Giải pháp UW bổ sung Natri Thiosulfate bảo vệ các mô thận chống lại chấn thương do tái tưới máu do thiếu máu cục bộ lạnh kéo dài trong một mô hình Murine về cấy ghép thận đồng bộ

Liên hệ: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang và cộng sự

Cistanche tubulosa ngăn cảnquả thậnbệnh, bấm vào đây để lấysản phẩm và Cistanche Nz

TRỪU TƯỢNG

Giới thiệu:Tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ lạnh (IRI) là một sự kiện không thể tránh khỏi làm tăng các biến chứng sau ghép. Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng việc bổ sung dung dịch của Đại học Wisconsin (UW) với các phân tử hiến tặng hydro sulfua (H2S) không được FDA chấp thuận sẽ giảm thiểu IRI lạnh và cải thiện chức năng ghép thận sau khi cấy ghép. Nghiên cứu hiện tại điều tra xem liệu một phân tử cho H2S được FDA chấp thuận, natri thiosulfate (STS), sẽ có tác dụng tương tự hoặc vượt trội trên mô hình chuột đồng dạng trực khuẩn có liên quan về mặt lâm sàngquả thậncấy ghép.

Phương pháp:Ba mươi con chuột Lewis đã trải qua phẫu thuật cắt thận hai bên, sau đó là cấy ghép trực tiếp khớp bên tráiquả thậnsau 24- giờ bảo quản trong giải pháp UW hoặc UW cộng với STS ở 4 ◦C. Chuột được theo dõi đến ngày thứ 14 sau cấy ghép và được hy sinh để đánh giá chức năng thận (lượng nước tiểu, creatinin huyết thanh và nitơ urê máu).Quả thậncác phần được nhuộm bằng H&E, TUNEL, CD68, và myeloperoxidase (MPO) để phát hiện hoại tử ống thận cấp tính (ATN), apoptosis, thâm nhiễm đại thực bào và thâm nhiễm bạch cầu trung tính.

Kết quả:Ghép UW cộng với STS cho thấy chức năng ghép được cải thiện đáng kể ngay sau khi cấy ghép, với sự cải thiện khả năng sống sót của người nhận so với ghép UW (p <{{0}}. 05).="" kiểm="" tra="" mô="" bệnh="" học="" cho="" thấy="" atn,="" apoptosis,="" đại="" thực="" bào,="" và="" thâm="" nhiễm="" bạch="" cầu="" trung="" tính="" giảm="" đáng="" kể="" và="" điều="" hòa="" giảm="" các="" gen="" tiền="" viêm="" và="" pro-apoptotic="" ở="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" so="" với="" ghép="" uw="" (p=""><>

Sự kết luận:Lần đầu tiên chúng tôi chứng minh rằng việc bảo quản các mảnh ghép thận trong dung dịch UW có bổ sung STS bảo vệ chống lại IRI lạnh kéo dài bằng cách ngăn chặn các con đường viêm và chết, do đó cải thiện chức năng mảnh ghép và kéo dài thời gian sống của người nhận. Điều này có thể đại diện cho một chiến lược điều trị áp dụng lâm sàng mới để giảm thiểu kết quả lâm sàng bất lợi của IRI lạnh kéo dài trongquả thậncấy ghép.

Từ khóa:Natri thiosulfat (STS) Tổn thương do tái tưới máu do thiếu máu cục bộ (IRI) Bảo quản lạnh tĩnh (SCS)Quả thậncấy ghép Sự sống sót của người ghép và người nhận

1. Giới thiệu

Quả thậncấy ghép là phương pháp điều trị tối ưu cho giai đoạn cuốiquả thậnthậnbệnh (ESRD). So với lọc máu,quả thậncấy ghép ưu việt hơn, vì nó cung cấp chất lượng cuộc sống tốt hơn và mang lại lợi thế sống sót đáng kể cùng với hiệu quả chi phí [1–3]. Tuy nhiên, việc mua thận của người hiến tặng vốn có liên quan đến chấn thương do thiếu máu cục bộ tái tưới máu (IRI), một hệ quả tất yếu của việc ngừng và phục hồi dòng máu sau đó trong quá trình trồng rừng chuyển gen [4]. Chiến lược hiện tại để giảm thiểu IRI do ghép thận là bảo quản lạnh tĩnh (SCS) các mảnh ghép thận trong các giải pháp bảo quản tiêu chuẩn như dung dịch của Đại học Wisconsin (UW) trên băng ở 4 ◦C trong giai đoạn trước khi ghép thận [5]. Tuy nhiên, SCS kéo dài đã được chứng minh là có liên quan đến tăng chết tế bào, viêm và các biến cố tế bào và phân tử gây tổn hại khác, cuối cùng dẫn đến tăng tần suất chức năng ghép chậm (DGF), hoại tử ống thận cấp tính (ATN) và giảm khả năng ghép. tồn tại [6–10]. Ngoài ra, để theo kịp với tỷ lệ mắc ESRD gia tăng trên toàn cầu và số lượng ngày càng tăng của bệnh nhân trong danh sách chờ ghép, nhiều trung tâm cấy ghép chấp nhận ghép thận với thời gian thiếu máu cục bộ lạnh kéo dài, điều này càng góp phần gây tổn thương mô tổng thể. Sau SCS là tái tưới máu, khi máu được cung cấp oxy ấm được phục hồi vào mảnh ghép thiếu máu cục bộ lạnh. Tái tưới máu, là giai đoạn tác động của chấn thương do thiếu máu cục bộ, được đặc trưng bởi sự gia tăng tổn thương mô [11–13].

