trừu tượngMặc dù lão hóa là yếu tố rủi ro lớn nhất đối với các bệnh mãn tính ở người (ung thư, tiểu đường, tim mạch và thoái hóa thần kinh), nhưng có rất ít biện pháp can thiệp được biết đến ngoài việc hạn chế calo và một số lượng nhỏ thuốc (có tác dụng phụ đáng kể) trực tiếp giải quyết lão hóa. Do đó, có một nhu cầu cấp thiết về các lựa chọn mới có thể trì hoãn quá trình lão hóa và ngăn ngừa các bệnh liên quan đến tuổi tác. Lão hóa tế bào là cơ sở của các quá trình lão hóa. Tuổi thọ theo trình tự thời gian (CLS) của nấm men Saccharomyces cerevisiae là hệ thống mô hình được thiết lập tốt để nghiên cứu các biện pháp can thiệp vào quá trình lão hóa tế bào sau giảm phân của con người. CLS được định nghĩa là số ngày tế bào vẫn tồn tại trong giai đoạn đứng yên. Chúng tôi đã phát triển một phương pháp định lượng mới, rẻ và nhanh chóng để đo CLS trong môi trường nuôi cấy tế bào được ủ cùng với các tác nhân hóa học khác nhau và các biện pháp kiểm soát trên 96-các đĩa giếng. Giao thức PICLS của chúng tôi với (1) việc sử dụng propidium iodide để đọc tỷ lệ sống sót của tế bào dựa trên huỳnh quang trong đầu đọc vi bản và (2) phép đo tổng số tế bào thông qua hấp thụ OD600nm từ cùng một bản mang lại công suất thông lượng cao thực sự. Tùy thuộc vào hậu cần, số lượng lớn các bản có thể được xử lý song song để việc sàng lọc hàng nghìn hợp chất trở nên khả thi trong một thời gian ngắn. Phương pháp này đã được xác nhận bằng cách đo lường tác dụng của rapamycin và hạn chế calo đối với men CLS. Chúng tôi sử dụng phương pháp này để sàng lọc tác nhân hóa học. Chúng tôi đã phát hiện ra tiềm năng chống lão hóa/bảo vệ thần kinh của 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) và đề xuất việc sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các biện pháp can thiệp chống lão hóa khác.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Click để xem sản phẩm chống lão hóa

【Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

từ khóaSaccharomyces cerevisiae · Tuổi thọ theo thời gian · Sàng lọc hóa chất · Hợp chất chống lão hóa · 2,5-anhydro-D-mannitol

Giới thiệu

The growing fraction of the elderly (>65 tuổi) trong tổng dân số (từ ~ 10 phần trăm trên toàn thế giới (trên 20 phần trăm ở các nước thuộc thế giới thứ nhất) vào năm 2020 đến 16 phần trăm ngoại suy vào năm 2050), cũng như tuổi thọ ngày càng tăng của họ (tăng ~ 10 năm kể từ năm 1960 ở các nước thuộc thế giới thứ nhất ), đối mặt với thế giới với những vấn đề ngày càng khó khăn [1, 2]. Bên cạnh việc làm giảm hoạt động sống nói chung, lão hóa vẫn là yếu tố rủi ro lớn nhất đối với sự phát triển của các bệnh mãn tính, sau đó làm tổn hại đến cuộc sống độc lập của con người và cuối cùng dẫn đến tử vong [3–7]. Các phương pháp y tế hiện tại để ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến tuổi tác là khuyến nghị cho một lối sống lành mạnh, bao gồm tập thể dục và ăn kiêng. Tuy nhiên, chỉ những can thiệp này là không đủ để ngăn ngừa sự khởi phát của các bệnh liên quan đến tuổi tác.

Lão hóa được đặc trưng bởi sự mất dần tính toàn vẹn sinh lý, hiệu quả trong các chức năng của tế bào và tín hiệu trao đổi chất [8]. Những nỗ lực ngày càng tăng được hướng đến để hiểu các quá trình lão hóa tế bào ảnh hưởng đến mạng lưới tương tác protein và gen dự phòng có chức năng cao và liên kết với nhau [8, 9]. Bất chấp sự phức tạp của lão hóa, nghiên cứu gần đây trong các hệ thống mô hình khác nhau, bao gồm cả động vật có vú, đã chứng minh rằng lão hóa chậm và tăng tuổi thọ sức khỏe là khả thi bằng các biện pháp can thiệp chống lão hóa như ứng dụng quản lý thuốc rapamycin và hạn chế calo (glucose) [10–15]. Do đó, mở rộng danh mục các hợp chất chống lão hóa có thể được sử dụng làm phương pháp trị liệu bảo vệ lão hóa và giảm tác dụng phụ không mong muốn của chúng là một trong những chiến lược đầy hứa hẹn có thể trì hoãn lão hóa và kéo dài tuổi thọ sức khỏe.

