Đặc tính cấu trúc của cistanche sa mạc polysacarit và tác dụng bảo vệ của nó đối với tổn thương tế bào do glucose cao

1.2.5.8 Phát hiện tiềm năng màng ty thể

Các tế bào HK -2 được tiêm vào 6- các tấm tốt và nuôi cấy. Sau khi kích thích tương ứng, môi trường nuôi cấy trong các tấm giếng 6- đã được hút và một nhóm kiểm soát tích cực mạnh (POS) đã được thêm vào nhóm trong "1.2.5.6". Rửa sạch một lần với PBS, thêm 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào và 1 ml JC -1 Dung dịch làm việc nhuộm được trộn kỹ và đặt trong một máy ấp trứng nuôi cấy trong bóng tối trong 20 phút. Các tế bào được rửa hai lần với bộ đệm nhuộm JC -1 (1 ×) và hình ảnh được thu thập bằng kính hiển vi huỳnh quang.

 

 

 

 

Lợi ích cistanche

 

1.2.5.9 Phương pháp Hoechst33258 để phát hiện apoptosis tế bào

Các slide tế bào được đặt trong 6- Các tấm giếng và các tế bào HK -2 trong pha tăng trưởng logarit được gieo vào các tấm giếng 6- ở mật độ tế bào là 1 × 105 tế bào/giếng. Sau khi can thiệp thuốc tương ứng, bộ nhuộm màu Hoechst33258 đã được sử dụng để nhuộm. Apoptosis tế bào đã được phát hiện và hình ảnh được thu thập bằng kính hiển vi huỳnh quang.

 

1.2.5.10 Western blotting để phát hiện

Biểu hiện của các protein liên quan đến đường dẫn tín hiệu TLR4/NF-κB được phân tích bằng cách nhóm và xử lý các tế bào theo phương pháp theo "1.2.5.6". Sau đó, tổng số protein trong các tế bào được chiết xuất theo hướng dẫn của bộ chiết xuất protein. Định lượng protein được thực hiện bằng phương pháp định lượng protein axit bicinchoninic (BCA), và protein được biến tính và lưu trữ trong tủ lạnh -20.
10% natri dodecyl sulfate điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE), chuyển màng polyvinylidene fluoride (PVDF), đặt màng vào bộ đệm chứa tween {3}}
Các tế bào được ủ trong dung dịch muối đệm Tris với buồng tween -20 (TBST) và bị chặn ở nhiệt độ phòng. Các kháng thể chính của TLR4, NF-P65, P-NF-P65 và -actin đã được sử dụng đểPhát hiện mô thận(Kháng thể được pha loãng thành dung dịch TBST ở tỷ lệ thể tích là 1: 2000) ở 4 độ qua đêm. TBST
Màng được pha loãng với kháng thể thứ cấp (kháng thể và dung dịch TBST được pha loãng với tỷ lệ thể tích là 1: 2000) và được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau khi rửa màng 3 lần bằng TBST, thuốc thử phát quang ECL đã được thêm vào để phát hiện và biểu hiện protein được phát hiện bằng hình ảnh gel. Phần mềm hình ảnh J được sử dụng để phân tích giá trị thang độ xám protein, với -actin làm tài liệu tham khảo nội bộ.

1.3 Xử lý dữ liệu

SPSS 23. 0 và phần mềm GraphPad Prism 6.01 đã được sử dụng để phân tích dữ liệu. Thử nghiệm Shapiro-Wilk đã được sử dụng để kiểm tra tính chuẩn của dữ liệu mẫu và thử nghiệm của Brown-Forsythe hoặc Bartlett đã được sử dụng để kiểm tra tính đồng nhất của phương sai của dữ liệu mẫu. Dữ liệu đo lường với phân phối bình thường và tính đồng nhất của phương sai được biểu thị bằng độ lệch trung bình ±. .
Đối với các so sánh theo cặp bài hoc của các phương sai không đồng đều, phương pháp T3 của Dunnett đã được sử dụng, với p <{1}}. 0 5 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê và p <0,01 cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm.