Một chiến lược điều trị tiềm năng để hạn chế IRI lạnh trong thời gianquả thậnCấy ghép liên quan đến việc bổ sung dung dịch bảo quản tiêu chuẩn với hydrogen sulfide (H2S), một chất dẫn truyền khí được sản xuất nội sinh đã được chứng minh là có vai trò sinh lý quan trọng trong việc giãn mạch và truyền tín hiệu tế bào [14–16]. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng SCS kéo dài trong dung dịch UW bổ sung H2S làm giảm IRI lạnh do cấy ghép và cải thiện tỷ lệ sống sót của mảnh ghép trong các mô hình ghép thận đồng sinh và ghép thận [17–19,41, 42]. Tuy nhiên, các phân tử cho H2S được sử dụng trong các nghiên cứu này không khả thi về mặt lâm sàng. Điều này đã dẫn đến việc xem xét sử dụng natri thiosulfat (STS), một loại thuốc hiến tặng H2S được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) phê duyệt để điều trị chứng calciphylaxis ở bệnh nhân ESRD, độc tính do cisplatin gây ra trong điều trị ung thư và như một loại thuốc giải độc ngộ độc xyanua [20–23]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng STS thể hiện tác dụng bảo vệ trong các mô hình động vật của IRI [24–26]. Tuy nhiên, tác dụng của nó đối với IRI thận lạnh do cấy ghép vẫn chưa được biết rõ. Do đó, nghiên cứu này khảo sát tác dụng bảo vệ tái tạo của STS trong mô hình in vitro của IRI thận và mô hình ghép thận đồng bộ trên chuột.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Giao thức in vitro thử nghiệm

Một mô hình in vitro về tình trạng thiếu oxy lạnh và tổn thương tái oxy hóa ấm mô phỏng điều kiện tế bào trong IRI lạnh in vivo đã được sử dụng để đánh giá tác dụng bảo vệ của STS trong IRI thận. Tế bào biểu mô thận của chuột (dòng tế bào NRK {{0}} E; ATCC, Hoa Kỳ) đã được sử dụng trong các thí nghiệm in vitro vì những tế bào này dễ bị tổn thương do thiếu máu cục bộ [27] và việc sử dụng chúng phù hợp với chuột mô hình cấy ghép được sử dụng cho mục đích thứ hai của nghiên cứu này. Các tế bào được nuôi cấy trong Môi trường Đại bàng Biến đổi (DMEM) của Dulbecco có chứa 1 0 phần trăm huyết thanh bò thai (FBS) bị bất hoạt bởi nhiệt ở 60 ◦C trong 20 phút và 1 phần trăm penicillin / streptomycin (P / S). Tế bào được ủ ở điều kiện phát triển bình thường là 37oC, 21% O2 và 5% CO2. Các tế bào đối chứng ở trong các điều kiện giống với các tế bào trước khi thí nghiệm. Các tế bào thí nghiệm được xử lý bằng môi trường không có huyết thanh (SF), SF cộng với 200 nM AP39, hoặc SF với các nồng độ khác nhau (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natri thiosulfat pentahydrat (STS), thu được từ dung dịch tiêm 250 mg / mL của STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). Nồng độ AP39 200 nM được sử dụng vì trước đây chúng tôi đã chỉ ra rằng AP39 ở nồng độ này có tính bảo vệ tế bào đối với cùng một dòng tế bào trong một mô hình tương tự của IRI lạnh [20]. Sau đó, các tế bào được ủ ở 10 ◦C trong 24 giờ trong điều kiện thiếu oxy (5% CO2, 0,5% O2, 95% N2) trong buồng giảm oxy HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, Hoa Kỳ) để gây ra tổn thương do thiếu máu cục bộ lạnh. Nhiệt độ hạ nhiệt 10 ◦C được sử dụng vì đây là nhiệt độ thấp nhất có thể đạt được về mặt công nghệ trong khi duy trì mức độ thiếu oxy 0,5% O2. Sau tình trạng thiếu oxy, môi trường chứa tế bào thí nghiệm được thay thế bằng môi trường đối chứng, và các tế bào tái tạo oxy thông qua ủ trong điều kiện phát triển bình thường (37 ◦C, 21% O2 và 5% CO2) trong 24 giờ để mô phỏng tái tưới máu và tổn thương liên quan. Sau 24 giờ tái oxy hóa, khả năng sống của tế bào được đánh giá thông qua nhuộm tế bào với Annexin-V liên hợp FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) và 7- Aminoactinomycin D (7- AAD; BioLegend, USA ), đo lường quá trình chết và hoại tử của tế bào tương ứng. Tế bào được phân tích thông qua phương pháp đo tế bào dòng chảy bằng CytoFLEX S (Beckman Coulter, Hoa Kỳ). FlowJo phiên bản 11 (FlowJo LLC, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để phân tích dữ liệu một cách thích hợp.

2.2. Động vật thí nghiệm

Ba mươi con chuột Lewis đực nặng 275–300 g và được mua từ sông Charles (St. Constant, QC, Canada) được nuôi trong cơ sở Dịch vụ Thú y và Chăm sóc Động vật tại Đại học Western (London, ON) trong các điều kiện tiêu chuẩn. Các nghiên cứu trên động vật đã được phê duyệt bởi Hội đồng Đại học Western về Chăm sóc Động vật và Sử dụng Động vật với giao thức ID 2018–155.

