Swertiajaponin ức chế sắc tố da bằng cơ chế kép để ức chế tyrosinase Phần 2
Mar 21, 2023
nước tiểulà một loại thảo mộc phổ biến được mệnh danh là “thần dược kéo dài tuổi thọ”. Thành phần chính của nó là cistanoside, có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, chống viêm và tăng cường chức năng miễn dịch. Cơ chế giữa cistanche và làm trắng da nằm ở tác dụng chống oxy hóa của glycoside cistanche.
Melanin trong da người được tạo ra bởi quá trình oxy hóa tyrosine được xúc tác bởi tyrosinase, và phản ứng oxy hóa cần có sự tham gia của oxy, vì vậy các gốc tự do oxy trong cơ thể trở thành một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất melanin.nước tiểuchứa cistanoside, một chất chống oxy hóa và có thể làm giảm sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, do đó ức chế sản xuất melanin.
Nhấp vào Cistanche Tubulosa để cải thiện làn da trắng
Hỏi thêm:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Ngoài ra,hột cácũng có chức năng thúc đẩy sản xuất collagen, có thể làm tăng độ đàn hồi và độ bóng của da, giúp sửa chữa các tế bào da bị tổn thương.
nước tiểuPhenylethanol Glycoside có tác dụng điều chỉnh giảm đáng kể đối với hoạt động của tyrosinase và tác dụng đối với tyrosinase được chứng minh là ức chế cạnh tranh và có thể đảo ngược, có thể cung cấp cơ sở khoa học để phát triển và sử dụng các thành phần làm trắng trong Cistanche.
Vì thế,hột cácó vai trò quan trọng trongLàm trắng da. Nó có thể ức chế sản xuất melanin để giảm sự đổi màu và xỉn màu; và thúc đẩy sản xuất collagen để cải thiện độ đàn hồi và rạng rỡ của da. Do sự công nhận rộng rãi về những tác dụng này của Cistanche, nhiều sản phẩm làm trắng da đã bắt đầu thêm các thành phần thảo dược như Cistanche để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, do đó làm tăng giá trị thương mại của Cistanche trong các sản phẩm làm trắng da.
Tóm lại, vai trò của cistanche trong việc làm trắng da là rất quan trọng. Tác dụng chống oxy hóa và tác dụng sản xuất collagen của nó có thể làm giảm sự đổi màu và xỉn màu, cải thiện độ đàn hồi và độ bóng của da, do đó đạt được một làn da tươi trẻ.tác dụng làm trắng. Ngoài ra, việc ứng dụng rộng rãi Cistanche trong các sản phẩm làm trắng da chứng tỏ rằng không thể đánh giá thấp vai trò của nó đối với giá trị thương mại.
Swertiajaponin ức chế kích hoạt MAPK do UVB gây ra
Stress oxy hóa đã được chứng minh là kích thích quá trình hình thành hắc tố bằng cách điều hòa lại yếu tố phiên mã liên quan đến microphthalmia (MITF), một yếu tố phiên mã để tạo ra biểu hiện gen tyrosinase [4, 14]. Chúng tôi đã nghiên cứu xem tác dụng chống oxy hóa của swertiajaponin có thể điều chỉnh hoạt động của MITF hay không. Dữ liệu về vết rạn của phương Tây cho thấy rằng việc tiếp xúc với tia UVB làm tăng MITF bị phosphoryl hóa, một dạng MITF hoạt động, trong khi điều trị bằng swertiajaponin ở mức 10 μM đã làm giảm nó (Hình 6A). Một cách nhất quán, mức độ protein tyrosinase tăng qua trung gian UVB đã giảm khi điều trị bằng swertiajaponin (Hình 6A). Vì stress oxy hóa đã được chứng minh là kích hoạt MITF thông qua protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen (MAPK) [15, 16], người ta đã nghiên cứu xem liệu swertiajaponin có thể kiểm soát tín hiệu MAPK hay không. Phơi nhiễm với tia UVB làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa ERK, JNK và p38 (Hình 6B), có liên quan đến quá trình sản xuất ROS và ONOO- do UVB gây ra trong các tế bào B16F10 (Hình 5C- 5D). Chỉ điều trị bằng Swertiajaponin ở mức 10 μM đã làm giảm nồng độ protein của MAPK (Hình 6B). Kết quả này phù hợp với hoạt tính chống oxy hóa của swertiajaponin vì sự giảm căng thẳng oxy hóa tế bào do UVB gây ra chỉ rõ ràng ở 10 μM swertiajaponin (Hình 5C-5D).
