Nghiên cứu về chức năng miễn dịch thần kinh nội tiết của Cistanche Deserticola và các sản phẩm hấp rượu gạo của nó trong mô hình chuột gây ra bởi Glucocorticoid-Ⅱ

3.2.4. Hóa mô miễn dịch

Apoptotic thần kinh được kiểm soát bởi nhiều gen apoptotic và antiapoptotic, chủ yếu là gen Bax thúc đẩy apoptosis và các gen chống apoptotic thuộc họ gen Bcl-2. Bcl-2 được định vị trong các cơ quan sản xuất oxy phản ứng như ty thể, mạng lưới nội chất và màng nhân. Bcl-2 ít tác động đến các gốc oxy tự do nhưng có thểngăn ngừa tổn thương oxy hóa trong tế bào. Bax vận chuyển từ tế bào chất đến màng ty thể, làm thay đổi cấu trúc màng ty thể và thúc đẩy giải phóng cytochrom c và gây ra apoptosis.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Có sự biểu hiện trong tế bào chất tuyến thượng thận của protein Bax và Bcl{0}}. Nhuộm cho thấy tất cả các hạt màu vàng. So với nhóm BC, mật độ quang trung bình của protein Bax ở nhóm MC tăng đáng kể (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Hình 5(b) cho thấy rằng so với nhóm BC, mật độ quang trung bình của protein Bcl-2 trong nhóm MC giảm đáng kể (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Protein caspase{0}} chủ yếu tập trung ở tế bào chất ở dạng ban đầu ở các mô bình thường và có biểu hiện thấp. Tín hiệu tích cực có màu vàng nhạt hoặc vàng nâu. So với nhóm BC, biểu hiện caspase-3 trong nhóm MC tăng đáng kể (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

Ở các mô bình thường, sự biểu hiện của gen Fas bị giảm và tín hiệu tích cực cho lai in situ là màu vàng nâu. Như được hiển thị trong Hình 5(d), so với nhóm BC, mật độ quang trung bình của protein Fas trong nhóm MC tăng lên (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Protein FasL nằm chủ yếu ở màng tế bào hoặc tế bào chất và các tín hiệu tích cực của nó có màu nâu. So với nhóm BC, mật độ quang trung bình của gen FasL ở nhóm MC tăng đáng kể (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Kết quả đã chứng minh rằng CD và WCD có thểgây ra apoptosis trong các tế bào viêmvà giảm tổn thương tuyến thượng thận bằng cách thúc đẩy sự biểu hiện của protein FasL và liên kết với protein Fas, kích hoạt protein caspase-3 và kích hoạt một chuỗi caspase. Hiệu quả của nhóm WCD-HD là tốt nhất.

3.3. Xác định chức năng miễn dịch

3.3.1. Chỉ số cơ quan miễn dịch

So với nhóm BC, hệ số tuyến ức và chỉ số lách của nhóm MC giảm đáng kể (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Phát hiện tập hợp tế bào lympho T trong máu ngoại vi

Tỷ lệ tế bào CD4+ ở góc phần tư phía trên bên trái và tế bào CD8+ ở góc phần tư phía dưới bên phải trong BC và mỗi nhóm thuốc đều cao hơn tỷ lệ ở nhóm MC. So với nhóm BC, tỷ lệ CD4+ThCD8+ giảm đáng kể ở nhóm MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Xác định hàm lượng IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α và IFN-C trong huyết thanh

Hình 8 cho thấy so với nhóm BC, nồng độ IL-6, TNF- và IFN-c tăng đáng kể (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Kết quả thí nghiệm quan sát kính hiển vi mô Lymus

Hình 9 cho thấy ở nhóm BC có một số lượng lớn tế bào lympho. Tế bào lympho và hồng cầu lưới được sắp xếp lỏng lẻo ở trung tâm với các tế bào tuyến ức hình tròn hoặc hình bầu dục nằm rải rác. Không có hoại tử, không có thâm nhiễm tế bào viêm và không có biến đổi bất thường.

Nhóm MC cho thấy một lượng lớn mô hoại tử dạng lympho, với sự sắp xếp rối loạn của các tế bào lympho và hồng cầu lưới ở trung tâm. Tuyến ức hình tròn hoặc bầu dục biến mất, thoái hóa hoặc hoại tử tế bào lớn, thâm nhiễm tế bào viêm với những thay đổi bệnh lý bất thường.

Ở nhóm CD, các đặc điểm hình thái tế bào lympho đã trở lại bình thường, sự sắp xếp của các tế bào lympho trung tâm và hồng cầu lưới gần như bình thường. Các tế bào tuyến ức hình tròn hoặc hình bầu dục đã phục hồi nhưng vẫn còn một số lượng nhỏ tế bào lympho thoái hóa hoặc hoại tử và các tế bào viêm xâm nhập.