2.3. Mô hình ghép thận

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >Giảm 20% trọng lượng) hoặc tử vong. Các điểm cuối nhân đạo được kiểm tra hai lần một ngày và tất cả các con chuột đều chết vì tiếp xúc với CO2 trong một buồng với tốc độ dòng chảy là 40%. Vào thời điểm tử thi, không có biến chứng phẫu thuật nào có thể dẫn đến sự khác biệt trong kết quả.

2.4. Phân tích chức năng thận

Sau khi cấy ghép thận, chuột được theo dõi trong lồng trao đổi chất trong 14 ngày và sau đó được hiến tế. Các mẫu máu và nước tiểu được thu thập trên POD 3, 5, 7, 10 và 14 để xác định các thông số về chức năng thận (creatinin huyết thanh, nitơ urê máu [BUN], độ thẩm thấu nước tiểu và lượng nước tiểu). BUN và creatinine huyết thanh từ những người được ghép thận và chuột được phẫu thuật bằng Sham được đo bằng máy Phân tích Hóa học IDEXX Catalyst One (Markham, ON). Mức độ thẩm thấu nước tiểu được xác định bằng phương pháp đo độ thẩm thấu điểm đóng băng sử dụng máy đo Osmometer 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) và so sánh với các tiêu chuẩn do công ty cung cấp.

2.5. Phân tích mô bệnh học và hình thái học

Các mô thận nhúng parafin được cắt thành các đoạn dày 4 µm và gắn vào các lam kính hiển vi để làm mô học. Các phần được nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E), ghi nhãn đầu cuối deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end (TUNEL) để xác định mức độ ATN và apoptosis tương ứng. Các phần H&E đã được một bác sĩ bệnh lý thận mù chỉ định cho điểm ATN theo sơ đồ sau: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 phần trăm ATN ghép. Các phần thận cũng được nhuộm bằng các kháng thể chính sau: dấu hiệu tổn thương thận (KIM -1), dấu hiệu bề mặt đại thực bào CD68 và men myeloperoxidase đặc hiệu với bạch cầu trung tính (MPO; Abcam®, Toronto, Canada) và được hiển thị bằng các kháng thể thứ cấp và Sắc ký nền DAB sử dụng Hệ thống giám sát Dako (Dako, Glostrup, Đan Mạch) theo giao thức của nhà sản xuất, sau đó được phân tích dưới kính hiển vi ánh sáng kỹ thuật số Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) ở độ phóng đại 10x và được định lượng bằng phần mềm ImageJ v. 1.8 (National Viện Y tế, Bethesda, MD).

2.6. Phân tích PCR định lượng

RNA tổng số được phân lập từ các mô ghép thận thu được ở POD 3 bằng cách sử dụng RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Canada) và được phiên mã ngược thành cDNA bằng cách sử dụng Bộ tổng hợp cDNA OneScript® Plus (ABM, Canada) kết hợp với oligo (dT) 12– 18 lớp sơn lót theo quy trình của nhà sản xuất. RNA và cDNA cô lập được phân tích qua nanodrop (Máy quang phổ DeNovix DS -11, Canada) trước khi sử dụng, với xếp hạng A260 / 280 luôn nhất quán> 1,95 và> 1,8 lần lượt. Hỗn hợp phản ứng của mỗi mẫu qPCR có thể tích 20 µL và được thực hiện theo giao thức Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada) và được phân tích bằng máy Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực CFX Connect (Bio-Rad, Canada) . Trình tự mồi được thiết kế bằng phần mềm Primer-BLAST (NCBI) chống lại beta-actin, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), interferon-gamma (IFN-), yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-), interleukin 6 (IL -6), ung thư hạch bạch huyết tế bào B 2 (Bcl -2), protein X liên kết Bcl -2- (BAX), caspase 3, chất chủ vận chết miền tương tác BH3 (BID), c-Jun N-terminal kinase 1/2 (JNK1 / 2), Pparg coactivator 1 alpha (PGC -1), phức hợp ty thể I (NDUFB8), phức hợp ty thể II (SDHB), protein kinase 1/2 (ERK1) được kích hoạt bởi ty thể / 2), lipocalin gelatinase của bạch cầu trung tính (NGAL) và phân tử tổn thương thận -1 (KIM -1). Tất cả các gen quan tâm đều được bình thường hóa chống lại beta-actin. Những thay đổi gấp về biểu hiện gen được so sánh với những con chuột được phẫu thuật Sham và được tính toán bằng phương pháp ΔΔCt.