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cơ chế phân tử quan sát được trong quá trình lão hóa của con người được bảo tồn ở các sinh vật khác nhau, bao gồm cả nấm men đơn bào [8, 10, 16, 17]. Nấm men vừa chớm nở Saccharomyces cerevisiae là một trong những sinh vật mẫu được nghiên cứu nhiều nhất để phát hiện ra các quá trình sinh học liên quan đến lão hóa tế bào. Lợi ích của việc nghiên cứu quá trình lão hóa ở men bao gồm thời gian tạo thế hệ ngắn, tuổi thọ dễ kiểm soát và khả năng thích ứng với các thử nghiệm thông lượng cao. Do đó, sinh vật này đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để xác định các biện pháp can thiệp chống lão hóa. Nấm men thường được sử dụng để nghiên cứu quá trình lão hóa theo hai cách riêng biệt: tuổi thọ tái tạo (RLS) và tuổi thọ theo trình tự thời gian (CLS) [18]. RLS đo số lần một tế bào riêng lẻ phân chia, một mô hình lão hóa cho các tế bào nguyên phân chẳng hạn như tế bào gốc. CLS đo khoảng thời gian một tế bào không phân chia vẫn tồn tại trong giai đoạn đứng yên, một mô hình lão hóa cho các tế bào sau nguyên phân như tế bào thần kinh. Khả năng tồn tại của các tế bào nấm men lão hóa trong điều kiện pha tĩnh thiếu chất dinh dưỡng giảm dần và cuối cùng chúng sẽ chết.

CLS thường được đo bằng cách ước tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên đĩa thạch [18]. Các tế bào nấm men trong bình có tổng thể tích môi trường (Lớn hơn hoặc bằng 20 ml) được tiếp xúc với một hợp chất hóa học. Tại các thời điểm khác nhau (ví dụ: sau 2, 5 và 8 ngày), các phần nhỏ của môi trường nuôi cấy lão hóa theo trình tự thời gian từ cốc được pha loãng liên tiếp, đặt lên các đĩa thạch dinh dưỡng và ủ trong 2–3 ngày để hình thành và đếm khuẩn lạc. Tỷ lệ sống sót xác định từ CFU cho từng điểm tuổi theo thời gian so với ngày 1 (được coi là 100% tế bào sống sót). Cách tiếp cận CFU là định lượng nhưng có nhiều nhược điểm. Nó đòi hỏi nhiều pha loãng nối tiếp, các bước cấy và thời gian ủ để các khuẩn lạc xuất hiện. Việc đếm khuẩn lạc được thực hiện bằng các dụng cụ thủ công hoặc đắt tiền. Hơn nữa, phương pháp này không phù hợp và quá đắt đối với sàng lọc thông lượng cao (HTS) của hàng nghìn hợp chất vì nó yêu cầu một lượng đáng kể thuốc được thử nghiệm, nuôi cấy trong bình thể tích lớn và nhiều đĩa thạch. Thật không may, phương pháp CFU và tất cả các biến thể gần đây để đo CLS phụ thuộc rất nhiều vào khả năng của các tế bào sau nguyên phân quay trở lại giai đoạn nguyên phân. Về nguyên tắc, phương pháp này không thể phân biệt nấm men trong quá trình bắt giữ phân bào với tế bào chết.

Những tiến bộ kỹ thuật hiện tại trong các phương pháp có nguồn gốc từ CFU đo lường sự sống sót và tăng trưởng của tế bào dựa trên sự phát triển vượt bậc của men pha tĩnh tiếp xúc với thuốc trong môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng hoặc trong môi trường lỏng hoặc bằng xét nghiệm đốm trên đĩa thạch [17, 19–21] . Sau 24 giờ, sự phát triển vượt bậc của tế bào già cỗi trong môi trường lỏng được đo bằng độ hấp thụ ở OD600nm, trong khi ở xét nghiệm đốm, sự phát triển vượt bậc của tế bào già cỗi được đốm trên môi trường thạch được xác định bằng mắt thường sau 48 giờ. Cải tiến hậu cần bao gồm việc sử dụng các đĩa giếng 96-cho phép sàng lọc biến dạng xóa gen hoặc hóa học hạn chế trên toàn bộ gen. Đối với các chủng loại bỏ nấm men được gắn thẻ gộp, phương pháp tế bào học dòng chảy được yêu cầu để định lượng khả năng tồn tại của từng chủng [22].