Ở nhóm WCD và nhóm PC, các đặc điểm hình thái của tế bào lympho được sửa chữa tốt hơn. Tế bào lympho và hồng cầu lưới ở trung tâm xếp thẳng hàng, tế bào tuyến ức hình tròn hoặc hình bầu dục hầu như bình thường, tuy nhiên vẫn còn một số ít tế bào lympho xâm nhập và thoái hóa.

3.4. Biểu hiện gen protein CaM

Giá trị RQ (CaM mRNA -actin mRNA) được xem xét để kiểm tra sự biểu hiện của CaM mRNA. RQ của nhóm BC là 1. Biểu hiện của CaM mRNA ở vùng dưới đồi trong nhóm MC tăng đáng kể (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Thảo luận

Dược điển Trung Quốc [2] ghi nhận rằng CD và WCD có thể được sử dụng trong phòng khám như những loại thuốc sắc chính. Sau khi được hấp với rượu gạo,tác dụng chống lão hóa và bổ thận dươngđã được nâng cao. Thông qua UPLC-QqQ-MS, chúng tôi đã phát hiện được sự thay đổi về lượng của cơ sở vật chất hóa học trong quá trình hấp rượu gạo. Iridoid glycoside không ổn định và hàm lượng của các glycoside này giảm, thậm chí không thể phát hiện được. Hàm lượng của phenyletanol glycoside cũng thay đổi, điều này có thể gây ra những thay đổi về dược lực học và tác dụng lâm sàng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mô hình suy thận dương cổ điển được nhân rộng bằng cách tiêm corticosterone dưới da [19]. Quá liều corticosterone có thể ức chế sự tiết CRH ở vùng dưới đồi. Trong khi đó, sự tiết ACTH cũng bị ức chế. Mức độ hormone vỏ thượng thận giảm và do đó chức năng của trục HPA bị giảm. Suy giảm chức năng của trục HPA là đặc điểm chung của tình trạng suy thận dương [20]. Khi đó chuột có hiện tượng “suy kiệt” và triệu chứng phù hợp với bệnh thận dương suy trên lâm sàng.

Ở nhóm MC, mức CRH, ACTH, T và CORT trong huyết thanh chuột giảm đáng kể (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Việc điều chỉnh tỷ lệ các thành viên họ Bcl-2 là một trong những cơ chế cốt lõi mà FasThFasL làm trung gian cho con đường thụ thể tử vong và họ Bcl-2 điều chỉnh con đường ty thể [21]. Yếu tố ức chế apoptosis Bcl-2 và các yếu tố gây ra apoptosis, chẳng hạn như Bax, đều thuộc họ Bcl-2 [22]. Apoptosis của tế bào có thể được xác định bằng tỷ lệ tương đối giữa các yếu tố ức chế apoptosis và các yếu tố gây ra apoptosis [23]. Ty thể có chức năng là điểm kiểm tra trung tâm đối với nhiều dạng apoptosis [24]. Nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng CD-MD và WCD có thể suy ra biểu thức của Bax và tăng Bcl-2 lêncải thiện tình trạng suy thận dương. Fas là thụ thể tử vong chính gây ra apoptosis bằng cách thắt với phối tử Fas (FasL) [25]. Biểu hiện của Fas và FasL ở nhóm MC tăng lên, trong khi biểu hiện này tăng đáng kể ở nhóm WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Suy giảm chức năng miễn dịch là một trong những biểu hiện quan trọng của suy thận dương [28]. Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy chỉ số lách và tuyến ức của nhóm WCD-MD hồi phục rõ rệt (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Trục HPA là hệ thống điều hòa quan trọng nhất vì nó điều chỉnh sự tiết glucocorticoid và hệ thống nội tiết để duy trì chức năng bài tiết của vỏ thượng thận [32]. Sự biểu hiện quá mức của CaM mRNA ở mô vùng dưới đồi có liên quan đến sự thiếu hụt thận dương. CD và WCD có thể chặn các kênh canxi, ức chế sự biểu hiện CaM mRNA ở vùng dưới đồi và làm giảm dòng canxi đi vào, do đó làm giảm hoạt động của phức hợp CaM.

Sự hình thành thận dương hư là một quá trình phát triển bệnh mãn tính. Thận không còn là một khái niệm giải phẫu thuần túy nữa mà nó là một thuật ngữ chung cho hệ thống miễn dịch thần kinh nội tiết và hệ thống sinh dục. Mạng lưới miễn dịch thần kinh nội tiết (NEI) là một hệ thống điều tiết tích hợp quan trọng [33]. CD và WCD có thể điều chỉnh chức năng của trục HPAT và cải thiện khả năng phục hồi của tình trạng suy thận dương. Kết quả này cung cấp cơ sở thực nghiệm cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh thận dương trên lâm sàng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%