Ức chế tổn thương thận liên quan đến thận sau cấy ghép bằng cách sử dụng PrC mới -210 chất diệt hạt triệt để miễn phí ở chuột
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2, Maya M. Coumbe Gitter3và William E. Fahl1,3,*
Trừu tượng:
Allograftquả thậncấy ghép, gây ra sự đào thải qua trung gian tế bào và kháng thể của vật chủ đối vớiquả thận, là nguyên nhân chính gây tổn thương thận trong quá trình cấy ghép. Tại đây, chúng tôi đã hỏi liệu PRC -210 có ngăn chặn tổn thương được thấy trong các ca cấy ghép thận allograft hay không. Thận chuột Brown Na Uy (BN) được tưới máu tại chỗ (UW Solution) có hoặc không thêm 30 mM PrC -210 và sau đó được cấy ngay vào chuột Lewis (LEW). 20 giờ sau, thận BN được cấy ghép và huyết tương LEWrat được phân tích.Quả thậnmô học và nồng độ thận / huyết thanh của một số cytokine liên quan đến bệnh viêm tinh hoàn, được đo để đánh giá bệnh lý thận liên quan đến sự không phù hợp và hiệu quả bảo vệ của PrC -210. Hai mươi giờ sau khi cấy ghép allograft: (i) tổn thương ống thận theo mô học đáng kể và thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân được thấy ở thận allograft; (ii)quả thậncác chỉ số chức năng (creatinine và BUN) đã tăng lên đáng kể; (iii) những thay đổi đáng kể trong các cytokine quan trọng, tức là, TIMP -1, TNF-alpha và MIP -3 A / CCL20, và mức caspase hoạt hóa ở thận đã được nhìn thấy. Ở PRC -210- thận được điều trị và chuột nhận, (i) tổn thương mô học thận (Điểm Banff) và thâm nhiễm đơn nhân giảm xuống mức nền không được điều trị; (ii) creatinine và BUN giảm đáng kể; và (iii) thay đổi caspase và cytokine hoạt hóa đã giảm đáng kể, một số thay đổi ở mức nền. Tóm lại, các kết quả cho thấy PrC -210 có thể cung cấp khả năng bảo vệ cơ quan có thể áp dụng rộng rãi cho nhiều điều kiện cấy ghép toàn bộ; nó có thể bảo vệ thận được cấy ghép trong và sau tất cả các giai đoạn của quá trình cấy ghép — từ hiến tặng nội tạng, thông qua vận chuyển, cấy ghép lại và viêm sau phẫu thuật — để giảm thiểu tình trạng thải ghép cấp tính và mãn tính.
Kmắtwords: quả thậntất cả; đào thải thận; thiếu máu cục bộ
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com
sâm maca cistanche
1. Giới thiệu
Suy thận giai đoạn cuối gây ra hơn 1,2 triệu ca tử vong hàng năm trên toàn thế giới [1].Quả thậncấy ghép là phương pháp điều trị ưu tiên cho bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối. Hơn 90, {2}} ca ghép thận được thực hiện mỗi năm trên toàn thế giới.
Quá trình cấy ghép, bản thân nó, gây ra tổn thương tế bào và cơ quan đáng kể choquả thận, làm giảm khả năng tồn tại lâu dài của cơ quan. Ba sự xúc phạm chính đối với thận trong quá trình cấy ghép allograft là (i) tổn thương do oxy và nitơ phản ứng (ROS và RNS) gây ra trong quá trình thiếu máu cục bộ lạnh ('bảo quản lạnh) [2], (ii) tổn thương do ROS gây ra khi cấy ghép ('tổn thương tái tưới máu') [3], và (iii) viêm gia tinh sau cấy ghép, gây ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh và đào thải qua trung gian kháng thể (ABMR) [4].
Bạch cầu trung tính và đại thực bào di chuyển vào vùng cấy ghép bị tổn thương trong vòng 6 giờ sau khi được tái tưới máu và kích thích tổng hợp chemokine trong các tế bào đuôi gai thường trú, sau đó kích hoạt tế bào lympho T và tuyển dụng các tế bào miễn dịch thích ứng. Một khi các tế bào miễn dịch này thâm nhập vào tế bào biểu mô ống lượn gần, chúng tạo ra myeloperoxidase trong bạch cầu trung tính và nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase trong đại thực bào, cả hai đều góp phần tạo ra các gốc tự do tại chỗ. Các quá trình viêm này dẫn đến sự kích hoạt con đường bổ thể và tái tạo và ly giải tế bào hơn nữa trongquả thậnallograft [5] .ABMR có thể xảy ra do một trong hai hoặc cả hai, kháng thể được định dạng sẵn chống lại mảnh ghép hoặc thông qua sự phát triển de novo của kháng thể đặc hiệu cho người hiến (dnDSA) [5–7]. Phản ứng cấp tính (phút / ngày), chuyển sang mãn tính (ngày / tuần), phản ứng viêm trong thận, với sự sản xuất liên tục của ROS và các cytokine gây viêm, có thể tạo ra một phản ứng nghiêm trọng, tự kéo dài gây raquả thậnsuy nội tạng.
Để hiểu rõ hơn về các con đường tế bào và phân tử liên quan đến cơ chế bệnh sinh củaquả thậnviêm và đào thải allograft, chúng tôi đã phát triển và mô tả một mô hình chuột mô phỏng hầu hết các tiêu chí lâm sàng của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, ABMR và mất cơ quan thận [8]. Mô hình này đã được sử dụng để đánh giá một số chiến lược ghép sau allograft mới.
