SLC37A2, Một phân tử liên quan đến phốt pho tăng lên trong các tế bào cơ trơn trong Aorma bị vôi hóa
Feb 04, 2024
Vôi hóa mạch máulà nguồn chính củabệnh tim mạchở bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính.Tăng phosphat máudẫn đến tăng lượng phốt pho đi vào nội bào, dẫn đến sự gia tăng các tế bào giống nguyên bào xương trong tế bào cơ trơn mạch máu. PiT-1 vận chuyển phốt phát trong tế bào cơ trơn mạch máu. Tuy nhiên, cơ chế vôi hóa mạch máu vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Nghiên cứu này khảo sát các phân tử có liên quan đến phốt pho ngoài PiT-1. Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng các phân tử liên quan đến phốt pho thuộc vềchất mang chất tan(SLC) sẽ liên quan đến quá trình vôi hóa mạch máu. Theo kết quả phân tích microarray DNA, chúng tôi đã tập trung vào SLC37A2 và cho thấy biểu hiện mRNA của các tế bào này tăng lên trên các tế bào cơ trơn động mạch chủ bị vôi hóa (AoSMC). SLC37A2 đã được báo cáo là vận chuyển cả chất trao đổi glucose{4}}phosphate/phosphate và phosphate/phosphate. Phân tích in vitro cho thấy biểu hiện SLC37A2 không bị ảnh hưởng bởi tình trạng viêm trên AoSMC. Sự biểu hiện của SLC37A2 mRNA và protein tăng lên trong AoSMC bị vôi hóa. In vivo, phân tích cho thấy biểu hiện SLC37A2 mRNA ở động mạch chủ củabệnh thận mãn tínhchuột có mối tương quan với các gen đánh dấu sự tạo xương. Hơn nữa, SLC37A2 được biểu hiện ở vùng vôi hóa mạch máu ởchuột mắc bệnh thận mãn tính. Kết quả chúng tôi đã chỉ ra rằng SLC37A2 là một trong những phân tử tăng theovôi hóa mạch máuin vitro và in vivo.
Từ khóa: SLC37A2,vôi hóa mạch máu, tế bào cơ trơn động mạch chủ,bệnh thận mãn tính, tăng phosphat máu
NHẤP VÀO ĐÂY ĐỂ NHẬN CHIẾT XUẤT CISTANCHE HỮU CƠ TỰ NHIÊN VỚI 25% ECHINACOSIDE VÀ 9% ACTEOSIDE CHO CHỨC NĂNG THẬN
Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950
Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật
https://www.xjcistanche.com/cistanche-cửa hàng
Với số lượng bệnh nhân mắcbệnh thận mãn tính(CKD) tăng lên, số bệnh nhâncần chạy thận nhân tạocũng sẽ tăng lên. Hầu hết tử vong ở bệnh nhân trải quachạy thậnlà dobệnh tim mạchchẳng hạn nhưsuy tim, rối loạn mạch máu nãohoặc nhồi máu cơ tim. (,2) Một nguồn chính củabệnh tim mạchlà vôi hóa ngoài tử cung,() một bất thường gây ra bởi sự hình thành và lắng đọng tinh thể canxi photphat trong các mô mềm. (4 6) Các yếu tố khác nhau như tình trạng viêm. căng thẳng oxy hóa và tăng nồng độ canxi (Ca) và phốt pho (P) trong huyết tương có liên quan đến sự tiến triển của vôi hóa mạch máu. Trong số các yếu tố này, tăng phosphat máu có liên quan chặt chẽ nhất với tình trạng vôi hóa mạch máu. (7.8) Tăng phosphat máu là do hấp thụ quá nhiều P khi chức năng thận giảm. Do đó, bệnh nhân đang chạy thận nhân tạo cần hạn chế ăn P. (79-12) Tuy nhiên, đã có báo cáo rằngvôi hóa mạch máuđang tiến triển khi bắt đầu lọc máu; nó cũng đã được thấy ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mạn giai đoạn đầu khi tình trạng tăng phosphat máu không rõ ràng. (3) Do đó, điều quan trọng là ngăn ngừa vôi hóa mạch máu ở bệnh nhân CKD giai đoạn đầu để cải thiện tiên lượng cuộc sống.