2 Kết quả và phân tích

2.1 Xác định tổng lượng đường, axit uronic và protein của CDPS

Phương trình hồi quy tuyến tính của nội dung polysacarit là: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Thí nghiệm cho thấy rằng từ 7 đến 70 Phag/mL, có mối quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ glucose tiêu chuẩn (X) và giá trị độ hấp thụ (Y). Tỷ lệ phần trăm tính toán của hàm lượng polysacarit trong mẫu là: 81,02%.
Phương trình hồi quy tuyến tính của axit uronic tiêu chuẩn là: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Thí nghiệm cho thấy rằng từ 20 đến 100 Phag/mL, có mối quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ axit uronic tiêu chuẩn (X) và giá trị độ hấp thụ (Y). Hàm lượng axit uronic trong mẫu là: 4,43%.
Phương trình hồi quy tuyến tính protein tiêu chuẩn là: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Thí nghiệm cho thấy rằng từ 20 đến 1 00 Phag/mL, có một mối quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ protein tiêu chuẩn (x) và giá trị độ hấp thụ (y). Hàm lượng protein trong mẫu là: 4,00%.

 

2.2 Phân bố trọng lượng phân tử của CDP

Trọng lượng phân tử của CDP được xác định bằng phương pháp sắc ký gel hiệu suất cao phát hiện cột song song. Với RT AS (x) và LGMP AS (y), phương trình của đường cong hiệu chuẩn LGMP-RT được tính là: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; RT là (x), lgmw là (y), phương trình đường cong hiệu chuẩn LGMW-RT là: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; RT là (x), lgmn là (y), đường cong hiệu chuẩn LGMN-RT Phương trình là: y=-0. 1964x + 11. 7, R²=0. 9955; Dựa trên đường cong tiêu chuẩn, công thức tính toán thu được để tính toán trọng lượng phân tử của từng mẫu. Phổ trọng lượng phân tử của mẫu như sau, và kết quả tính toán được thể hiện trong Bảng 2. Kết quả cho thấy CDP có nhiều đỉnh rửa giải và trọng lượng phân tử của polysacarit chủ yếu phân phối giữa 3 đến 8 kDa, là một chất cân bằng phân tử nhỏ không đồng nhất. Như trong Hình 1.

 

 

2.3 Thành phần Monosacarit CDPS

CDP được phân tích bằng sắc ký ion và sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 2. Kết quả cho thấy so với thời gian lưu của 16 tiêu chuẩn monosacarit, 5 monosacarit được phát hiện trong CDP. Bằng cách so sánh quang phổ với các tiêu chuẩn monosacarit, CDP chủ yếu bao gồm glucose, galactose, rhamnose, mannose và sucrose. , Arabinose. Tỷ lệ mol là 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. Từ tỷ lệ mol, có thể thấy rằng CDP chủ yếu bao gồm glucose, galactose và rhamnose. Trong số đó, glucose chiếm 73,405%, Galactose chiếm 5,381%và Rhamnose chiếm 5,02%.

 

Lưu ý: Man.mannose, Glc N.Glucosamine Hydrochloride, Rha.Rhamnose, Glc-UA.Glucuronic Acid, Gal-UA.Galacturonic Acid, Gal N.Galactosamine Hydrochloride, Glc.Glucose, Gal.Galactose, Xyl arabinose, fuc.fucose.

2.4 Phân tích hồng ngoại Fourier CDPS

Đỉnh gần 3246 cm -1} là do rung động kéo dài OH của nhóm hydroxyl, đỉnh hấp thụ gần 2900 cm -1 1374.31 cm -1: Đỉnh hấp thụ này có thể liên quan đến độ rung biến dạng của các liên kết CH, đặc biệt là trong các nhóm polysacarit methyl (-ch3) hoặc methylene (-h 2-). Đỉnh hấp thụ ở 1018,38 cm -1 có thể liên quan đến độ rung kéo dài của liên kết CO, thường được tìm thấy trong các liên kết ether hoặc liên kết este của polysacarit. Ba đỉnh hấp thụ yếu trong phạm vi 1200-1000 cm -1 cho thấy sự hiện diện của pyranose trong CDP. Các đỉnh hấp thụ ở 870 và 930 cm -1 chỉ ra rằng các liên kết glycosid -type có thể tồn tại trong CDP. Xem Hình 3.