Hai cách tiếp cận hiện được thừa nhận để giảm phản ứng miễn dịch cấp tính và dài hạn chống lạiquả thậnallograft là: (i) để tăng cơ hội tìm được người hiến tặng kết hợp chéo và (ii) để loại bỏ các kháng thể đã có từ trước chống lạiquả thậnallograft sử dụng các giao thức giải mẫn cảm [9,10].
Trong công việc được mô tả trong bản thảo này, chúng tôi đã hỏi liệu cách tiếp cận thứ ba để ngăn chặn mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm tinh hoàn cấp tính và lâu dài có mang lại lợi ích hay không. Chúng tôi đã sử dụng công cụ thu dọn gốc tự do, tác dụng tức thì, PRC -210, cho cả allograft được cấy ghépquả thậnvà đối với chuột nhận, để xác định xem liệu thiệt hại ROS liên quan đến bệnh truyền nhiễm có thể được ngăn chặn hay không. Mặc dù khái niệm về việc ngăn chặn ROSin liên quan đến bệnh viêm tinh hoànquả thậncấy ghép không phải là mới, việc sử dụng PRC -210 ROSscavenger mới, có tác dụng tức thì ở đây. Cả việc nhặt rác ngay lập tức và mãn tính và làm bất hoạt các gốc tự do tạo ra và tạo ra, các gốc tự do trong allograft mới được cấy ghépquả thậnwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95% thiệt hại DNA trong các đối chứng không được bảo vệ [16]. Trong hai nghiên cứu cấy ghép thận trên động vật gặm nhấm trước đây [16,17], PRC -210 đã được chứng minh là ngăn chặn tổn thương thận do ROS gây ra trong (i) 30 giờ bảo quản lạnh [17] và (ii) tổn thương tái tưới máu khi cấy ghép [16 ] đến mức nền, do đó loại bỏ hai nguồn gây thương tích đáng kể cho thận được cấy ghép. Phân tử PRC -210 cũng đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn tổn thương do gốc tự do gây ra ở một số cơ sở cơ quan khác [15,18]. Do đó, chúng tôi đã giả thuyết rằng PrC -210 cũng có thể bảo vệ allograft chống lại stress oxy hóa được tạo ra bởi CẢ (i) quá trình đào thải qua trung gian tế bào và (ii) tạo ra các gốc tự do như một sản phẩm phụ.
Để khám phá giả thuyết này, chúng tôi đã phát triển một mô hình chuột mới tránh gây ra các sự kiện thiếu máu cục bộ và tái tưới máu chính và sử dụng PrC -210 cả trước và sau khi cấy ghép. Thận của chuột nâu được rửa sạch bằng dung dịch UW có chứa PrC -210 và ngay lập tức được cấy vào người nhận là chuột Lewis đồng vận. Thời gian thiếu máu cục bộ lạnh hầu như được loại bỏ. Ngay lập tức que cấy sau, và trong 8 giờ sauquả thậncấy ghép, chuột nhận được tiêm PrC -210 toàn thân với liều lượng cho phép liên tục quét gốc tự do trong vật được cấyquả thận. Thận và huyết tương được cấy ghép sau đó được thu hoạch 20 giờ sau khi cấy ghép để cho phép đo lường cả PrC -210- được cho là (i) ức chế các sản phẩm phụ gây viêm và (ii)quả thậnsự bảo vệ.
sâm maca cistanche
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Loài vật
Chuột Lewis và BN đực trưởng thành (200–250 g) được mua từ Envigo (Indian-napolis, IN, USA) và được đưa vào cơ sở chăm sóc động vật tại Đại học Wisconsin ở Madison, WI, Hoa Kỳ. Tất cả các thủ tục được thực hiện theo Chính sách Chăm sóc và Sử dụng Động vật tại Đại học Wisconsin. Các nhân viên chăm sóc động vật thực hiện việc duy trì sức khỏe động vật, bao gồm cả cái chết của động vật, nhiệt độ phòng, chu kỳ sáng / tối 12 giờ và vệ sinh lồng, cùng với các nhiệm vụ vệ sinh khác. Lấy thức ăn và nước uống tùy ý. Nghiên cứu này đã được phê duyệt một cách khách quan bởi Trường Y khoa và Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Tổ chức Y tế Công cộng tại Đại học Wisconsin (Giao thức Động vật # M005204). Tất cả các nhóm đều có 4–6 con vật.
2.2. Vật liệu
Tổng hợp PrC -210 aminothiol HCl, một phân tử tiền lâm sàng, được mô tả riêng biệt [19,20]. PrC -210 Các tinh thể HCl (3- (metylamino) -2- (metyl monometyl) propan -1- thiol) được lưu trữ trong môi trường nitơ ở -20 ◦C, và thậm chí với thông thường rã đông, sử dụng và tái bảo quản, PrC tinh thể -210 hoàn toàn ổn định trong hơn 4 năm bằng phân tích khối phổ. Các thuốc thử hóa học khác được lấy từ Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Giải pháp Bảo quản Nội tạng UW được mua từ Bridge to Life, Columbia, SC, Hoa Kỳ.