dẫn đến tăng dòng P vào tế bào cơ trơn mạch máu (VSMC). Dòng P được thực hiện thông qua PiT-1, chất vận chuyển trên bề mặt màng tế bào của VSMC. PiT- là thành viên của siêu họ chất mang chất tan (SLC), bao gồm chất vận chuyển natri photphat được mã hóa bởi SLC20A1.04 PiT- vận chuyển photphat qua màng tế bào phụ thuộc Na và sau đó là khoáng hóa ma trận do nồng độ p tăng cao.s) Là nội bào Nồng độ P tăng lên, VSMC bắt đầu biểu hiện các yếu tố phiên mã tạo xương, chẳng hạn như yếu tố phiên mã liên quan đến còi xương 2(Runx2)(16) Hiệu ứng này kéo theo sự gia tăng biểu hiện của các gen đặc hiệu tạo xương, chẳng hạn như Osteopontin và Osteocalcin. Ngoài ra, còn làm giảm sự biểu hiện của các protein đặc hiệu ở cơ trơn. chẳng hạn như protein cơ trơn 22-0 (SM22-0), xảy ra. Kết quả là VSMC được biến đổi thành các tế bào giống nguyên bào xương. (1718) Các nghiên cứu lâm sàng gần đây đã chỉ ra rằng nồng độ canxi trong máu. các hạt protein (CPP), đại diện cho các hạt keo canxi photphat, tăng lên khi chức năng thận giảm. (19-21)Hơn nữa, mối tương quan với nồng độ CPP và P trong máu đã được báo cáo.2o2i) Có thể CpP có thể kích hoạt sự tiến triển của vôi hóa mạch máu.22-24)
Tuy nhiên, vôi hóa mạch máu đã được quan sát thấy ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mạn giai đoạn đầu với nồng độ P huyết tương bình thường. (13) Ngoài ra.PiT-1 mRNA được biểu hiện ở khắp nơi trong tất cả các mô. Do đó, một phân tử khác có thể hoạt động chủ yếu ở vùng vôi hóa mạch máu. Có những báo cáo cho rằngviêmthúc đẩy quá trình vôi hóa mạch máu. Các yếu tố viêm như interleukin (IL)-1B, IL-6 và yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-a) gây ra sự biệt hóa củaVSMC thành các tế bào giống nguyên bào xương (2s26) TNF-a gây ra tình trạng vôi hóa mạch máu thông qua con đường cAMP, đóng vai trò trong quá trình biệt hóa nguyên bào xương.2728) IL-6 điều chỉnh các con đường khác nhau dẫn đến vôi hóa mạch máu của VSMC2-31) Hơn nữa. IllB, IL{11}} và TNF-a cũng là những yếu tố liên quan đến tình trạng tăng vôi hóa mạch máu do nồng độ p cao gây ra.3233) Tuy nhiên. dữ liệu hiện tại không giải thích đầy đủ cơ chế của mạch máu
vôi hóa do các yếu tố này gây ra. Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng có thể có các phân tử liên quan đến P khác, chẳng hạn như các phân tử thuộc siêu họ SLC, có liên quan đến quá trình vôi hóa mạch máu. Chúng tôi tập trung vào các protein màng trong siêu họ SLC và nghiên cứu các phân tử tiềm năng liên quan đến P ngoài PiT-1 về sự liên quan đến quá trình vôi hóa mạch máu. Hơn nữa, chúng tôi đã kiểm tra mối quan hệ giữa các phân tử ứng cử viên và tình trạng vôi hóa mạch máu trong video và in vivo.
Nguyên liệu và phương pháp
Nuôi cấy tế bào. Tế bào cơ trơn động mạch người bình thường (AoSMC) được lấy từ Lonza (Basel, Thụy Sĩ) AoSMC được nuôi cấy theo hướng dẫn của nhà sản xuất. AoSMC được duy trì trong môi trường tăng trưởng (môi trường cơ bản của tế bào cơ trơn được bổ sung 5% huyết thanh bò bào thai (FBS), yếu tố tăng trưởng biểu bì, insulin, yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-B và gentamicin/amphotericin-B). Phương tiện truyền thông đã được thay đổi mỗi ngày. AoSMC được nuôi trong tủ ấm 5% CO được làm ẩm ở 37 độ và duy trì cho đến khi đạt đến mức hợp lưu và sau đó được sử dụng trong các thí nghiệm.