Propidium iodide (PI) là thuốc nhuộm huỳnh quang chỉ xâm nhập vào các tế bào chết và do đó, là một chất đánh dấu hiệu quả để định lượng trực tiếp khả năng sống của tế bào [23–25]. Trước đây, các nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tiếp cận dựa trên PI để đo CLS và định lượng khả năng sống của tế bào bằng cách phân tích hình ảnh thu được bằng máy đếm tế bào huỳnh quang, thiết bị chiếu sáng UV hoặc tế bào học dòng chảy [26, 27]. Tuy nhiên, nhiều yêu cầu về xử lý mẫu, hình ảnh và phần mềm để phân tích dữ liệu rất tốn kém và mất thời gian, điều này đã cản trở các phương pháp này trong các ứng dụng thực tế có thông lượng cao. Việc giới thiệu các thuốc nhuộm thay thế như SYTOX green có giá trị hạn chế trong môi trường thông lượng cao do chi phí cao [26].

Do đó, các phương pháp mới được yêu cầu để định lượng khả năng tồn tại của tế bào già để tránh những hạn chế liên quan đến các phương pháp hiện có. Trong công việc này, chúng tôi mô tả PICLS, một phương pháp đo lường CLS dựa trên PI không phụ thuộc vào sự phát triển vượt bậc. Phương pháp mới của chúng tôi dựa trên việc ủ các tế bào nấm men bằng các hợp chất thử nghiệm khác nhau hoặc các điều kiện môi trường thử nghiệm khác nhau trong 96-các đĩa giếng. Chúng tôi sử dụng PI để định lượng sự sống của tế bào. Khả năng đọc nhanh và hiệu quả (trong vòng ~15 phút) được cung cấp bởi đầu đọc vi bản, một thiết bị giá rẻ có sẵn ở hầu hết các phòng thí nghiệm. Phương pháp rẻ tiền này rất phù hợp để sàng lọc quy mô lớn các tác nhân hóa học nhằm xác định các hợp chất chống lão hóa vì nhiều hợp chất, chất kiểm soát hoặc pha loãng khác nhau có thể được đặt một cách thuận tiện trên một đĩa đơn và số lượng lớn các đĩa có thể được xử lý song song. Hơn nữa, chúng tôi đã xác thực phương pháp của mình bằng cách xác định sự mở rộng CLS của nấm men bằng cách sử dụng các biện pháp can thiệp chống lão hóa đã biết như sử dụng rapamycin và hạn chế calo. Sàng lọc nhanh các hóa chất có sẵn trong phòng thí nghiệm của chúng tôi đã bất ngờ tiết lộ 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) giúp kéo dài tuổi thọ của men. Chúng tôi cũng đã xác nhận hoạt động chống lão hóa của 2,5-AM bằng các phương pháp tăng trưởng truyền thống. Các chất tương tự đường được thử nghiệm khác không mang lại hiệu quả tương tự.

Kết quả

Phát triển phương pháp định lượng khả năng sống của tế bào bằng cách sử dụng phép đo huỳnh quang propidium iodide trong đầu đọc vi bản

Quy trình mới của chúng tôi bắt đầu bằng việc phơi bày các tế bào nấm men dại hoặc các tế bào đột biến của chúng được đặt vào môi trường giàu chất dinh dưỡng trong các đĩa 96-giếng cùng với nồng độ cụ thể của các hợp chất hóa học quan tâm. Chúng tôi sử dụng PI làm chất đánh dấu cho sự chết của tế bào vì thuốc nhuộm huỳnh quang này chỉ xâm nhập vào các tế bào không sống sót [23–25]. Khả năng tồn tại của tế bào trong quá trình nuôi cấy pha tĩnh được định lượng sau một số ngày xác định bằng cách đọc huỳnh quang PI trong đầu đọc vi bản, từ đó cung cấp một bảng tính điện tử có thể đọc được để phân tích dữ liệu.