 

2.5 Hiệu ứng độc hại của CDP trên các tế bào HK -2 bình thường

So với CON, vào lúc 24 giờ sau khi sử dụng, khả năng sống của tế bào bắt đầu giảm đáng kể sau khi nồng độ CDPS đạt 1000 UG/mL (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Thảo luận và Kết luận

Polysacaritlà các polyme trọng lượng phân tử cao bao gồm hơn 10 monosacarit. Nó đã được báo cáo rằng polysacarit cóĐiều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm và hạ đường huyết[15]. Là một trong những hoạt chất dược lý chính trong sa mạc Cistanche, CDP có giá trị y học đáng kể. Nghiên cứu này đặc trưng sơ bộ cấu trúc của CDP và thấy rằng chúng có thể cải thiện thiệt hại của các tế bào HK -2 do môi trường đường cao gây ra.

 

Cấu trúc phức tạp của polysacarit có liên quan chặt chẽ đến hoạt động sinh học của chúng, trong đó loại và tỷ lệ monosacarit, khối lượng phân tử tương đối của polysacarit và loại liên kết glycosid là các yếu tố ảnh hưởng chính [16]. Khối lượng phân tử tương đối vừa phải giúp polysacarit hoạt động hơn và có thể thể hiện hoạt động sinh học mạnh mẽ hơn.
Tuy nhiên, trọng lượng phân tử lớn sẽ làm tăng điện trở xuyên màng, hấp thụ polysacarit cản trở và ảnh hưởng đến hoạt động. Ngược lại, polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ có thể không thể hình thành các cấu trúc hoạt động hiệu quả, dẫn đến giảm hoạt động [17]. Khi khám phá hoạt động sinh học của polysacarit, cần phải xem xét toàn diện thành phần monosacarit, khối lượng phân tử tương đối và loại liên kết glycosid [18]. Trong nghiên cứu này, sắc ký ion xác định rằng CDP chủ yếu bao gồm glucose, galactose và rhamnose, phù hợp với báo cáo của Xu et al. [19]. Trọng lượng phân tử trung bình trọng lượng của CDP được đo bằng sắc ký gel chất lỏng hiệu suất cao lần lượt là 3444, 4198 và 8031 ​​kDa. Trọng lượng phân tử của ba polysacarit cistanche từ bốn vật liệu thuốc loại cistanche được đo bằng Yang et al. [20] là tương tự. CDP có thể chứa các liên kết glycosid -type và có thể chứa -glucose hoặc -mannose. Polysacarit bao gồm -glucose hoặc -mannose dễ dàng nhận ra hơn bởi thụ thể giống như Toll 4 (TLR4) hoặc TLR2 [21].
DN là một trong những biến chứng vi mạch nghiêm trọng nhất của bệnh tiểu đường và sinh bệnh học của nó có liên quan chặt chẽ đến stress oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể và apoptosis tế bào [22]. Nghiên cứu này đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của CDP trên các tế bào HK -2 do glucose cao bằng cách điều chỉnh đường dẫn tín hiệu TLR4/NF-κB và cơ chế phân tử của nó.