Mặc dù swertiajaponin là hợp chất chính của toàn bộ thảo mộc Swertia japonica đã được sử dụng làm thuốc của Nhật Bản, nhưng nghiên cứu của chúng tôi không đưa ra bằng chứng thuyết phục về sự an toàn của swertiajaponin khi sử dụng trên da người. Tuy nhiên, swertiajaponin không thể hiện tính gây độc tế bào trong các dòng tế bào Hs27 (nguyên bào sợi của người), HaCat (tế bào sừng của người) và B16F10 (u ác tính của chuột) trong môi trường thử nghiệm của chúng tôi. Ngoài ra, không có dấu hiệu gây độc tế bào có thể nhìn thấy bao gồm sự hình thành mảnh vụn tế bào hoặc sự tách rời tế bào dựa trên quan sát bằng kính hiển vi khi swertiajaponin được xử lý trong mô hình da người với nồng độ không cho thấy khả năng gây độc tế bào trong các dòng tế bào. Xem xét các vấn đề an toàn là mối quan tâm chính của các hợp chất làm trắng da hiện đang có sẵn, cần có thêm các nghiên cứu in vivo để kiểm tra tính an toàn của chúng trong sinh lý học.
Cùng với nhau, swertiajaponin ức chế sự tích tụ melanin đến một giới hạn thỏa đáng cả trong mô hình tế bào và da người bằng cơ chế kép để ức chế tyrosinase thông qua liên kết trực tiếp và ức chế cạnh tranh tyrosinase và ức chế tín hiệu MAPK/MITF qua trung gian stress oxy hóa (Hình 7). Xem xét các tác dụng phụ và thiếu hiệu quả lâu dài của các chất làm trắng da đã biết như axit kojic và arbutin [17], swertiajaponin có thể được sử dụng an toàn hơn để ngăn chặn sắc tố da và sẽ là một chất phụ gia mới cho mỹ phẩm làm trắng.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Xét nghiệm hoạt tính tyrosinase sử dụng nấm tyrosinase
Swertiajaponin và axit kojic (50 μM) được nạp vào đĩa vi mạch giếng 96- (Nunc, Đan Mạch) trong dung dịch đệm tyrosinase (200 μL) có chứa tyrosinase của nấm (1000 U), dung dịch L-tyrosine 1 mM và 50 mM phosphate đệm (pH 6,5) [5]. Đĩa được ủ ở 37 độ trong 15 phút và dopaquinone được đánh giá bằng phép đo quang phổ (450nm). Dựa trên phép đo, IC50 được tính toán bằng cách sử dụng các đường cong log-tuyến tính và phương trình của chúng.
Mô phỏng kết nối của swertiajaponin và tyrosinase
AutoDock Vina đã được sử dụng cho mô phỏng lắp ghép ligand protein silico. Cấu trúc ba chiều của tyrosinase được sử dụng trong cấu trúc tinh thể của Agaricus bisporus (ID PDB: 2Y9X). Vị trí liên kết được xác định trước của tyrosine đã được áp dụng như một túi lắp ghép. Sau khi mô phỏng kết nối giữa tyrosinase và swertiajaponin hoặc axit kojic được thực hiện, phần mềm LigandScout 3.0 đã được sử dụng để dự đoán dư lượng liên kết giữa các hợp chất khác nhau và tyrosinase.
Phân tích động học của sự ức chế tyrosinase bởi swertiajaponin
L-DOPA được điều chế ở các nồng độ 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, và 0.0625 mM, và swertiajaponin đã được điều chế ở 20, 40 và 80 μM. Dung dịch hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong đĩa giếng 96-, trong đó 20 μL cơ chất tyrosinase (L-DOPA), 10 μL dung dịch tyrosinase dạng nước của nấm (200 U) và dung dịch đệm kali photphat 50 mM (pH 6.5) đã được thêm vào. Tốc độ sản xuất dopachrom của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 450nm bằng đầu đọc vi bản. Tỷ lệ ức chế tyrosinase của swertiajaponin sau đó được tính toán bằng phân tích sơ đồ Lineweaver-Burk. Hằng số Michaelis (Km) và vận tốc cực đại (Vmax) cũng được tính toán bằng đồ thị Lineweaver-Burk với nồng độ chất nền L-DOPA khác nhau [3].