2.3. Quy trình phẫu thuật và thí nghiệm
Quy trình cấy ghép được sử dụng trong các thí nghiệm này được thể hiện trong Hình 1. Ở chuột hiến tặng BN, sau khi thắt đôi động mạch chủ, thắt động mạch và tĩnh mạch thận phải, và phẫu thuật cắt tĩnh mạch thận trái, chuột trái.quả thậnđược truyền tại chỗ bằng cách sử dụng 5 mL Dung dịch UW ở nhiệt độ phòng (trong khoảng thời gian 15 giây). Nước hoa chỉ là Giải pháp UW (cho nhóm "0 h" và "2 0 h Không điều trị") hoặc Giải pháp UW mà PrC kết tinh -210, để đạt được 30 mM [17], đã được thêm vào, hòa tan ngay lập tức, và sau đó điều chỉnh pH về pH dung dịch UW ban đầu là 7,4 bằng cách thêm 0,0619 µL 5N NaOH vào mỗi µmol muối PrC -210 HCL (FW: 220). Thời gian bán hủy của PrC -210 thiol (dạng hoạt động) là khoảng 3,5 giờ trong các dung dịch pH sinh lý như UW Solution và máu người [14]. Tiếp theo tưới máu tại chỗ, BN bên tráiquả thậnđã được phẫu thuật cắt bỏ và sau đó được khâu lại bằng cách nối cùn mạch và niệu quản vào vị trí thận trái bị bỏ trống của chuột nhận LEW. LEW phù hợpquả thậnđã được kiện tụng và loại bỏ ngay lập tức trước đó. Năm phút sau khi mổ đóng con chuột LEW, con chuột nhận được một liều PrC {{0}} toàn thân (121 ug PrC -210 HCl trên mỗi g trọng lượng cơ thể, tương đương với 0. 24 X Liều dung nạp tối đa) bằng cách tiêm trong phúc mạc. Như thể hiện trong sơ đồ Hình 1, con chuột cũng được tiêm các liều PrC -210 (0,24 MTD) vào màng bụng sau 4 giờ và thêm 8 giờ sau khi cấy ghép. Chuột đã được ăn thịt sau 20 giờ sau khi cấy ghép, vàthậnvà các mẫu huyết tương đã được thu thập để phân tích. Có ít nhất năm con chuột trong mỗi nhóm điều trị.
2.4. Đo BUN và Creatinin huyết thanh
BUN và creatinine được đo trong các mẫu huyết thanh bằng Công nghệ phân tích Catalyst One (Phòng thí nghiệm IDEXX, Westbrook, ME, Hoa Kỳ).
2.5. Thử nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme
Các thử nghiệm được thực hiện như được mô tả trong các giao thức bộ ELISA (Rat TIMP -1, Cat # RTM - 100; Rat MIP 3- A, Cat # DY540; Rat TNF-alpha, Cat # RTA { {5}}; Hệ thống R & D, Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Tóm lại, các dung dịch pha loãng của huyết tương chuột được thêm vào các đĩa tráng trước, ủ trong 2 giờ ở 37 ° C.Đặc điểm kháng thể liên hợp biotin cho protein xét nghiệm sau đó được thêm vào và ủ trong 1 giờ ở 37 ° C, rửa sạch, liên hợp với avidin Peroxidase cải ngựa được thêm vào, tiếp theo là rửa và bổ sung chất nền TMB. Phản ứng được ủ trong 10–30 phút, dừng lại bằng axit sulfuric và đọc ở bước sóng 450 nm.
2.6. Proteome Pro fi ler Rat Cytokine Array
Về cơ bản, các thử nghiệm đã được thực hiện như được mô tả trong giao thức sản phẩm. Brie y, huyết tương được ủ với màng nitrocellulose được phát hiện với các kháng thể bắt và kiểm soát. Sau khi ủ, màng được rửa sạch và ủ với streptavidin HRP. Trong một sai lệch so với giao thức, chúng tôi đã sử dụng SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Cat # 34094) để phát hiện hóa học, vì nó cho tín hiệu mạnh hơn. Các khối được hiển thị trên hệ thống tài liệu gel FotoDyne.
2.7. Mô học
Formalin- fi xed (10% formalin), nhúng paraf fi n,thậnđược cắt thành các phần 5 um. Các slide được khử sạch, được làm trong nước từ xylen thông qua một loạt etanol được phân loại thành nước, và sau đó được xử lý như mô tả bên dưới. Các trang trình bày được quét bằng vật kính 20- trong Máy quét Trang trình bày Bệnh học Kỹ thuật số Aperio. Tất cả các slide H&E đã được xem xét bởi Tiến sĩ Weixiong Zhong, MD, PhD, nhà nghiên cứu bệnh lý cấy ghép, và cho điểm đối với PTC, viêm cầu thận (g), viêm mạch (v) / viêm động mạch thân mật, kẽ trong hạch (I) và nhuộm C4d, theo Banff 2009 [21].
