Nghiên cứu về tác dụng của acteoside (một thành phần hoạt chất trong sa mạc cistanche) trên NAFLD bằng cách tạo ra autophagy

Tóm tắt:

 

Khách quan:Để khám phá chức năng gây tự động của thành phần hoạt động acteoside (ACT) ở sa mạc cistanche và ảnh hưởng của nó đối với bệnh gan nhiễm mỡ không cồn (NAFLD).

Phương phápĐể sử dụng echinacoside và hoạt động như các đối tượng nghiên cứu, 1 0 0 μmol/L Act và echinacoside (ECH) đã được kết hợp với chất ức chế autophagy-lysosome bleomycin A1 để điều trị can thiệp. Miễn dịch protein đã được sử dụng để phát hiện mức độ biểu hiện tương đối của vi ống protein đánh dấu autophagy liên quan đến protein ánh sáng 1 (LC 3- ii). Các tế bào HepG2 đã được can thiệp với các nồng độ khác nhau của Act in vitro và khả năng tồn tại của tế bào được phát hiện bằng phương pháp muối tetrazolium. Trong can thiệp vitro của các tế bào HepG2 với nồng độ Act khác nhau kết hợp với balofloxacin A1 và phát hiện LC 3-} ii. Một mô hình NAFLD được xây dựng trong ống nghiệm với can thiệp thuốc đã được sử dụng để nhuộm các giọt lipid bằng phương pháp nhuộm màu đỏ O và phát hiện mức độ triglyceride nội bào. Quan sát sự định vị của protein LC3 và các giọt lipid thông qua công nghệ miễn dịch huỳnh quang. Kết quả Act có thể gây ra đáng kể sự tự kỷ trong các tế bào HepG2 và mức độ biểu hiện của protein LC 3-} ii được tăng đáng kể so với nhóm đối chứng (được xử lý bằng Act) (1.36 ± {{19}. tương ứng), với ý nghĩa thống kê (P0.05). 50 μmol/L hoạt động gây ra sự tự kỷ đáng kể trong các tế bào HepG2 và mức độ biểu hiện của protein LC 3- ii đã tăng đáng kể (lần lượt là 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Mức TG của các tế bào HepG2 trong nhóm can thiệp ACT (19,11 ± 1,68) thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình tế bào in vitro NAFLD (34,15 ± 1,90) và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P P (P P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Từ khóa:Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu;Cistanche sa mạc;Acteoside; Autophagy

 

TCM Herb Cistanche để điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD)

Nhấp vào ảnh để biết thêm chi tiết

 

Trong vài thập kỷ qua, chất béo không cồnBệnh gan(NAFLD) đã trở thành phổ biến nhấtBệnh gan mãn tính, với tỷ lệ lưu hành toàn cầu khoảng 25% dân số trưởng thành và được coi là có liên quan chặt chẽ với hội chứng chuyển hóa [1]. Mặc dù khả năng các biến chứng liên quan đến gan ở bệnh nhân NAFLD dưới 10%, NAFLD là yếu tố nguy cơ đối với các bệnh liên quan đến gan như xơ gan và ung thư gan nguyên phát, gây gánh nặng kinh tế lớn cho bệnh nhân [2-5]. Mặc dù sự chú ý ngày càng tăng đối với NAFLD, NAFLD là một bệnh mãn tính quan trọng đã không nhận được sự chú ý đầy đủ. Do đó, sự hiểu biết sâu hơn về sinh bệnh học của NAFLD và việc tìm kiếm các chiến lược điều trị hiệu quả đã trở thành những vấn đề cấp bách cần được giải quyết [6-7].