Nuôi cấy tế bào và xét nghiệm khả năng sống
Các tế bào khối u ác tính B16F10 đã được mua từ Ngân hàng Dòng tế bào Hàn Quốc. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường Eagle sửa đổi (DMEM) của Dulbecco với 5% huyết thanh bào thai bò (FBS) và 1% penicillin, streptomycin, L-glutamine và natri pyruvate. Các tế bào được duy trì ở 37 độ trong môi trường có độ ẩm 95% không khí/5% CO2. Đối với thử nghiệm khả năng sống của tế bào, các tế bào được cấy vào 96-các đĩa giếng. Các tế bào khối u ác tính B16F10 được điều trị bằng swertiajaponin ở các nồng độ khác nhau trong 48 giờ. Ez-Cytox (10 μL) đã được thêm vào từng giếng và được ủ trong 2 giờ. Các tinh thể formazan hình thành được đo bằng phép đo quang phổ ở bước sóng 450 nm. Khả năng tồn tại của tế bào được tính toán bằng cách sử dụng các tế bào không được xử lý bằng swertiajaponin làm nhóm đối chứng.
Hàm lượng hắc tố trong tế bào B16F10
Mức độ hắc tố được đo bằng phương pháp được mô tả trước đây với một số sửa đổi nhỏ [18 ]. Các tế bào B16F10 được phép phát triển thành 70-80 phần trăm hợp lưu trong 6-các đĩa giếng. Các tế bào được xử lý trước bằng swertiajaponin hoặc axit kojic trong 2 giờ. Sau đó, MSH hoặc UVB được xử lý trong môi trường chứa axit swertiajaponin- hoặc axit kojic và được ủ thêm 48 giờ nữa. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được tách ra bằng trypsin và hòa tan trong dung dịch NaOH 90 μL 1 N có chứa DMSO (5 phần trăm). Sau khi ủ ở 60 độ trong 1 giờ, hàm lượng melanin được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở 405 nm. Buồng UV có bán trên thị trường (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea) đã được sử dụng để tiếp xúc với tia UVB của các tế bào B16F10.
phương Tây
Các mẫu protein được phân lập từ tế bào B16F10 (30 ug) được phân tách bằng điện di gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide sử dụng gel acrylamide phần trăm 10-12 và được chuyển vào màng polyvinylidene florua, sau đó màng này được đặt ngay vào dung dịch đệm chặn ( 5% sữa không béo) trong 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl và 0,1% Tween 20. Màng được rửa trong dung dịch đệm TBS-Tween trong 30 phút và sau đó được ủ với các kháng thể sơ cấp cụ thể (1:1{ {24}} pha loãng) được chỉ ra trong chú thích hình ở 4 độ qua đêm. Sau khi rửa bằng dung dịch đệm TBS-Tween, màng này được ủ với kháng thể chống chuột kết hợp với peroxidase cải ngựa (Santa Cruz, 1: 10,000), một kháng thể chống thỏ (Santa Cruz, 1: 10, 000) hoặc kháng thể chống dê (Santa Cruz, 1: 10.000) ở 25 độ trong 1 giờ. Các immunoblots được hiển thị bằng cách sử dụng giải pháp Western Bright Peroxide (Advansta, CA, USA) và hệ thống hình ảnh ChemiDoc Touch (Bio-Rad, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các kháng thể được sử dụng trong nghiên cứu này như sau: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tyrosinase (Tín hiệu tế bào-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Tín hiệu di động-921L), p38 (Tín hiệu di động-9212S), pERK (Tín hiệu di động-4370L ), ERK (Tín hiệu di động-9201L), pJNK (Tín hiệu di động-9251L), JNK (Tín hiệu di động-9252S) và -actin (Santa Cruz-47778) .
Đo mức ROS và ONOO-
Hoạt tính chống oxy hóa của swertiajaponin đã được kiểm tra bằng cách sử dụng huỳnh quang 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) đối với ROS và dihydro rhodamine (DHR) 123 đối với ONOO-. Tóm lại, để xác định mức ROS, DCFDA (25μM) đã được thêm vào các chất đồng nhất của tế bào để có thể tích cuối cùng là 250ul. Để đo mức ONOO-, 10ul chất đồng nhất của tế bào đã được thêm vào dung dịch rhodamine (đệm natri photphat 50mM, natri clorua 90mM, axit diethylenetriaminepentaacetic 5mM [DTPA] và DHR123). Đối với cả hai xét nghiệm, huỳnh quang được đo cứ sau 5 phút trong 30 phút trên đầu đọc tấm huỳnh quang, với các bước sóng kích thích và phát xạ được đặt tương ứng ở 485 và 530 nm.