Một cách riêng biệt, các slide được chỉ định một số mù, và các hình ảnh kỹ thuật số không chồng chéo của các ống thận được chụp ở mặt phân cách giữa tủy và vỏ từ mỗi slide H / E. Cẩn thận để không bao gồm lumen mạch lớn và cầu thận. Định lượng lượng tử tự động của các pixel màu đỏ và xanh lam trong mỗi 10-quả thậnhình ảnh được thực hiện bằng cách sử dụng macro tùy chỉnh được viết trong phần mềm ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
truy cập ngày 13 tháng 4 năm 2021). Các điểm ảnh màu đỏ tái tạo độ dày hình ống gần bao gồm cả đường viền bàn chải. Các hạt nhân đã được định lượng tử trong kênh màu xanh lam. Tỷ lệ điểm ảnh hạt nhân màu xanh lam so với ống màu đỏ cung cấp Điểm số thâm nhập bắt đầu cho tế bào bạch cầu trong quá trình lọc sau khi cấy ghépthận. Điểm được tính trung bình và vẽ biểu đồ bằng Graphpad Prism.
2.8. Hoạt động Enzyme Caspase được kích hoạt
Hoạt động caspase 3 và 7 được kích hoạt trongquả thậncác supernat đồng nhất được xác định bằng cách sử dụng chất nền huỳnh quang Apo-ONE (Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ) [16]. Brie fl y, đã rã đôngthậnđược trộn với 8- lần dung dịch đệm ly giải dư thừa có chứa 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10% glycerol và được đồng nhất ở 4 О C trong 30 giây bằng máy đồng nhất mô Omni . Chất đồng nhất thận được ly tâm ở 4ОC (16, 000- g) trong máy vi ly tâm Eppendorf trong 20 phút. Các supernat được xét nghiệm ngay lập tức về hoạt động của caspase và hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn. Xét nghiệm caspase hoạt hóa được thực hiện như sau: 5 uL supernat (~ 40 ug protein supernat) được pha loãng đến tổng thể tích là 50 uL với dung dịch đệm ly giải ở trên, được trộn với 50 uL chất nền Apo-ONE chưa pha loãng trong giếng. của một đĩa 96 giếng màu đen, đục, để bắt đầu phản ứng trong 60 phút. Các tấm được lắc với tốc độ 200 vòng / phút ở 37 О C trong 60 phút. Sự phân cắt peptit cơ chất của DEVD caspase được đo bằng cách sử dụng đầu đọc tấm huỳnh quang BMG Clariostar ở bước sóng kích thích 499 nm và bước sóng phát xạ 521 nm. Một tiêu chuẩn caspase đã được đưa vào mỗi thử nghiệm.
2.9. Ty thể thận chuột
Phần ty thể tinh khiết được điều chế từ chuột đồng nhấtthậnbằng kỹ thuật ly tâm tiêu chuẩn [22]. Ti thể tinh khiết được lơ lửng trong 0. Đệm Tris HCl 15 M, pH 7,4.
Để xác định xem việc bổ sung PrC ngoại sinh {{0}} có ngăn chặn sự phân mảnh do ROS gây ra của DNA ty thể [22] hay không, trong thể tích phản ứng 25 uL (trong ống PCR), chúng tôi đã thêm: 1 {{29} } uL puri fi ed ti thể, pha loãng 5 uL PrC -210 hoặc nước (PrC -210 đã được thêm vào 10 phút trước khi tạo Fe cộng với ADP cộng với H2O2 ● OH) và 10 uL chứa FeCl2 (2,5 mM; FW: 127), muối natri adenosine 5 ′ -diphosphat (10 mM; FW: 427) và H2O2 (nồng độ cuối cùng là 0,003 phần trăm). Sau 20 phút ở 37 О C, 10 uL của phản ứng được trộn với 5 uL của thuốc nhuộm tải gel 6- chứa 0,3% SDS; Các ống được ngâm trong nước 60 О C trong 1 phút, 10 ul sau đó được nạp vào giếng gel agarose TAE 1%, và sau 60 phút ở 60 volt, gel được nhuộm màu và chụp ảnh. Tối thiểu ba lần lặp lại được thực hiện cho mỗi điểm khảo nghiệm để có thể so sánh thống kê.
2.10. Phân tích thống kê
Dữ liệu được biểu thị dưới dạng phương tiện cộng / 一 STDs. Bài kiểm tra t của học sinh được sử dụng để xác định sự khác biệt thống kê và giá trị p bằng phần mềm GraphPad Prism 7. 0 3. giá trị p nhỏ hơn 0,05 được coi là không đáng kể.
3. Kết quả
3.1. PrC -210 Ức chế bệnh lý liên quan đến thận
Lúc 20 giờ sau ghép, mô học của BN được cấy ghépthận(Hình 2A – D) được điều trị bằng UW Solution một mình cho thấy rõ điểm Banff tăng lên đối với viêm ống thông và viêm mao mạch màng bụng (mũi tên đỏ và vàng); tổng điểm bệnh lý được hiển thị trong bảng E. BNthậnđược tưới máu bằng PrC {{0}} có chứa UW Solution và nhận các liều PrC toàn thân trong phúc mạc sau cấy ghép -210 (Hình 2D) cho thấy rõ ràng là bị ức chế trong bệnh lý thận và giảm điểm Banff đối với viêm vòi trứng và phúc mạc viêm mao mạch bằng điểm Banff của nhóm BN kiểm soát "0 h" (Hình 2E). Việc quản lý PrC -210 làm giảm đáng kể cả dấu hiệu tổn thương thận creatine (p=0. 032) và BUN (p=0. 046).