2.7. Phân tích thống kê

Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng gói phần mềm thống kê GraphPad (La Jolla, CA) Prism, phiên bản 9. 0. Dữ liệu sống sót được phân tích bằng cách sử dụng phân tích tỷ lệ sống sót Kaplan-Meier và kiểm tra xếp hạng nhật ký trong khi dữ liệu biểu hiện gen qPCR được phân tích bằng cách sử dụng kiểm tra t một chiều không ghép đôi. Tất cả các dữ liệu khác được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là bài kiểm tra sau giờ học của Tukey để xác định sự khác biệt thống kê giữa các nhóm. Ý nghĩa thống kê được chấp nhận ở mức p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Kết quả

3.1. Môi trường không chứa huyết thanh được bổ sung STS cải thiện khả năng sống sót của tế bào biểu mô ống thận trong thời gian thiếu oxy lạnh / tái oxy hóa

Phân tích tế bào dòng chảy sau khi nhuộm để tìm hiện tượng apoptosis và hoại tử cho thấy rằng các tế bào NRK {{0}} E được xử lý bằng SF trong IRI lạnh in vitro cho thấy khả năng sống của tế bào giảm đáng kể so với các tế bào đối chứng (không độc hại) (Hình 1A; p < 0.="" 0="" 5).="" trong="" khi="" tất="" cả="" các="" mẫu="" thử="" nghiệm="" cho="" thấy="" khả="" năng="" sống="" sót="" của="" tế="" bào="" biểu="" mô="" ống="" thận="" thấp="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" các="" tế="" bào="" được="" nuôi="" trong="" điều="" kiện="" không="" độc="" hại="" (p=""><0. 05),="" các="" tế="" bào="" được="" xử="" lý="" bằng="" sf="" bổ="" sung="" 150="" µm="" và="" 500="" µm="" sts="" thể="" hiện="" khả="" năng="" sống="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" những="" tế="" bào="" được="" xử="" lý="" với="" môi="" trường="" sf="" một="" mình="" (hình.="" 1a;="" p=""><0,05), tương="" ứng="" với="" giảm="" apoptosis="" giảm="" rõ="" rệt="" so="" với="" các="" tế="" bào="" được="" xử="" lý="" với="" môi="" trường="" sf="" một="" mình="" (hình="" 1b;="" p=""><0,05). ngoài="" ra,="" sự="" gia="" tăng="" khả="" năng="" tồn="" tại="" của="" tế="" bào="" và="" giảm="" quá="" trình="" apoptosis="" dường="" như="" đạt="" đến="" mức="" tối="" ưu="" với="" 150="" µm="" và="" 500="" µm="" sts,="" vì="" liều="" cao="" hơn="" đã="" đảo="" ngược="" xu="" hướng="" này="" (hình="" 1a="" và="">

3.2. Bổ sung giải pháp UW với STS cải thiện sự sống còn và chức năng của mảnh ghép thận sớm

Việc bảo quản các mảnh ghép thận trong dung dịch UW có bổ sung STS đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của người nhận với 83% tỷ lệ sống sót cho đến POD 14 (ngày hy sinh) so với nhóm đối chứng không bổ sung STS, cho thấy tỷ lệ sống sót 12,5%, đặc biệt trong 3 ngày đầu tiên (Hình. 2A; p <0. 0="" 5).="" ngoài="" ra,="" bổ="" sung="" sts="" cải="" thiện="" rõ="" rệt="" chức="" năng="" mảnh="" ghép="" trong="" thời="" gian="" đầu="" sau="" ghép="" so="" với="" điều="" trị="" uw="" đơn="" thuần.="" nồng="" độ="" creatinine="" và="" bun="" huyết="" thanh="" đã="" tăng="" đáng="" kể="" ở="" cả="" nhóm="" uw="" và="" uw="" cộng="" với="" sts="" trên="" pod="" 3,="" tương="" quan="" với="" giảm="" độ="" thẩm="" thấu="" nước="" tiểu="" so="" với="" sham="" (hình="" 2b,="" c="" và="" 3a;="" p=""><0. {{25="" }}="" 5).="" tuy="" nhiên,="" nồng="" độ="" creatinin="" và="" bun="" huyết="" thanh="" ở="" nhóm="" uw="" cộng="" với="" sts="" giảm="" đáng="" kể="" ở="" pod="" 3="" với="" sự="" gia="" tăng="" tương="" ứng="" về="" độ="" thẩm="" thấu="" nước="" tiểu="" so="" với="" nhóm="" uw="" (hình="" 2b,="" c="" và="" 3a;="" p=""><0,05). điều="" thú="" vị="" là="" nồng="" độ="" creatinine="" và="" bun="" huyết="" thanh="" ở="" nhóm="" uw="" cộng="" với="" sts="" giảm="" đều="" đặn="" từ="" pod="" 3="" đến="" pod="" 14="" với="" nồng="" độ="" thẩm="" thấu="" nước="" tiểu="" tăng="" lên="" và="" có="" thể="" so="" sánh="" với="" sham="" (hình="" 2b,="" c="" và="" 3a).="" ngoài="" ra,="" lượng="" nước="" tiểu="" ở="" nhóm="" uw="" cộng="" với="" sts="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" trong="" bốn="" ngày="" đầu="" sau="" phẫu="" thuật="" so="" với="" nhóm="" uw="" và="" sham="" (hình="" 3b;="" p=""><0,05). tuy="" nhiên,="" nó="" giảm="" dần="" theo="" giá="" trị="" ban="" đầu="" (sham)="" và="" có="" thể="" so="" sánh="" với="" giá="" trị="" của="" sham="" trong="" pod="" 14="" trong="" khi="" lượng="" nước="" tiểu="" ở="" chuột="" sống="" sót="" trong="" nhóm="" uw="" vẫn="" cao="" hơn="" giá="" trị="" ban="" đầu="" trên="" pod="" 14="" (hình="">

