CO2 của hộp nuôi cấy tế bào được duy trì ở mức 5% và nhiệt độ được duy trì ở mức 37 độ. Chloroquine (CQ) và rapamycin (RAPA) được mua từ Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ và 25 mg/mL rapamycin đều được hòa tan trong nước siêu tinh khiết. CQ đã được thêm vào đĩa petri sao cho nồng độ cuối cùng là 50 μM và được ủ trong 16 giờ như một chất ức chế quá trình tự thực. Rapamycin đã được thêm vào đĩa petri ở nồng độ cuối cùng là 15 μM và được ủ trong 2 giờ dưới dạng chất kích hoạt autophagy. Hệ thống vectơ lentachus chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để loại bỏ các plasmid Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) của gen Sidt2 đã được mua và công cụ thiết kế trực tuyến sgRNA (//crispr.mit.edu/) đã được sử dụng để thiết kế sgRNA nhắm mục tiêu Sidt2.
Trình tự mồi như sau: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, được tổng hợp bởi công ty công nghệ sinh học (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Bằng cách sử dụng hệ thống lentachus CRISPR/Cas9, plasmid Lenticrispr-v2 đã được tuyến tính hóa và liên kết với song công sgRNA đã ủ để tạo ra plasmid tái tổ hợp Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2. Thuốc thử chuyển nhiễm Vigofect (Công nghệ sinh học mạnh mẽ, Bắc Kinh, CHN) đã được sử dụng để truyền plasmid Lenticrispr-v2 và plasmid tái tổ hợp Lenticrispr-v2-Sidt2 để tạo ra lentillin. Lentachus thu được được chuyển vào các tế bào MPC5 và tế bào SV40 MES 13. Sau 48 giờ, tế bào được ủ với purinomycin trong 72 giờ để chọn lọc. Các tế bào sống sót là nhóm Sidt{22}}/+ và nhóm Sidt2−/− đã được chuyển gen thành công. Phân lập RNA và xét nghiệm PCR thời gian thực Trizol (Invitrogen) đã được sử dụng để tách RNA từ tế bào thận chuột và phương pháp RT-PCR cụ thể đã được mô tả trước đây [21]. Trình tự mồi của RT-PCR như sau: Actin (giác: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62(giác quan: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(giác quan: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'-GGATGCAGTCTGTG TAGAGCACA{ {48}}′). Western blot Phương pháp cụ thể được đề cập trước đây [28]. Trong nghiên cứu này, các kháng thể chính bao gồm kháng thể kháng LC3B của thỏ (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), kháng thể kháng P62 của thỏ (1:1000; Abcam ab205719), kháng thể kháng chuột- -Actin (1:1000; Sigma Aldrich) A5316), thỏ chống Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), thỏ chống Atg5 (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào 9980S), thỏ chống Atg7 (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào 8558S) , chất chống Atg12 của thỏ (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào 2011S), chất chống chuột LAMP1 (1:1000; Công nghệ sinh học Santa Cruz H4A3), chất chống cathepsin B của thỏ (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Các tế bào được cấy vào đĩa Petri đáy kính Nunc. Sau khi tăng đến mật độ phù hợp, Ad-mCherry-GFP-LC3B đã được thêm vào (thời gian Beyo, Thượng Hải, CHN, C{104}} mL), tạo ra nồng độ cuối cùng là 10 −11 vp/mL. Sau khi kích thích trong 48 giờ, số lượng điểm huỳnh quang mCherry và GFP được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi đồng tiêu laser (Leica SP8, Đức). Miễn dịch huỳnh quang Các tế bào được cấy vào đĩa Petri có đáy thủy tinh và cố định bằng paraformaldehyde. Sau khi ngăn chặn, các tế bào được ủ qua đêm với kháng thể sơ cấp, sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp trong 90 phút trong bóng tối. Các tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laser (Leica SP8, Đức) sau khi nhuộm hạt nhân bằng DAPI (1 ug/mL). Kháng thể chính bao gồm P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Công nghệ sinh học Santa Cruz H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); kháng