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng autophagy tế bào đóng vai trò quan trọng trong sinh lý và bệnh lý gan [8]. Rối loạn chức năng hoặc rối loạn chức năng tự độngBệnh gan liên quan đến rượu[9], NAFLD [10], viêm gan nhiễm mỡ không do rượu [11] và ung thư biểu mô tế bào gan [12]. Các đặc điểm bệnh lý của NAFLD là sự lắng đọng quá mức của triglyceride (TG) và các giọt lipid trung tính khác (LD) trong tế bào gan dưới sự kích thích không do rượu. Đối với gan, hai con đường chính điều chỉnh quá trình dị hóa của các LD này là lipolysis và autophagy.
Con đường lipolysis được điều chỉnh bởi các lipase trung tính tế bào chất, chẳng hạn như lipase nhạy cảm với hormone và lipase TG adipose. Trong con đường lipoautophagy tương ứng, LDS có thể được sử dụng một cách có chọn lọc bằng cách tuyển dụng trực tiếp các protein liên quan đến autophagy để tạo thành autophagosome, và sau đó LDS được gói gọn bởi autophagosome được cung cấp thêm cho lysosome và phân hủy bởi lipase axit trong lysosome. Do đó, kích hoạt lipoautophagy trong tế bào gan đã trở thành một chiến lược hiệu quả để phòng ngừa và điều trị NAFLD.
Cistanche sa mạc là một loại thuốc thảo dược Trung Quốc quý giá đã được sử dụng rộng rãi trong thực hành lâm sàng trong các công thức y học cổ truyền Trung Quốc. Đồng thời, nó đã được sử dụng từ lâu như một bổ sung thực phẩm sức khỏe. Cistanche sa mạc chứa nhiều thành phần hoạt tính sinh học, trong đó quan trọng nhất là Cistanche sa mạc phenylethanol glycosides. Là đại diện của phenylethanoid glycoside, echinacoside (ECH) và verbascoside (ACT) đã được báo cáo là có nhiều hoạt động sinh học quan trọng, như chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch và bảo vệ gan [13]. Về mặt bảo vệ gan, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng ECH có thể bảo vệ gan bằng cách giảm các chất trung gian gây viêm, ức chế biến đổi yếu tố tăng trưởng và giảm mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến xơ gan. ACT có tác dụng bảo vệ đáng kể đối với tổn thương gan do hóa học và thuốc, như rượu, carbon tetrachloride và lipopolysacarit. ACT làm giảm stress oxy hóa gây ra bởi các hóa chất độc hại, loại bỏ oxy phản ứng tích lũy trong gan và làm giảm nồng độ malondialdehyd. Đồng thời, nó làm tăng đáng kể hoạt động của superoxide gan và giảm hàm lượng glutathione, và cải thiện đáng kể tổn thương mô bệnh học và apoptosis. Tuy nhiên, không có báo cáo tài liệu liên quan nào về việc liệu phenylethanoid glycoside của sa mạc cistanche có liên quan đến quá trình autophagy trong việc bảo vệ gan. Dựa trên điều này, nghiên cứu này đã sử dụng các phương pháp sinh học tế bào thông thường và mô hình tế bào in vitro để khám phá sơ bộ tác dụng gây ra autophagy của cistanche sa mạc phenylethanoid glycoside và khám phá các chức năng dược lý có thể của nó, nhằm mục đích cung cấp một cơ sở khoa học để phát triển thuốc trong tương lai.

 

1 vật liệu và phương pháp

1.1 Vật liệu

1.1.1 Đối tượng nghiên cứu ECH và ACT được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu.

1.1.2 Vật liệu Các tế bào Hepg2 được mua từ Vũ Hán Khoa học Life Co., Ltd. Trypsin đã được mua từ Công ty Hyclone, Hoa Kỳ, huyết thanh của thai nhi (số lô: 04-002-1 A) đã được mua từ BI Company, Israel, Penicillin/Streptomycin (số Batch: SV30010.01) . Chất ức chế autophagy-lysosome bafilomycin A1 (BAFA1, số lô: TLRL-BAF1) đã được mua từ Invitrogen, Hoa Kỳ; Công ty kích hoạt autophagy rapamycin (số lô: S17098) đã được mua từ Thượng Hải Yuanye Biotech Co., Ltd., Trung Quốc; Chuỗi ánh sáng liên quan đến microtubule 1 chuỗi ánh sáng 3 (LC3, số lô: L7543, loài: Thỏ, Tỷ lệ pha loãng: 1: 1 000) và -actin (số lô: ZRB1312 Kháng thể thứ cấp có nhãn peroxidase (số lô: 4010-05, loài: Dê chống rabbit, tỷ lệ pha loãng: 1: 1 000) đã được mua từ Southern Biotech, USA Company Công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ và Bodipy 493/501 (số lô: D3922) đã được mua từ Công ty Invitrogen, Hoa Kỳ.