AoSMC bị vôi hóa. Quá trình vôi hóa của AoSMC được tạo ra như mô tả trước đây.435) AOSMC được nuôi cấy trong môi trường Eagle's modified Dulbecco bổ sung 15% FBS và penicillin-streptomycin và nuôi cấy với 2,6 mM P trong 3, 6, 9, 12 và 14 ngày. Nồng độ P được điều chỉnh bằng đệm PNaH, PO/Na và HPO. pH 7,2). Các AoSMC khác không được nuôi cấy với 2,6 mM P.
DNA vi mô. Tổng số RNA của các mẫu AoSMC được nuôi cấy và không nuôi cấy với 2,6 mM P đã được sử dụng. Tổng RNA 5.0 ug được phân tích bằng microarray DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray được sử dụng để kiểm tra khoảng 26,000 gen. Tỷ lệ được tính bằng cách chia mức biểu hiện của AoSMC nuôi cấy với 2,6 mM trong 12 ngày cho mức biểu hiện của AoSMC không nuôi cấy với 2,6 mM P
vi mảng DNA
Tổng số RNA của các mẫu AoSMC được nuôi cấy và không nuôi cấy với 2,6 mM P đã được sử dụng. Tổng RNA 5.0 ug được phân tích bằng microarray DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray được sử dụng để kiểm tra khoảng 26,000 gen. Tỷ lệ được tính bằng cách chia mức biểu hiện trên AoSMC nuôi cấy 2,6 mM trong 12 ngày cho mức biểu hiện trên AoSMC không nuôi cấy với 2,6 mM P.Biểu hiện của SLC37A2 trong tình trạng viêm mạch máu. Để tạo ra phản ứng viêm trong AoSMC, các tế bào được nuôi cấy với môi trường tăng trưởng cho đến khi chúng đạt đến trạng thái hợp lưu và sau đó được xử lý bằng 1 ugmL lipopolysacarit (LPS) (LPS từ escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) trong 24 và 72 mà không cần 2,6 mM P. AoSMC khác không được nuôi cấy bằng phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực. Tổng RNA được chiết xuất từ AoSMC được xử lý bằng LPS trong 24 và 72 giờ và các tế bào không được xử lý bằng LPS. PCR định lượng thời gian thực dựa trên màu xanh lá cây SYBR được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA tổng hợp và bộ mồi thích hợp cho từng gen mục tiêu bằng hệ thống PCR thời gian thực aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Trình tự mồi như sau: IL của con người-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' và 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; con người SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' và 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- và 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3. Mức biểu hiện IL-6 và SLC37A2 mRNA đã được tính toán sau khi chuẩn hóa bằng GAPDH. Biểu hiện của SLC37A2 trong quá trình vôi hóa AoSMC. Tổng số được chiết xuất từ AoSMC không nuôi cấy với các tế bào 2,6 mM P và AoSMC được nuôi cấy với 2,6 mM P trong 3, 6, 9, 12 và 14 ngày. PCR thời gian thực được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA tổng hợp. Trình tự mồi như sau sau: human Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' và 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Mức biểu thức mRNA Runx2 và SLC37A2 đã được tính toán sau khi chuẩn hóa bằng APPH.
Phân tích Western blot.
Tổng protein được thu thập từ các mẫu AoSMC được nuôi cấy trong cùng điều kiện được sử dụng để phân tích PCR thời gian thực. Các mẫu này được ly giải bằng dung dịch muối Tris-buffered (pH 75) bổ sung 5% NP-40 và hỗn hợp cocktail ức chế protease 1%. Các mẫu nồng độ protein được đo bằng Bộ xét nghiệm protein BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). và nồng độ được điều chỉnh bằng phương pháp làm mờ phương Tây, 10 gam protein được tách ra trong gel polyacrylamide 10% bằng phương pháp điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide. Màng này được xử lý bằng kháng thể SLC37A2 (Novus Biology, Centennial, CO) hoặc kháng thể GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) làm kháng thể chính, được ủ bằng kháng thể kết hợp với Rabbit lgG Horseradish peroxidase (R&D Systems, Minneapolis, MN) làm kháng thể thứ cấp và hiển thị bằng Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anh) và máy phân tích hình ảnh phát quang (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Nhật Bản). Ban nhạc được định lượng bằng lmagel.
Thực nghiệm
Tất cả các đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của Đại học Hyogo, Trường Khoa học Con người và Môi trường. Chuột đực Sprague-Dawley 12 tuần tuổi được mua từ SLC Nhật Bản (Shizuoka, Nhật Bản). Chuột được duy trì trong chu kỳ 12-sáng, 12-h tối (09:00-21:00) và được phép tiếp cận miễn phí thức ăn và nước siêu tinh khiết.