3.2. Mức độ Caspase được kích hoạt trong thận sau cấy ghép
Mức caspase được kích hoạt trong BNquả thậnđồng nhất đã giảm đáng kể trong allograft BNthậnkhông tiếp xúc với điều trị PrC {{0}} trong 20 giờ sau khi cấy ghép (Hình 5). Tưới máu cho thận BN bằng PrC -210- chứa UW Solution và cấy ghép vào chuột Lewis đã nhận liều PrC -210 toàn thân dẫn đến hoạt động caspase được kích hoạt tương tự như hoạt động được thấy trong thận kiểm soát "0 giờ".
3.3. Mức độ Cytokine gây viêm sau khi BN suy thận
Trong các thử nghiệm sàng lọc,quả thậnđồng nhất các siêu phẩm tặng từ 0 giờ kiểm soát và 20 giờ Không điều trịthậnđã được sàng lọc với mảng cytokine Proteome Pro 29 để phát hiện các mức độ biểu hiện cytokine và chemokine đã bị thay đổi, liên quan đến ammation, 20 giờ sau khi cấy ghép. Như thể hiện trong hai hình in 6microarray, các thay đổi đã được nhìn thấy trong TIMP -1, TNF-alpha và MIP -3 a / CCL20. Các đĩa ELISA riêng lẻ sau đó được sử dụng để định lượng những thay đổi này trong huyết thanh và đồng nhất của thận, hiện bao gồm cả những con chuột được điều trị bằng PrC -210. Cả hai mức TIMP -1 và TNF-alpha đều tăng sau 20 giờ sau khi cấy ghép, và trong cả hai trường hợp, mức của chúng đều giảm khi có PrC -210 (Hình 6A – C). Mức MIP -3 a / CCL20 được tăng lên ở 20 giờ, nhưng chúng tăng cao hơn đáng kể ở những con chuột được điều trị bằng PrC -210- (Hình 6D).
3.4. PrC -210 Bảo vệ ty thể của thận chuột
Duy trì chức năng ti thể trong và sau đóquả thậncấy ghép là cần thiết cho sự tồn tại của cơ quan được cấy ghép. ROS được tạo ra trong quá trình thiếu máu cục bộ liên quan đến cấy ghép, thiếu máu cục bộ tái tưới máu, và sau khi cấy ghép trong cơ thể đều có thể ảnh hưởng đến hoạt động và sự sống còn của ty thể thận. Do vai trò quan trọng của ty thể, chúng tôi đã phân lập ty thể từ thận chuột và xác định xem liệu PrC -210 ở nồng độ dược lý có thể đạt được có thể bảo vệ các bào quan này khỏi sự xúc phạm ROS hay không.
Trong Hình 7, chuột thuần chủngquả thậnti thể được ủ với máy tạo ● OH [23]. Sau phản ứng ngắn gọn, chúng tôi thấy sự phân mảnh ROS đáng kể của DNA ty thể thận chuột. Sau sự xúc phạm ROS, một phần nhỏ của ty thể được hòa tan trong dung dịch đệm tải gel chứa SDS, và DNA của ty thể được tách ra và "định kích thước" bằng cách sử dụng sắc ký gel agarose (Hình 7). Sự xúc phạm ROS rõ ràng đã làm giảm kích thước trung bình của ADN ti thể thận chuột (làn b) và việc bổ sung PrC -210 vào ti thể đã ngăn chặn sự đứt gãy ADN (làn c – g) trong PrC -210 cách thức phụ thuộc vào nồng độ.
sâm maca cistanche
4. Thảo luận
Allograftquả thậncấy ghép, gây ra sự đào thải tế bào chủ bẩm sinh và qua trung gian kháng thể của thận, là một yếu tố chính góp phần vào ngắn hạn và dài hạnquả thậntổn thương trong quá trình cấy ghép, và chức năng ghép bị trì hoãn liên quan được thấy ở tới 50 phần trăm các quả thận được cấy ghép. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này để xác định xem liệu PrC -210 có hiệu quả trong việc ngăn chặn mức độ nghiêm trọng của tổn thương gây ra sau khi ghép thận allograft ở mô hình chuột, loại bỏ phần lớn thời gian thiếu máu cục bộ cấy ghép và stress oxy hóa liên quan. Giả định của chúng tôi là cách tiếp cận này sẽ cho phép chúng tôi thấy được tác động của PrC -210 đối với sự xúc phạm sau cấy ghép trong tình trạng xúc phạm cơ thể với sự can thiệp của thiếu máu cục bộ tối thiểu.
Sự gia tăng TNF-alpha và lượng đơn nhân đáng kể trong màng lọc chứng tỏ rằng ghép thận allograft gây ra tình trạng cấp tính rõ rệt trong 20 giờ sau khi cấy ghép, và điều này tương quan với sự tổn thương của các tế bào ống thận được thấy trongquả thậnmô học (Điểm Banff). TNF-alpha chủ yếu được sản xuất bởi các đại thực bào được hoạt hóa và là một protein truyền tín hiệu tế bào liên quan đến quá trình cấp tính trong quá trình fl ammation. Nó có liên quan chặt chẽ với cơ chế bệnh sinh của sự đào thải allograft cấp tính và mãn tính [24].
Ngược lại với những kết luận trên ở BN không được điều trịthận, PrC -210 được đưa ra như một phần của Giải pháp UW và được sử dụng hệ thống ở chuột sau khi cấy ghép làm giảm cả mức TNF-alpha và tế bào đơn nhân trong thận, cả hai đều là dấu hiệu của giảm cấp tính ở chuột. PrC -210 làm giảm tổn thương thận như được thấy trong điểm số tổn thương thận mô học (Điểm Banff) xuống mức nền không được điều trị và hạ thấp mức độ của cả điểm số chức năng bệnh lý thận, creatinine và BUN.