3.3. Việc bổ sung STS vào giải pháp UW giúp giảm thiểu quá trình chết tế bào do cấy ghép sau khi ghép thận

Các phần thận thu được trên POD 3 và 14 được nhuộm bằng TUNEL như một phương pháp đo mức độ chết của tế bào apoptotic và được chấm điểm bởi một nhà nghiên cứu bệnh lý thận mù (Hình 4A). Thận ghép từ nhóm UW có biểu hiện chết tế bào apoptotic cao hơn đáng kể trên POD 3 như được chỉ ra bởi điểm TUNNEL cao hơn so với thận từ nhóm UW cộng với STS và Sham (Hình 5A và b; p <0. {{11}="" }="" 5).="" ghép="" từ="" nhóm="" uw="" cộng="" với="" sts="" không="" khác="" biệt="" đáng="" kể="" so="" với="" ghép="" của="" sham="" tại="" cùng="" thời="" điểm="" và="" tại="" pod="" 14="" (hình="" 4b).="" ngoài="" ra,="" trong="" khi="" ghép="" từ="" cả="" nhóm="" uw="" và="" uw="" cộng="" với="" sts="" cho="" thấy="" điểm="" atn="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" trên="" pod="" 3="" so="" với="" nhóm="" sham="" (hình="" 5;="" p=""><0. 0="" 5),="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" cho="" thấy="" điểm="" atn="" giảm="" trên="" pod="" 3="" so="" với="" uw="" (hình="" 5;="" p=""><0,05). ngoài="" ra,="" trong="" khi="" những="" người="" nhận="" ghép="" uw="" không="" sống="" sót="" đến="" pod="" 14,="" và="" do="" đó="" không="" thể="" xác="" định="" điểm="" atn="" của="" họ="" trên="" pod="" 14,="" những="" người="" nhận="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" sống="" sót="" đến="" pod="" 14="" nhưng="" cho="" thấy="" điểm="" atn="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" so="" với="" nhóm="" sham="" (hình="" .="" 5;="" p=""><>

3.4. Các mảnh ghép thận được bảo quản trong dung dịch UW bổ sung STS cho thấy giảm các dấu hiệu tổn thương và thâm nhiễm viêm sau khi ghép thận

Các phần thận thu được trên POD 3 và 14 được nhuộm bằng KIM -1 để phát hiện tổn thương ống thận gần cũng như CD68 (dấu hiệu đại thực bào) và MPO (dấu hiệu bạch cầu trung tính) và được một nhà nghiên cứu bệnh học thận mù cho điểm (Hình 6A, 7A, và C). Biểu hiện mô thận của KIM -1, CD68 và MPO cao hơn đáng kể ở nhóm UW trên POD 3 so với ở nhóm UW cộng với STS và Sham (Hình 6B, 7B và D; p <{{11} }.="" 0="" 5)="" trong="" khi="" biểu="" hiện="" của="" các="" điểm="" đánh="" dấu="" này="" trong="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" không="" khác="" biệt="" đáng="" kể="" so="" với="" sham="" trên="" pod="" 14="" (hình="" 6b,="" 7b="" và="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. Việc bổ sung STS vào giải pháp UW đã ngăn chặn sự biểu hiện ở thận của các gen tiền viêm, pro-apoptotic và ty thể

Sự biểu hiện gen của các dấu hiệu tiền viêm, pro-apoptotic, ty thể nhắm mục tiêu và tổn thương thận được xác định thông qua qRT-PCR trong thận cấy ghép thu được trên POD 3. Sự biểu hiện của các gen tiền viêm IFN-, TNF- và IL {{8 }} đã tăng lên rõ rệt ở các đoạn ghép UW so với các đoạn ghép UW cộng với STS trên POD 3 (Hình 8A; p <0. 0="" 5)="" và="" theo="" cùng="" một="" kiểu="" với="" các="" gen="" pro-apoptotic="" parp,="" bax="" ,="" caspases="" -3,="" bid,="" jnk1="" và="" jnk2="" (hình="" 8a;="" p=""><0. 0="" 5)="" trong="" khi="" biểu="" hiện="" của="" anti-apoptotic="" bcl="" -2="" tăng="" lên="" một="" chút="" trong="" uw="" cộng="" với="" nhóm="" sts="" so="" với="" nhóm="" uw,="" mặc="" dù="" sự="" gia="" tăng="" này="" không="" đạt="" được="" ý="" nghĩa="" thống="" kê="" (hình="" 8a).="" ngoài="" ra,="" sự="" biểu="" hiện="" của="" các="" gen="" ti="" thể="" pgc="" -1,="" ndufb8="" (phức="" hợp="" i)="" và="" sdhb="" (phức="" hợp="" ii)="" trong="" ghép="" uw="" đã="" giảm="" đáng="" kể="" so="" với="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" (hình="" 8b;="" p=""><0 .="" 0="" 5)="" trong="" khi="" điều="" ngược="" lại="" được="" quan="" sát="" với="" các="" biểu="" thức="" erk1="" và="" erk2="" (hình="" 8b;="" p=""><0,05). hơn="" nữa,="" biểu="" hiện="" gen="" kim="" -1="" trong="" ghép="" uw="" đã="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" so="" với="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" (hình="" 8c;="" p=""><0,05) trong="" khi="" biểu="" hiện="" ngal="" giảm="" trong="" ghép="" uw="" cộng="" với="" sts="" không="" đạt="" được="" ý="" nghĩa="" thống="" kê="" so="" với="" trong="" ghép="" uw="" (hình="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Thảo luận

Nghiên cứu này thiết lập việc bổ sung dung dịch bảo quản tiêu chuẩn với STS, một nhà tài trợ H2S khả thi về mặt lâm sàng được FDA chấp thuận, để giảm thiểu IRI thận lạnh do cấy ghép, cải thiện chất lượng mảnh ghép và kéo dài thời gian sống của người nhận. Sử dụng mô hình in vitro của IRI thận và mô hình ghép thận ghép đồng bộ trên chuột, lần đầu tiên chúng tôi chứng minh rằng việc bổ sung dung dịch UW với STS trong thời gian SCS kéo dài là bảo vệ cơ quan và tổ chức.