Chế độ ăn thử nghiệm bao gồm chế độ ăn P đối chứng (1.0% P, 0.6Ca, 20% protein), chế độ ăn adenine (0.75% adenine , 1.0% P, 0.6%Ca, 2,5% protein), chế độ ăn ít P (LP) (0.2% P,0 0,6% Ca, 10%protein) và chế độ ăn giàu P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% protein) dựa trên chế độ ăn AIN{25}}G (Phương Đông Nấm men, Tokyo, Nhật Bản) với casein là nguồn protein.3637) Chế độ ăn ít protein đã được báo cáo là thúc đẩy quá trình vôi hóa mạch máu ở chuột bị suy thận do adenine, do đó việc hạn chế protein đã được thực hiện.3738) Trước khi phân nhóm, tất cả chuột (n=23) được cho ăn theo chế độ ăn MF tiêu chuẩn (Men phương Đông) trong một tuần để thích nghi. Khi được 13 tuần tuổi, chuột được chia thành 2 nhóm: nhóm đối chứng (n=5) và nhóm CKD do adenine gây ra (n=18). Nhóm đối chứng nhận được chế độ ăn P đối chứng trong 6 tuần . Nhóm CKD do adenine gây ra đã nhận được chế độ ăn adenine trong khoảng 3 tuần và sau đó được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm CKD-LP (n=8) hoặc nhóm CKDHP (n=10). Chuột thuộc nhóm CKD-LP và nhóm CKD-HP lần lượt nhận được chế độ ăn LP và chế độ ăn HP trong 3 tuần, trong thời gian thử nghiệm, lượng thức ăn được ghi lại hàng ngày. Trong chế độ ăn kiêng adenine, các mẫu máu được thu thập từ tĩnh mạch đuôi trong khoảng thời gian từ 10:00 sáng đến 11:00 sáng mỗi tuần một lần cho đến tuần thứ hai và sau đó cứ 2 ngày một lần để theo dõi nồng độ trong huyết tương. Trong chế độ ăn kiêng LP hoặc chế độ ăn kiêng HP, mẫu máu được thu thập mỗi tuần một lần. Các mẫu nước tiểu được thu thập và lượng nước tiểu được ghi lại mỗi tuần một lần. Chuột đã bị hy sinh bằng thuốc gây mê bằng cách sử dụng isoflurane (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Nhật Bản) và phẫu thuật nội soi. Các mẫu máu lấy từ tĩnh mạch chủ dưới và động mạch chủ ngực bụng được thu thập để phân tích.
Biểu hiện SLC37A2 trên động mạch chủ.
Khoảng một phần ba số động mạch chủ ngực được thu thập đã được sử dụng để hình dung tình trạng vôi hóa và tiến hành nhuộm miễn dịch. Động mạch chủ được nhúng trong parafin và 4-phần um đã bị cắt. Các phần được nhuộm màu bằng Phương pháp Von Kossa cho Bộ canxi (Polysciences. Warrington, PA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. phân tích miễn dịch đã được thực hiện với các phần nối tiếp. Các phần được ủ bằng kháng thể SLC37A2 qua đêm ở 4 độ và sau đó được xử lý bằng Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Bioscatics, Tokyo, Nhật Bản) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các phần được xử lý bằng bộ DABsubstrate (Nichirei).
Tổng RNA được chiết xuất từ phần còn lại của động mạch chủ ngực đông lạnh. PCR thời gian thực được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA tổng hợp. Trình tự mồi như sau: rat Osteo-pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' và 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' và; chuột SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' và 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Mức biểu hiện mRNA của Osteopontin và SLC37A2 mRNA đã được tính toán sau khi chuẩn hóa bằng GAPDH
Phân tích thống kê.
Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình + SE. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng cách sử dụng t-test. Trong các thí nghiệm AoSMC bị vôi hóa do phốt phát gây ra, sự khác biệt được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều theo phương pháp của Dunnett. Trong các thí nghiệm mô hình CKD, sự khác biệt được phân tích bằng thử nghiệm K ruskal-Wallis, sau đó là phương pháp Steel-Dwass. Các hệ số tương quan (rs) được xác định bằng cách sử dụng bài kiểm tra xếp hạng hệ số tương quan của Spearman. Đối với tất cả các bài kiểm tra. giá trị p hai đuôi<0.05 were considered statistically significant.