Tình trạng viêm ở thận BN không được điều trị có liên quan đến sự gia tăng cả TIMP -1 và MIP -3 A / CCL20. Bằng cách so sánh, chúng tôi thấy rằng điều trị PrC -210 không thể làm giảm đáng kể mức TIMP -1 và hầu như không tăng mức MIP -3 A / CCL20.
Chất ức chế mô metalloproteinase -1 (TIMP -1) là một chất điều hòa quan trọng của quá trình tổng hợp và phân hủy chất nền ngoại bào (ECM). Sự tích tụ ECM dư thừa là cơ chế bệnh lý chính của sự phát triển bệnh brosis trong và sau chấn thương thận cấp tính. Về cơ bản không có biểu hiện nào của TIMP -1 trong bình thườngquả thậnmô [25], một quan sát được chứng thực trong Hình 6A, B của chúng tôi, nhưng TIMP -1 được biết là biểu hiện ở thận bị tổn thương, chủ yếu ở tế bào biểu mô ống thận, màng đáy ống thận và tế bào chất của mô kẽ tế bào. Tăng biểu hiện TIMP -1 có tương quan thuận với sự suy giảm chức năng thận đồng thời [26]. Chuột được điều trị bằng PrC -210 cho thấy mức TIMP -1 (p=0. 001) giảm sâu, cả trong thận và huyết tương; điều này ngụ ý rằng PrC -210 có tác dụng bảo vệ mạnh mẽ chống lại sự tái tổ chức chất nền ngoại bào thận do cấy ghép gây ra.
Chemokine MIP -3 a / CCL20 kích hoạt thụ thể CCR6, được biểu hiện đặc biệt trên tế bào T điều hòa (Tregs). CCL20 được biểu hiện bằng các tế bào nội mô ống và tế bào kẽ và cũng được điều tiết ở thận bị tổn thương thận cấp tính. Con đường CCL20– CCR6 đóng một vai trò quan trọng trong việc tuyển dụng tế bào T qua trung gian Treg đến thận, và Tregs đã được mô tả là có vai trò tích cực trongquả thậnsửa chữa, khả năng chịu ghép và sự tồn tại của thận. Cả việc ngăn chặn kháng thể của con đường CCL20 – CCR6, cũng như việc sử dụng CCR 6- de fi cient ở chuột cấp tínhquả thậncác thí nghiệm về chấn thương đã được chứng minh là làm tăng mức độ nghiêm trọng của suy thận và tỷ lệ tử vong [27]. Điều này cho thấy rằng về mặt lâm sàng, tăng cường con đường CCL20 – CCR6 và kích hoạt Treg có thể là một lộ trình điều trị khả thi để hạn chế cấp tính và mãn tínhquả thậnchấn thương [28]. Trong nghiên cứu của chúng tôi (Hình 6D), mức MIP -3 a / CCL20 ở chuột được điều trị bằng PrC -210- cao hơn đáng kể so với chuột không được điều trị. Chúng tôi suy đoán rằng đây là một trong những lý do giải thích cho cả (i) tỷ lệ tuyển dụng tế bào đơn nhân vào thận thấp hơn đáng kể (Hình 3C) và (ii) giảm đáng kể tổn thương thận (Hình 2) ở chuột được điều trị bằng PrC -210- .
Chức năng ti thể của thận bình thường, và quan trọng là, những xúc phạm đến nó trong quá trình bảo quản, cấy ghép và sau cấy ghép thận trong các bước điều trị là những yếu tố quyết định đáng kể đến tổn thương ROS và suy thận trong quá trình cấy ghép. Do đó, điều đáng kể là PrC -210 đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn hoàn toàn sự phân mảnh ADN ty thể (Hình 7) ở nồng độ (2–4 mM) đã đạt được trong huyết tương của cả chuột nhắt và chuột cống được tiêm trong màng bụng hoặc đường uống 0. 5 liều MTD của PrC -210 được dung nạp mà không có độc tính có thể phát hiện được [29].