Trong điều kiện glucose cao, các tế bào HK -2 biểu hiện căng thẳng oxy hóa đáng kể [23]. Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng lượng đường cao làm tăng đáng kể việc sản xuất ROS nội bào. Lượng ROS quá mức này có thể trực tiếp làm hỏng lipid màng tế bào, dẫn đến sự gia tăng hàm lượng sản phẩm peroxid hóa lipid MDA [24]. Đồng thời, các hoạt động của SOD và GSH-PX, các hệ thống phòng thủ chống oxy hóa quan trọng, đã giảm đáng kể, cho thấy khả năng chống oxy hóa của các tế bào bị tổn thương nghiêm trọng [25]. Sự mất cân bằng này trong hệ thống oxy hóa-antioxid hóa thúc đẩy thêm biểu hiện và kích hoạt TLR4 [26]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng ROS quá mức có thể được TLR4 nhận ra là các mẫu phân tử liên quan đến nguy hiểm (DAMPS), tạo thành một vòng phản hồi tích cực [27]. Trong nghiên cứu này, tiền xử lý CDP làm giảm đáng kể mức độ ROS, tăng các hoạt động SOD và GSH-PX và giảm hàm lượng MDA. Hiệu ứng chống oxy hóa toàn diện này cho thấy rằng CDP có thể điều chỉnh các phản ứng stress oxy hóa thông qua nhiều mục tiêu.
Trong con đường truyền tín hiệu TLR4/NF-κB, TLR4 được kích hoạt thúc đẩy việc kích hoạt phức hợp IKK bằng cách tuyển dụng các protein bộ điều hợp xuôi dòng, từ đó dẫn đến sự phosphoryl hóa và suy thoái của IκB [28]. Nghiên cứu hiện tại đã quan sát thấy rằng glucose cao làm tăng đáng kể mức độ phosphoryl hóa của IκB, dẫn đến sự chuyển vị của NF-κB p65 từ tế bào chất sang nhân. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự chuyển vị hạt nhân của p65 không chỉ làm nặng thêm stress oxy hóa mà còn ảnh hưởng đến chức năng của ty thể [29].
Nó đã được quan sát thấy bằng cách nhuộm màu JC -1 rằng điều trị glucose cao gây ra sự giảm đáng kể trong tiềm năng màng ty thể, cho thấy sự dịch chuyển từ huỳnh quang màu đỏ sang huỳnh quang màu xanh lá cây, cho thấy độ dốc proton giữa màng bên trong và ngoài của ty thể bị phá vỡ. Rối loạn chức năng ty thể làm trầm trọng thêm việc sản xuất ROS, tạo thành một vòng luẩn quẩn [30]. Tiền xử lý CDP có thể duy trì tính ổn định của tiềm năng màng ty thể, và tác dụng bảo vệ này có thể đạt được bằng cách ức chế sự biểu hiện của TLR4 và kích hoạt NF-κB.
Rối loạn chức năng ty thể và stress oxy hóa dai dẳng cuối cùng dẫn đến apoptosis tế bào [31]. Nhuộm Hoechst cho thấy các hạt nhân tế bào trong nhóm điều trị glucose cao cho thấy những thay đổi hình thái apoptotic điển hình rõ ràng như ngưng tụ, ngưng tụ và phân mảnh [32]. Những thay đổi này có liên quan chặt chẽ đến con đường apoptosis nội tại qua trung gian ty thể: mất tiềm năng màng ty thể dẫn đến việc giải phóng cytochrom C, kích hoạt tầng caspase và cuối cùng là apoptosis tế bào [33]. Hình thái hạt nhân của các tế bào trong nhóm tiền xử lý CDP về cơ bản là bình thường và nhuộm màu đồng đều, cho thấy CDP đã ngăn chặn apoptosis tế bào bằng cách duy trì chức năng của ty thể và ức chế stress oxy hóa.
Tóm lại, nghiên cứu này đã phát hiện một cách có hệ thống các chỉ số ứng suất oxy hóa (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), chức năng ty thể (JC -1) và apoptosis tế bào (Hoechst), kết hợp với các phân tử truyền tín hiệu TLR4/NF-B
Đầu tiên, bằng cách cải thiện khả năng chống oxy hóa của các tế bào, giảm mức độ ROS và giảm kích hoạt TLR4; thứ hai, bằng cách ức chế sự biểu hiện của TLR4 và sự phosphoryl hóa IκB, ngăn chặn sự chuyển vị hạt nhân của NF-κB; Cuối cùng, bằng cách cải thiện chức năng ty thể, ức chế apoptosis tế bào. Cái chết, do đó đóng một vai trò bảo vệ chống lại DN. Hiệu ứng hiệp đồng đa mục tiêu này làm cho CDP cho thấy triển vọng ứng dụng tốt trong điều trị DN. Trong các nghiên cứu tiếp theo, cấu trúc polysacarit sẽ được xác định thêm bằng nhiễu xạ tia X, quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân và quang phổ khối sắc ký khí. Ngoài ra, kết quả trọng lượng phân tử trung bình cho thấy CDP là polysacarit không đồng nhất. Tiếp theo, chúng tôi sẽ tách và tinh chế các polysacarit đồng nhất, phát hiện cấu trúc polysacarit và hoạt động sinh học, và làm rõ mối quan hệ hoạt động cấu trúc.