 

1.2 Phương pháp

1.2.1 Nuôi cấy tế bào

Các tế bào HepG2 được nuôi cấy trong môi trường glucose cao Eagle High biến đổi của Dulbecco chứa 10% huyết thanh bò bào thai, penicillin 100 U/ml và streptomycin 100 UG/mL trong vườn ươm carbon Dioxide 37 độ, 5%. Khi hợp lưu tế bào đạt 85%, văn hóa nhóm, mạ, can thiệp và các hoạt động khác được thực hiện.

 

1.2.2 Phát hiện miễn dịch protein

1.2.2.1 Đạo luật và điều trị ECH

LC 3- ⅱ Mức độ biểu hiện protein trong các tế bào HepG2 BAFA1, như một chất ức chế bơm proton, có thể khiến LC 3- ⅱ protein để tổng hợp với số lượng lớn trong các tế bào, do đó khuếch đại khả năng cảm ứng autophagy. Do đó, việc sử dụng kết hợp BAFA1 có thể được sử dụng như một hệ thống giám sát tự phát để đánh giá khả năng cảm ứng autophagy. Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit đã được chuyển sang các đĩa nuôi cấy tế bào 3,5 cm để nuôi cấy qua đêm. Đạo luật 100 μmol/L, ECH và BAFA1 đã được sử dụng để can thiệp trong 12 giờ. Các tế bào được rửa bằng dung dịch đệm phosphate được làm mát sẵn (PBS) và ngay lập tức bị ly giải trong bộ đệm ly giải protein RIPA trong 10 phút. Chất nổi trên mặt được ly tâm và tổng nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm nồng độ protein axit bicinchoninic. Sau khi định lượng với bộ đệm natri dodecyl sulfate, mẫu được làm nóng ở 95 độ trong 10 phút để làm biến tính protein. Sau đó, 30 μl mẫu được lấy bằng micropipette và được điện di trên gel polyacrylamide.
Sau khi điện di, protein được chuyển từ gel sang màng nitrocellulose, bị chặn với 1 0% sữa qua đêm, được ủ với một kháng thể chính cụ thể ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, rửa bằng dung dịch đệm phosphate có chứa 0,5% Triton. Phương pháp ECL đã được sử dụng để phát triển màu sắc. Họ được đặt thành nhóm kiểm soát trống, nhóm rapamycin, ECH Group, Act Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 GROUP và ACT+BAFA1 GROUP.

 

1.2.2.2 Nồng độ ACT khác nhau đã can thiệp vào mức độ biểu hiện của LC 3- ⅱ Protein trong các tế bào Hepg2

Các tế bào HEPG2 tăng trưởng logarit đã được chuyển sang các đĩa nuôi cấy tế bào 3,5 cm để nuôi cấy qua đêm, và ACT 25, 50 và 100 μmol/L kết hợp với BAFA1 đã được sử dụng để điều trị can thiệp trong 12 giờ và mức độ biểu hiện của LC 3-} Nhóm kiểm soát (nhóm CON, kiểm soát trống), nhóm đói (nhóm STA, tế bào HEPG2 điều trị đói), nhóm ACT 25, 50 và 100 μmol/L và BAFA1 kết hợp với nhóm ACT 25, 50 và 100 μmol/L đã được thiết lập.

1.2.3 Phương pháp MTT để phát hiện tỷ lệ sống của các tế bào Hepg2 được điều trị với các nồng độ ACT khác nhau trong 24 và 48 giờ
Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit được cấy trong một tấm giếng 96- với mật độ cấy vừa phải và nuôi cấy trong một máy ấp trong 12 giờ. 2 0, 40, 60, 80 và 100 μmol/L Act đã được thêm vào trong 24 và 48 h. Dung dịch MTT 0,5 mg/ml đã được thêm vào trong một môi trường tối và được ủ trong máy ấp trứng. Sau 4 giờ, chất nổi trên bề mặt đã bị loại bỏ, 100 μl dimethyl sulfoxide đã được thêm vào mỗi giếng và các tế bào được lắc trong một máy lắc nhiệt độ không đổi ở 37 độ trong 10 phút. Giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 490nm được phát hiện bằng dấu hiệu enzyme và tỷ lệ sống của tế bào đã được tính toán.