thể thứ cấp bao gồm kháng thể thứ cấp chống chuột IgG (H + L) kháng chuột thứ cấp kháng Cy3-dê Affinipure liên hợp (1:200; Proteintech SA00009-1), dê Affinipure liên hợp CoraLite488- kháng chuột IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- liên hợp IgG kháng thỏ Affinipure dê (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Đối với LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), chúng tôi cũng cấy tế bào trên đĩa Petri đáy kính. Sau khi phát triển đến mật độ thích hợp, dịch nuôi cấy tế bào chứa nồng độ cuối cùng của LysoTracker là 75 nM được thêm vào các tế bào, chúng được chụp ảnh sau 45 m kích thích. Sử dụng ImageJ để đếm số lượng điểm huỳnh quang và hệ số tương quan Pearson. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Từ mỗi nhóm, chuột đực Sidt2−/− và WT 3 tuần tuổi được chọn ngẫu nhiên để chuẩn bị các mẫu kính hiển vi điện tử của mô thận và phương pháp cụ thể như được mô tả trước đó [48] , chụp ngẫu nhiên các phần bằng kính hiển vi điện tử, có hơn 10 ảnh chụp từ các phần thận của mỗi con chuột, chọn ngẫu nhiên 3–5 ảnh có độ phóng đại 8000× từ ảnh kính hiển vi điện tử của từng con chuột, tính toán số lượng autophagolysosome trong hình và so sánh nhóm Sidt2−/− với nhóm WT. Về việc chuẩn bị các mẫu kính hiển vi điện tử tế bào, cạo ít nhất 105 tế bào bằng dụng cụ cạo tế bào và thu chúng vào ống EP, sau đó ly tâm với tốc độ 800 vòng/phút trong 5 m, loại bỏ phần nổi phía trên và đổ đầy chất cố định kính hiển vi điện tử. Sau khi bảo quản trong tủ lạnh 4 độ trong hơn 1 giờ, có thể đưa đi kiểm tra. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử được chụp bởi KingMed Diagnostics (Quảng Châu, Trung Quốc). LysoSensor Các tế bào được cấy vào đĩa giếng 96-. Sau khi phát triển đến mật độ thích hợp, môi trường được làm nóng trước (37 độ ) chứa 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545) đã được thêm vào. Các tế bào được ủ trong 5 phút ở 37 độ, sau đó môi trường được loại bỏ và thay thế sau khi rửa tế bào ba lần bằng PBS. Chế độ WellScan được sử dụng để đọc đĩa trong BioTek Cites 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). Huỳnh quang được đo bằng bước sóng kích thích/phát xạ Ex360nm/Em450nm và Ex380nm/Em540nm, đồng thời độ pH lysosome được xác định từ tỷ lệ Em540 so với Em450. Phân tích thống kê Các kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM. So sánh thống kê giữa hai nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng các bài kiểm tra t không ghép đôi. Khi phần mềm Graphics 8.0 được sử dụng để phân tích thống kê, P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Mỗi nhóm thí nghiệm trong nghiên cứu này được lặp lại ít nhất ba lần một cách độc lập. SẴN SÀNG DỮ LIỆU Các bộ dữ liệu được tạo và/hoặc phân tích trong nghiên cứu hiện tại có sẵn từ tác giả tương ứng theo yêu cầu hợp lý.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Tín hiệu từ lysosome: một trung tâm kiểm soát quá trình thanh thải tế bào và chuyển hóa năng lượng. Biol tế bào Nat Rev Mol. 2013;14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosome: Trung tâm truyền tín hiệu trao đổi chất. Giao thông. 2019;20:27–38.
3. Ballabio A. Lysosome tuyệt vời. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, và những người khác. Rối loạn chức năng lysosomal do chế độ ăn nhiều chất béo và dòng chảy tự thực bị suy yếu góp phần gây nhiễm độc lipid ở thận. J Am Sóc Nephrol. 2017;28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, và những người khác. Tổn thương ống thận và tái tạo ở thận chuột sau khi tiếp xúc cấp tính với gentamicin: một nghiên cứu theo thời gian. Ren Thất bại. 1992;14:507–21.
Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950
Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