Phát hiện chính trong mô hình in vitro của chúng tôi là việc bổ sung STS vào môi trường không có huyết thanh bảo vệ các tế bào biểu mô thận khỏi tình trạng thiếu oxy lạnh và quá trình chết do tái tạo oxy hóa ấm và tăng khả năng sống sót, điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây của chúng tôi, nơi chúng tôi đã chỉ ra tác dụng bảo vệ của ty thể. - nhắm mục tiêu thuốc cho H2S, AP39, trong một mô hình in vitro của IRI thận lạnh [20]. Điều thú vị là nồng độ STS cao hơn 1 mM đã đảo ngược các tác dụng có lợi, ngụ ý rằng STS thể hiện hiện tượng đáp ứng liều hai pha được gọi là hormesis, trong đó nồng độ thấp hơn là bảo vệ tế bào trong khi nồng độ cao hơn là độc tế bào. Tổn thương ty thể là hậu quả chính của IRI thận, vì tính thấm của ty thể có thể ức chế sản xuất adenosine triphosphate (ATP) và làm tăng sự hình thành các loại oxy phản ứng (ROS), một chất trung gian hủy hoại mô [13]. Gần đây người ta cho rằng ty thể là một địa điểm chính của hoạt động STS. STS không chỉ được biết là tạo ra H2S trong ty thể thông qua quá trình khử phụ thuộc glutathione và ngược lại thông qua con đường oxy hóa sulfide, mà còn duy trì sự tổng hợp ATP của ty thể, giảm sản xuất ROS và cải thiện các hoạt động của enzym phức tạp trong chuỗi vận chuyển điện tử (ETC) [24 , 28–30]. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy STS làm tăng đáng kể sự biểu hiện của PGC -1, một chất điều hòa tích cực quá trình sinh học ty thể và sản xuất ATP [26], phù hợp với quan sát in vivo của chúng tôi. Các cơ chế phân tử này có thể giải thích cho sự biểu hiện gia tăng đáng kể của phức hợp ETC ti thể I và II (NDUFB8 và SDHB tương ứng) trong mô hình ghép thận của chúng tôi với sự gia tăng khả năng sống sót và chức năng như được quan sát thấy ở các mảnh ghép thận được bảo quản trong dung dịch UW có bổ sung STS.

Dựa trên kết quả in vitro của chúng tôi, chúng tôi quyết định điều tra xem liệu hiệu quả bảo vệ của STS có thể áp dụng trong cơ thể bằng cách sử dụng mô hình cấy ghép trong đó IRI lạnh là yếu tố góp phần chính gây ra rối loạn chức năng mảnh ghép và tăng các biến chứng sau ghép. Phát hiện của chúng tôi cho thấy việc ghép thận SCS kéo dài (24 giờ) trong dung dịch UW bổ sung STS cải thiện đáng kể chất lượng và chức năng của mảnh ghép, đặc trưng bởi nồng độ creatinin và BUN trong huyết thanh giảm, lượng nước tiểu cao hơn và kéo dài thời gian sống của người nhận so với các mảnh ghép được bảo quản trong dung dịch UW đơn thuần. . Điều quan trọng cần lưu ý là lượng nước tiểu ngay lập tức ngay cả sau khi ghép thận lâm sàng là một kết quả quan trọng quyết định liệu có cần lọc máu để giải quyết chức năng ghép chậm (DGF) hay không. Do đó, quan sát của chúng tôi rằng STS làm tăng lượng nước tiểu ngay sau khi cấy ghép và có thể so sánh với nhóm Sham trên POD 14 là một phát hiện đầy hứa hẹn. Sự cải thiện chức năng thận quan sát được sau khi ghép các mảnh ghép được bảo quản trong dung dịch UW có bổ sung STS cũng mang lại một lợi thế sống sót đáng kể. Về mặt định lượng, bổ sung STS kéo dài tuổi thọ của mảnh ghép sao cho 83% (5/6) chuột được ghép UW cộng với STS sống sót cho đến POD 14 (ngày hy sinh) so với chỉ 12,5% (1/8) chuột nhận các mảnh ghép được bảo quản trong dung dịch UW mà không cần bổ sung STS. Phát hiện này từ nghiên cứu hiện tại cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó chỉ 14 phần trăm (1 trên 7) chuột nhận ghép được bảo quản trong dung dịch UW trong 24 giờ mà không bổ sung H2S (GYY4137), sống sót cho đến POD 14 [20] .