 

1.2.4 Xây dựng in vitro của mô hình tế bào NAFLD

Một trọng lượng nhất định của axit palmitic (PA) đã được cân và hòa tan hoàn toàn trong một khối lượng isopropanol nhất định để chuẩn bị dung dịch gốc 100 mmol/L PA, sau đó được chia và lưu trữ trong tủ lạnh -20 để sử dụng sau. Dung dịch gốc PA được pha loãng đến 100 μmol/L bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh và 1% albumin huyết thanh bò không có axit béo 1% đã được thêm vào. Các tế bào được ủ ở 37 độ trong 3 giờ để chuẩn bị dung dịch cảm ứng. Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit đã được chuyển sang đĩa nuôi cấy tế bào 3,5 cm ở mật độ thích hợp để nuôi cấy qua đêm, và sau đó dung dịch cảm ứng được chuẩn bị được sử dụng để can thiệp.

 

1.2.5 can thiệp ACT NAFLD mô hình tế bào in vitro phát hiện TG và nhuộm màu đỏ O

 

1.2.5.1 Phát hiện TG

Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit đã được chuyển sang đĩa nuôi cấy tế bào 3,5 cm để nuôi cấy theo nhóm kiểm soát trống, nhóm mô hình và nhóm can thiệp ACT. Nhóm mô hình được tạo ra với dung dịch cảm ứng 100 μmol/L PA và nhóm can thiệp ACT được tạo ra với dung dịch cảm ứng 100 μmol/L PA và ACT 50 μmol/L đã được thêm vào cùng một lúc. Thời gian can thiệp là 24 giờ. Nhẹ nhàng loại bỏ môi trường nuôi cấy, từ từ rửa bề mặt tế bào bằng PBS được làm mát sẵn một lần, thêm 100 μl/đĩa của dung dịch ly giải RIPA được làm mát sẵn, hoàn toàn lyse trên băng trong 15 phút, ly tâm ở 4 độ và 12 000 r/phút Các hướng dẫn bộ TG, và cuối cùng sửa mức TG trên mỗi mg protein.

1.2.5.2 Dầu màu đỏ o nhuộm màu

Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit đã được chuyển sang đĩa nuôi cấy 3,5 cm được bao phủ bởi một lớp phủ vô trùng để nuôi cấy qua đêm. 100 μmol/L Pa đã tạo ra các tế bào để tạo thành các giọt lipid. Đồng thời, hành động 50 μmol/L đã được thêm vào để can thiệp trong 24 giờ.
Các slide tế bào được thu thập, rửa 3 lần bằng PBS được làm mát sẵn, cố định với 4% formaldehyd ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, rửa bề mặt tế bào bằng PBS, thêm dung dịch nhuộm màu đỏ O được chuẩn bị chụp ảnh dưới kính hiển vi.

 

1.2.6 Quan sát miễn dịch huỳnh quang của autophagosome và giọt lipid sau khi điều trị ACT

Các tế bào HepG2 trong giai đoạn tăng trưởng logarit đã được chuyển sang đĩa nuôi cấy 3,5 cm được bao phủ bởi một lớp phủ vô trùng để nuôi cấy qua đêm. 1 0 0 μmol/L Pa đã được sử dụng để tạo ra sự hình thành các giọt lipid trong các tế bào. Đồng thời, ACT đã được thêm vào để điều trị can thiệp trong 24 giờ. Các slide tế bào được thu thập, rửa 3 lần bằng PBS được làm mát sẵn, cố định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút với 4% formaldehyd, được thẩm thấu ở nhiệt độ phòng trong 15 phút với dung dịch đệm có vị trí 3 Một kháng thể thứ cấp có nhãn huỳnh quang cụ thể, được ủ ở nhiệt độ phòng và cách xa ánh sáng trong 1 giờ. Sau khi ủ kháng thể, các slide được rửa 3 lần bằng PBS, được đối chiếu bằng đầu dò đặc trưng của giọt lipid 493/503 ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, rửa bằng PBS và niêm phong bằng môi trường niêm phong chống phai tan, sấy khô trong không khí trong bóng tối, quan sát thấy bằng kính hiển vi laser. Nhóm kiểm soát trống, nhóm điều trị rapamycin và nhóm can thiệp ACT đã được thiết lập.

 

1.3 Phân tích thống kê

SPSS25. 0 Phần mềm thống kê đã được sử dụng để phân tích dữ liệu. Dữ liệu định lượng được biểu thị là x ± s. Phân tích một chiều của phương sai và thử nghiệm LSD-T đã được sử dụng. P<0.05 was considered statistically significant.