Trong các nghiên cứu liên quan đến ghép thận trước đây của chúng tôi [16,17], chúng tôi đã thấy sự gia tăng đáng kể caspase hoạt hóa trong thận tiếp xúc với chấn thương "thiếu máu cục bộ lạnh" và "tái tưới máu thiếu máu cục bộ". Những xúc phạm do thiếu máu cục bộ gây ra đối với thận đã được giảm xuống nền bằng cách điều trị bằng PrC -210 (Hình 8). Trong các nghiên cứu của bản thảo này (Hình 5), trong đó thiếu máu cục bộ lạnh và thiếu máu cục bộ tái tưới máu về cơ bản được loại bỏ bằng cách cấy ghép ngay lập tức, không có sự gia tăng caspase hoạt hóa trong thận được ghép. Thay vào đó, caspase được kích hoạt đã giảm đáng kể ở cộng thêm 20 giờ trong các đối chứng "Không điều trị bằng thuốc" và điều trị PrC -210 đã loại bỏ hoàn toàn việc giảm caspase này ở chuột cộng thêm 20 giờ và giữ mức caspase ổn định. Giải thích của chúng tôi về những kết quả thú vị này là không có bất kỳ sự xúc phạm đáng kể nào gây ra bởi thiếu máu cục bộ do ROS và RNS sau khi cấy ghép.thận, không có dấu hiệu chết và apoptosis của tế bào liên quan như các caspase được kích hoạt. Thay vào đó, trong các ca ghép thận allograft này, các tín hiệu bắt đầu từ các cyto- và chemokine mới được biểu hiện hiện điều chỉnh sự trao đổi chất của tế bào, bao gồm cả việc ảnh hưởng đến con đường apoptosis. Tài liệu mô tả rằng sự biểu hiện quá mức của TIMP -1 dẫn đến sự ức chế quá trình chết theo chương trình [26]. Kết quả caspase của chúng tôi (Hình 5) hỗ trợ hiệu ứng TIMP -1 được mô tả này và chúng ngụ ý rằng TIMP -1 rất quan trọng trong việc điều chỉnh sinh lý bệnh của tổn thương tế bào sau khi ghép thận. Để chứng thực cho việc ức chế biểu thức PrC -210 trước đó biểu hiện TIMP -1 (Hình 6A, B), điều trị PrC -210 đã triệt tiêu hoàn toàn sự thay đổi caspase, giữ cho các mức caspase ở cùng mức đã thấy trong điều khiển "0 h" thận. Bởi vì mức PrC -210 TIMP -1 huyết thanh giảm ở cộng thêm 20 giờ (Hình 6B) tái diễn chính xác sự ức chế đáng kể của tất cả: (i) apoptosis (Hình 5), (ii) bệnh lý mô học (Hình 2 và 3) và (iii) tế bào viêm trong màng lọc (Hình 3), chúng tôi hy vọng rằng việc theo dõi nồng độ TIMP -1 trong huyết thanh ở những người nhận allograft thận người sẽ là một cách hợp lý để theo dõi hiệu quả lâm sàng của PrC -210 trong các thử nghiệm lâm sàng trong tương lai .
Trong quá trình nghiên cứu của chúng tôi cho đến nay [16,17], chúng tôi đã chứng minh rằng PrC -210 có thể bảo vệ thận được cấy ghép chống lại cả sự xúc phạm thiếu máu cục bộ do lạnh và thiếu máu cục bộ tái tưới máu. Trong nghiên cứu này, giờ đây chúng ta thấy rằng PrC -210 cũng bảo vệ thận allograft khỏi các tác nhân gây viêm không do thiếu máu cục bộ xảy ra sau khi cấy ghép thận. PrC -210 đáng kể không thể làm giảm mức độ cấp tính trong các cytokine chuyển động, chẳng hạn như TNF-alpha, và ngăn chặn sự biểu hiện của chemokine TIMP -1. Cả hai sự kiện này, và có khả năng, được hỗ trợ thêm bởi biểu hiện CCL20 bổ sung, sẽ được kỳ vọng là: (i) giảm tổn thương thận toàn phần, (ii) ngăn chặn việc tuyển dụng tế bào T đến thận, và (iii) ngăn chặn sự kích hoạt bẩm sinh và hệ thống miễn dịch thích ứng. Trong Hình 8, chúng tôi tóm tắt những phát hiện này để hỗ trợ vai trò mà chúng tôi cảm thấy PrC - 210 có thể đóng trong việc ghép thận ở người; nó ngăn chặn: (i) các loại oxy phản ứng do thiếu máu cục bộ lạnh (ROS) và các loại nitơ phản ứng (RNS) gây hại cho nền [17],
(ii) tổn thương ROS do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu đối với nền [16], và (iii) gây tổn hại cơ bản trong cơ thể, trong một số trường hợp, đối với nền. Vì cơ chế hoạt động chính của PrC -210 đối với PrC -210 là thu gom các gốc tự do oxy và nitơ, điều này ngụ ý rằng các gốc tự do này là một yếu tố quan trọng góp phần gây ra tổn thương thận trong các tình trạng không thiếu máu cục bộ, tức là allograft liên quan đến fl ammation được nghiên cứu trong bản thảo này.
Tóm lại, điều này cho thấy rằng PrC -210 có thể cung cấp khả năng bảo vệ cơ quan có thể áp dụng rộng rãi cho nhiều điều kiện cấy ghép toàn bộ; nó có thể bảo vệ thận được ghép trong và sau tất cả các giai đoạn của quá trình cấy ghép — từ hiến tạng, thông qua vận chuyển, tái cấy ghép và viêm nhiễm sau phẫu thuật — để giảm thiểu tình trạng thải ghép cấp tính và mãn tính.
Cistanche tubulosa ngăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu
Sự đóng góp của tác giả:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV và MMCG đã tham gia vào việc thực hiện nghiên cứu và phân tích dữ liệu; TRG và NAW tham gia thiết kế nghiên cứu và phân tích dữ liệu; WEF và TRG đã tham gia thiết kế nghiên cứu, thực hiện nghiên cứu, phân tích dữ liệu và viết bài báo. Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.
Kinh phí:Nghiên cứu này được tài trợ bởi Viện Nghiên cứu Lâm sàng và Dịch thuật UW và cấp UL1TR002373 cho UW ICTR từ NIH / NCATS, Hiệp hội Bác sĩ Phẫu thuật Cấy ghép Hoa Kỳ (133 AAA1552), Trường Cao đẳng Bác sĩ Phẫu thuật Hoa Kỳ (133 AAB2176), và hỗ trợ cho WEF (# R03CA176799).