Ngoài việc cho thấy sự cải thiện các thông số chức năng thận, việc bổ sung STS cũng ức chế quá trình apoptosis và viêm của mảnh ghép thận bằng cách điều chỉnh giảm biểu hiện mô của các gen pro-apoptotic và pro-viêm trong khi đồng thời điều hòa các gen chống apoptotic và giảm CD 68- đại thực bào dương tính và Bạch cầu trung tính dương tính với MPO, hoàn toàn dẫn đến giảm biểu hiện KIM -1 và ATN và cuối cùng là hình thái thận được bảo tồn. Các cytokine gây viêm này được biết là chất trung gian gây chết tế bào trong quá trình IRI lạnh [31], và việc giảm UW cộng với các mảnh ghép STS của chúng có thể là do đặc điểm nổi tiếng của STS là làm giảm tính thấm của nội mô trong lớp đơn lớp nội mô mạch máu, làm giảm sản xuất cytokine. , và sản xuất các cytokine chống viêm [32]. Ngoài ra, phát hiện của chúng tôi rằng việc bổ sung STS vào dung dịch UW điều chỉnh giảm sự biểu hiện của các gen gây viêm phù hợp với nghiên cứu trước đây về hoạt động chống viêm của STS bằng cách giảm mức TNF- và IL -6 trong các bệnh thần kinh [33 , 34]. Về mặt cơ học, STS bất hoạt caspase -3 bằng cách gắn vào vị trí hoạt động của nó thông qua các liên kết hydro mạnh và do đó ngăn cản sự tiếp cận của chất nền tự nhiên đến vị trí hoạt động, cuối cùng ngăn chặn quá trình chết rụng [35]. STS cũng ngăn chặn sự hoạt hóa của JNK, một protein đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu apoptotic [35], hỗ trợ phát hiện của chúng tôi về tác động điều hòa của STS đối với caspase3 và JNK. Tuy nhiên, chúng tôi không thể xác định liệu các cơ chế như vậy có hoạt động trong nghiên cứu này hay không vì chúng tôi đã không thực hiện các thí nghiệm bổ sung để khám phá các cơ chế phân tử này.

Một hạn chế lớn trong thí nghiệm in vitro của chúng tôi là thách thức kỹ thuật của chúng tôi trong việc sử dụng nhiệt độ bảo quản tiêu chuẩn hiện tại là 4 ◦C [36], vì 10 ◦C mà chúng tôi sử dụng là nhiệt độ thấp nhất có thể đạt được về mặt công nghệ mà không gây nguy hiểm cho môi trường thiếu oxy. Đây là một sự khác biệt thực sự liên quan đến các quá trình sinh lý tế bào và cả trong các kỹ thuật bảo quản. Một giải pháp tiềm năng là sử dụng tình trạng thiếu oxy do hóa chất gây ra trong một túi nhựa và đặt nó trong tủ lạnh 4 ◦C để phản ánh tình trạng lâm sàng của SCS. Tuy nhiên, các túi tạo khí quyển kỵ khí này được thiết kế để sử dụng ở nhiệt độ ấm (21–37 ◦C) vì các hợp chất hóa học tạo ra môi trường thiếu oxy hoạt động trong điều kiện đó. Các nghiên cứu trong tương lai nên hướng tới việc tối ưu hóa nhiệt độ trong buồng thiếu oxy để bắt chước các thiết lập SCS lâm sàng. Việc đạt được nhiệt độ ổn định 4 ◦C mà không ảnh hưởng đến môi trường thiếu oxy sẽ cho phép chúng tôi xác định liệu các kiểu hình quan sát được trong mô hình IRI lạnh in vitro thử nghiệm có được biểu hiện nhất quán hay không. Ngoài thí nghiệm trong ống nghiệm, mô hình cấy ghép chuột của chúng tôi cũng không phải là không có nhược điểm. Chúng tôi đã thực hiện ghép thận ghép (người cho và người nhận giống hệt nhau về mặt di truyền với khả năng tương thích miễn dịch), chỉ áp dụng cho các cặp song sinh giống hệt nhau trong ghép thận lâm sàng, trong khi hầu hết các ca ghép thận lâm sàng là đồng gen (người cho và người nhận khác nhau về mặt di truyền). Việc cấy ghép dị sinh buộc người nhận cấy ghép phải trải qua các xét nghiệm miễn dịch trước khi cấy ghép để xác định kháng nguyên bạch cầu người của người hiến tặng (HLA; các phân tử cảm ứng và điều chỉnh phản ứng miễn dịch), xác định sự tương thích miễn dịch giữa người cho và người nhận, và tránh thải ghép [37,38]. Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng STS nên xem xét việc cấy ghép đồng gen. Một hạn chế khác của mô hình ghép thận là việc chúng tôi tập trung vào những người hiến tặng còn sống, những mảnh ghép dưới mức tối ưu từ những người hiến tặng sau khi chết vì tim (DCD) đang ngày càng trở nên phổ biến như một nguồn thận của người hiến tại nhiều trung tâm ghép tạng trên toàn cầu [39]. DCD khiến các cơ quan hiến tặng phải trải qua các giai đoạn thiếu máu cục bộ ấm khác nhau ngoài thời gian thiếu máu cục bộ lạnh trong SCS, và có liên quan đến việc tăng tỷ lệ DGF và giảm khả năng sống sót của mảnh ghép so với những người hiến tặng còn sống [40]. Do đó, các nghiên cứu trong tương lai nên xem xét mô hình ghép thận DCD để đánh giá tác dụng của STS đối với IRI trong mô hình này.