Sự tích tụ melanin trong mô hình da người
Một lớp biểu bì người ba chiều, khả thi, được tái tạo (Neoderm-ME, Tego Science) đã được sử dụng để kiểm tra tác dụng chống tạo hắc tố của swertiajaponin trong mô hình da người. Mô hình da người được xử lý trước bằng DMSO (phương tiện) hoặc swertiajaponin trong 1 giờ và được nuôi cấy trong môi trường bảo trì do công ty cung cấp trong 5 ngày bằng cách xử lý bằng DMSO hoặc swertiajaponin. Phân tích dưới kính hiển vi được thực hiện từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5 để quan sát sắc tố da. Các hình ảnh hiển vi được phần mềm Image J phân tích để bán định lượng mức độ sẫm màu của da. Đối với nhuộm Fontana-Masson, các mẫu da được cố định trong 4% paraformaldehyde qua đêm ở nhiệt độ phòng và các mẫu được phân tích bởi một công ty có sẵn trên thị trường (Garam Meditech, Hàn Quốc).
Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Các nhóm khác nhau được so sánh bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều, sau đó là hậu kiểm của Dunnett. P < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Không có xung đột lợi ích để tuyên bố.
KINH PHÍ
Công trình này được hỗ trợ bởi Grant K17281 từ Viện Đông y Hàn Quốc, Bộ Giáo dục, Khoa học và Công nghệ (MEST), Hàn Quốc.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
1. Bradford PT. Ung thư da ở da màu. Điều dưỡng Dermatol. 2009; 21: 170-7, 206.
2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Các phương pháp tiếp cận bằng hóa chất và công cụ để điều trị chứng tăng sắc tố da. Tế bào sắc tố Res. 2003; 16: 101-10.
3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- (benzylidene được thay thế) thiazol-4(5H)-one dẫn xuất dưới dạng chất ức chế tyrosinase mới. Dược phẩm sinh học Bull. 2015; 38: 1227-33.
4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihydroxy benzylidene) thiazolidine- 2,4-dione ngăn ngừa sự hình thành hắc tố và nếp nhăn do tia UVB gây ra thông qua việc ngăn chặn stress oxy hóa trong HRM{{7} } chuột trụi lông. Tế bào Oxi Med Longev. 2016; 2016: 2761463.
5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihydroxy phenyl) thiazolidine- 4-axit cacboxylic ngăn ngừa sự hình thành nếp nhăn do tia cực tím thông qua việc ức chế phản ứng viêm qua trung gian NF-kappaB. J Dermatol khoa học. 2015; 79: 313-6.
6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols từ Heterotheca bao gồm: hoạt động ức chế tyrosinase và tiêu chí cấu trúc. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.
7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Xác định dư lượng vị trí hoạt động liên quan đến liên kết đồng sáng lập kim loại và nhận dạng cơ chất đặc hiệu lập thể trong tyrosinase của động vật có vú. Ý nghĩa đối với chu trình xúc tác. hóa sinh. 2002; 41: 679-86.
8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoid là chất ức chế tyrosinase của nấm: một nghiên cứu dập tắt huỳnh quang. J Hóa chất Thực phẩm Nông nghiệp. 2006; 54: 935-41.
9. Orhan IE, Khan MT. Các dẫn xuất flavonoid như chất ức chế tyrosinase mạnh - một cuộc khảo sát về những phát hiện gần đây giữa 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.
10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Các nghiên cứu về thành phần của Swertia japonica. II. Phân lập và cấu trúc của flavonoid mới, swertiajaponin. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1967; 15: 1567-72.
11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Tác dụng của chiết xuất Swertia japonica và hợp chất chính của nó swertiamarin đối với việc làm rỗng dạ dày và nhu động ruột ở chuột. Fitoterapia. 2011; 82: 827-33.
12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Tác dụng ức chế của 2-metyl-naphtho[1,2,3-de]quinolin-8-one đối với quá trình vận chuyển melanosome và sắc tố da. Đại diện Khoa học 2016; 6:29189.
13. Cotelle N. Vai trò của flavonoid trong stress oxy hóa. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.
14. Sim MO, Hàm JR, Lee MK. Lá non của cây sậy (Phragmites communis) ngăn chặn sự hình thành sắc tố và stress oxy hóa trong các tế bào khối u ác tính B16F10. Dược phẩm Biomed. 2017; 93: 165-71.
15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Con đường truyền tín hiệu trong quá trình tạo hắc tố. Int J Mol Khoa học. 2016; 17.
16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetin từ Ampelopsis Grossedentata ức chế quá trình tạo hắc tố thông qua quá trình điều chỉnh giảm các con đường truyền tín hiệu MAPK, PKA và PKC. Tương tác Chem Biol. 2016; 258: 166-74.
17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Chiết xuất sợi nấm Ganoderma formosanum như một chất ức chế tyrosinase mạnh. Đại diện Khoa học 2016; 6:32854.
18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 kích thích sự biểu hiện gen tyrosinase và quá trình tạo hắc tố trong các tế bào hắc tố biệt hóa. Tế bào sắc tố Res. 2001; 14: 328-36.