Tuyên bố của Hội đồng Đánh giá Tổ chức: Nghiên cứu này đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Tổ chức Y tế và Y tế Công cộng tại Đại học Wisconsin phê duyệt (Nghị định thư Động vật # M005204).
Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Dữ liệu nghiên cứu có đầy đủ trong bản thảo này. Các vấn đề lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Người giới thiệu
1. Vương, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Thợ cắt tóc, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Lớp phủ, MM; Coggeshall, M.; et al. Tuổi thọ toàn cầu, khu vực và quốc gia, tỷ lệ tử vong do mọi nguyên nhân và tỷ lệ tử vong do nguyên nhân cụ thể đối với 249 nguyên nhân tử vong, 1980–2015: Một phân tích có hệ thống cho Nghiên cứu Gánh nặng Bệnh tật Toàn cầu 2015. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Đối xử, E.; Châu Tinh Trì, E. Peipert, JD; Người nước, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Cung, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Vận chuyển thận của người hiến còn sống và kết quả của người nhận ghép. Ả Rập. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Trọng lượng, SC; Chuông, PR; Nicholson, ML Chấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận. Br. J. Phẫu thuật. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J .; Reinecke, G.; Cô, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K .; Matas, A.; Halloran, PF Tìm hiểu nguyên nhân của việc ghép thận thất bại: Vai trò chủ đạo của việc từ chối qua trung gian kháng thể và sự không tuân thủ. Là. J. Cấy ghép. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Tiếng Ailen, W .; Brennan, DC Chức năng Ghép Trì hoãn trong Ghép Thận. Ả Rập. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Cô, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J .; Sellars, J.; Reeve, J .; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. De NovoDonor-Speci fi c Kháng thể tại thời điểm sinh thiết ghép thận có liên quan đến bệnh lý vi mạch và thất bại ghép muộn. Ả Rập. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Tác động của kháng thể kháng HLA do người hiến tặng đối với suy thận giai đoạn cuối. Nat. Linh mục Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W .; Djamali, A. Đặc điểm của việc từ chối kháng thể cấp tính do truyền máu gây ra trong mô hình cấy ghép thận ở chuột. Ả Rập. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Tiền mẫn cảm: Vấn đề và cách quản lý của nó. Clin. Mứt. Soc. Nephrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Mùa đông, J .; Moore, S .; DeGoey, S. Một so sánh giữa Plasmapheresis với Thuốc giải mẫn cảm IVIG liều cao ở những người nhận bằng Allograft thận có mức Alloantibody Speci c của người hiến tặng cao. Ả Rập. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Sỏi, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-trình quét và bảo vệ phóng xạ ef fi cacy của PrC -210 aminothiol mới. Radiat. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Hacker, TA; Fahl, CHÚNG TÔI Một hoạt chất mới bằng đường uống, Aminothiol Chất bảo vệ phóng xạ không gây buồn nôn và hạ huyết áp ở liều lượng bảo vệ phóng xạ cao nhất. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701 – e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N. .; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, một chất ngăn ngừa ung thư, gây ra các con đường liên quan đến sinh tổng hợp màng để phản ứng với sự phá hủy mô bởi aflatoxin B1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermusek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Thương hiệu, M.; Dưới, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, CHÚNG TÔI Ngăn chặn Đáng kể Thiệt hại DNA do Bức xạ CT gây ra trong Tế bào Người Bình thường bằng Bộ bảo vệ Phóng xạ PrC -210. Radiat. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Hacker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Quay lại, S .; Kaufmann, E.; Fahl, WE Signi không thể giảm chết tế bào tái tưới máu do thiếu máu cục bộ trong nhồi máu cơ tim ở chuột bằng cách sử dụng PrC {3}} ROS-scavenger tác dụng tức thì. Pharmacol. Res. Sự tôn trọng. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Nhà tắm, NM; Fahl, CHÚNG TÔI; Trường màu đỏ, RR Signi không thể làm giảm sự chết của tế bào tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận ở chuột bằng cách sử dụng thiết bị thu hồi oxy phản ứng PrC -210 tác động qua trung gian. Cấy. Thẳng thắn. 2019, 5, e549 – e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Nhà tắm, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Trường đỏ, RR; Fahl, WE Signi không thể cải thiện Kho lạnh Bảo quản Thận Chuột bằng Giải pháp Bảo quản Nội tạng UW Được bổ sung với PrC Hành động tức thì -210 Chất dọn rác cấp tiến miễn phí. Cấy. Trực tiếp 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Phường, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, Hiệu ứng Bảo vệ Phóng xạ ZM của Aminothiol PrC -210 trên Tai trong được chiếu xạ của Guinea Pig. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Sỏi, ĐD; Fahl, WE Tổng hợp và hoạt động điều hòa tăng trưởng của một thành viên nguyên mẫu của họ chất bảo vệ phóng xạ aminothiol mới. Tổ chức sinh học Med. Chèm. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, CHÚNG TÔI; Đá cuội, D.; Copp, RR Amino Thiol Hợp chất và Chế phẩm để Sử dụng trong Kết hợp với Liệu pháp Điều trị Ung thư. Bằng sáng chế Hoa Kỳ 7.314.959, ngày 12 tháng 4 năm 2004.