Kết luận, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng việc bổ sung dung dịch bảo quản tiêu chuẩn với một loại thuốc hiến tặng H2S khả thi trên lâm sàng trong thời gian kéo dài SCS của các mảnh ghép thận sẽ bảo vệ chống lại IRI thận lạnh do ghép, cải thiện chất lượng mảnh ghép tổng thể và chức năng mảnh ghép, đồng thời kéo dài thời gian sống sót của người nhận ghép. Xem xét rằng nguy cơ DGF tăng lên khi thời gian thiếu máu cục bộ lạnh kéo dài trong ghép thận lâm sàng, điều này làm tăng mối quan tâm lâm sàng lớn, quan sát rằng STS bảo vệ các mảnh ghép thận trong thời gian SCS kéo dài và ngăn ngừa DGF sau khi ghép cung cấp một hứa hẹn lâm sàng lớn có thể làm giảm hoặc ngăn ngừa tỷ lệ mắc DGF trong ghép thận lâm sàng trong tương lai gần. Do đó, lợi ích trong tương lai của việc thêm STS vào các giải pháp bảo quản có thể đưa ra một giải pháp tiềm năng cho vấn đề đang diễn ra này. Nhìn chung, nghiên cứu này bổ sung vào nguồn tài liệu ngày càng tăng hỗ trợ tác dụng bảo vệ tế bào của STS và các nhà tài trợ H2S khác chống lại IRI nội tạng, đặc biệt là cải thiện kết quả ghép trong IRI thận lạnh do cấy ghép. Những chiến lược này có thể tạo điều kiện cho việc sử dụng nhiều mảnh ghép hơn tiếp xúc với thời gian thiếu máu cục bộ lạnh kéo dài, điều này có thể làm tăng nguồn cơ quan chuyển hóa thực vật.

Tuyên bố đóng góp quyền tác giả CRediT

Tất cả các tác giả đã đồng ý gửi bản thảo này. Không có xung đột lợi ích.

Người giới thiệu

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., So sánh tỷ lệ tử vong ở tất cả bệnh nhân lọc máu, bệnh nhân lọc máu chờ cấy ghép và những người nhận ca cấy ghép tử thi đầu tiên, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, và cộng sự, Tổng quan hệ thống: ghép thận so với lọc máu trong các kết quả có liên quan về mặt lâm sàng, Am. J. Chuyển đổi. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Hiệu quả chi phí của việc ghép thận từ DCD ở Ý, Cấy ghép. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Chấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ, Eur. J. Cấp cứu chấn thương. Phẫu thuật. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Bảo tồn nội tạng: khái niệm hiện tại và chiến lược mới cho thập kỷ tới, Transfus. Med. Nhiệt huyết. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Thiếu máu cục bộ lạnh và giảm khả năng sống sót lâu dài của ghép thận tử thi, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Tác động chính của chức năng ghép chậm và thời gian thiếu máu cục bộ lạnh lên sự sống sót của thận, Nephrol. Quay số. Cấy. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, J.D Schold, Tác động của thời gian thiếu máu cục bộ lạnh lên sự sống sót của mảnh ghép ở những người được ghép ECD: phân tích thận ghép đôi, Am. J. Cấy ghép. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Các yếu tố nguy cơ tiếp nhận liên quan đến chức năng ghép chậm: phân tích thận ghép, Cấy ghép 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Mỗi giờ thêm thời gian thiếu máu cục bộ lạnh làm tăng đáng kể nguy cơ suy ghép và tử vong sau ghép thận, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Chất chống oxy hóa nhắm vào ty thể: viễn cảnh tương lai trong chấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận, Oxid. Med. Ô Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Căng thẳng oxy hóa do quá tải canxi ty thể, Ann. NY Acad. Khoa học. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Vai trò của ty thể trong chấn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu, Cấy ghép 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Vai trò mới nổi của chất truyền khí trong ghép thận, Am. J. Cấy ghép. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hydrogen sulfide và tín hiệu ô: cầu thủ đội hay trọng tài? Thực vật Physiol. Hóa sinh. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Tác dụng điều hòa mạch máu của H (2) S như một chất mở kênh K (ATP) ở dạng khí nội sinh mới, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, và cộng sự, Điều trị bằng hydro sulfide làm giảm tổn thương do thiếu máu cục bộ do tái tưới máu trên thận trong quá trình bảo quản lạnh và cải thiện chức năng và tỷ lệ sống của thận ghép sớm sau khi ghép thận toàn thể đồng sinh, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Hydro sulfide bổ sung bảo vệ chức năng thận ghép và kéo dài thời gian sống của người nhận sau chấn thương do thiếu máu cục bộ do lạnh kéo dài bằng cách giảm thiểu quá trình apoptosis của mảnh ghép thận và viêm, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187 – E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hydrogen Sulfide bảo vệ các mô ghép thận chống lại tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ lạnh kéo dài thông qua các hoạt động cụ thể của ty thể, Am. J. Cấy ghép. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Sodium thiosulfate đối với ngộ độc xyanua cấp tính: một nghiên cứu trên mô hình chuột, Ann. Dược phẩm. Cha 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, và cộng sự, Natri thiosulfat bảo vệ khỏi suy thận sau khi hóa trị trong phúc mạc tăng thân nhiệt (HIPEC) với Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.