Như một xác thực đầu tiên, chúng tôi cho thấy rằng làm việc với một lượng nhỏ trong giếng vi bản mang lại kết quả tương tự như phương pháp tiếp cận dựa trên cuvette và đầu đọc vi bản đủ nhạy để thu thập dữ liệu về sự tồn tại của tế bào. Vì vậy, chúng tôi đã phân tích nhuộm PI của tế bào nấm men. Các tế bào nấm men được nuôi cấy trong bình thủy tinh và đun sôi trong 15 phút ở 100 độ . Các tế bào sống và chết được rửa sạch và ủ trong 1×PBS (dung dịch muối đệm phốt phát) không có và có PI (5 µg/ml) trong 15 phút. Sau khi ủ, các tế bào được rửa sạch và nối lại trong PBS. Các tế bào được hiển thị bằng kính hiển vi và cường độ huỳnh quang được đo bằng đầu đọc vi bản (Hình bổ sung S1). Sau khi xác nhận rằng PI là một dấu hiệu thích hợp cho sự chết của tế bào, một phân tích tiếp theo đã được thực hiện để phát triển phương pháp. Các tế bào chết nhuộm màu PI đã được nối lại trong PBS đến 48 OD600nm cuối cùng được đo trong cuvet bằng máy đo quang phổ. Tiếp theo, các tế bào được pha loãng liên tiếp trong PBS (OD600nm 48 đến 0,05) và chuyển sang đĩa giếng 96-màu đen (costar 3603). Cần lưu ý, các tấm vi bản màu đen đắt gấp bốn lần so với các tấm trong suốt và khó có sẵn hơn, nhưng chúng tôi đã sử dụng chúng vì chúng phù hợp hơn cho việc đọc huỳnh quang do làm giảm khả năng tự phát huỳnh quang bắt nguồn từ các mẫu và bề mặt vi bản. Với hệ thống hình ảnh GelDoc (Hình 1A), chúng tôi đã hình dung mức độ kết hợp của nhuộm PI trong các tế bào nấm men chết ở các độ pha loãng khác nhau. Sử dụng cùng một tấm, chúng tôi đã đo cường độ huỳnh quang PI bằng đầu đọc vi bản ở bước sóng kích thích 535nm và phát xạ 617nm. Chúng tôi đã tìm thấy mối tương quan tuyến tính cao giữa cường độ huỳnh quang PI và độ hấp thụ của tế bào ở OD600nm (Hình 1 B). Kết quả này chỉ ra rằng biến thể của phương pháp dựa trên huỳnh quang PI của chúng tôi có hiệu quả để định lượng khả năng sống của tế bào.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 của cuvet (Hình 1 D). Tiếp theo, chúng tôi xác định mối quan hệ giữa cường độ huỳnh quang PI và tế bào OD600nm của tấm giếng 96-trong phạm vi OD600nm tối ưu 0,05–12. Chúng tôi quan sát một mối tương quan tuyến tính gần như hoàn hảo (Hình 1E). Do đó, giao thức của chúng tôi đại diện cho một phương pháp mạnh mẽ để định lượng khả năng tồn tại của tế bào.

Ảnh hưởng của các loại vi bản đến việc định lượng khả năng sống của tế bào bằng phép đo huỳnh quang propidium iodide trong đầu đọc vi bản

Ảnh hưởng của rapamycin đến tuổi thọ theo thời gian của nấm men

Rapamycin là một trong những biện pháp can thiệp chống lão hóa nổi tiếng được chứng minh là kéo dài tuổi thọ của một số sinh vật mẫu, bao gồm nấm men, tuyến trùng, ruồi giấm và chuột [10, 14, 15, 28–30]. Nó ức chế phức hợp cảm ứng dinh dưỡng TORC1 (mục tiêu của phức hợp rapamycin 1). TORC1 là một phức hợp protein đa tiểu đơn vị được bảo tồn trong các tế bào nhân chuẩn kết hợp các chất dinh dưỡng trong môi trường với sự phát triển và tăng sinh của tế bào [19, 29, 31–34].

Chúng tôi đã kiểm tra tác động của rapamycin đối với tuổi thọ theo thời gian (CLS) của chủng nấm men để xác nhận giao thức mới được phát triển của chúng tôi. Ở đây và bên dưới, chúng tôi đã sử dụng chủng nấm men nguyên sinh (CEN.PK113- 7D) trong các thí nghiệm của mình để tránh tác động mạnh của quá trình bổ trợ axit amin đối với sự sống của tế bào trong quá trình nuôi cấy ở pha tĩnh [35, 36]. Các tế bào đã già đi với các nồng độ rapamycin khác nhau trong môi trường tổng hợp được xác định (SD). Sự tăng trưởng của tế bào được đo tại các thời điểm khác nhau (24 giờ, 48 giờ và 72 giờ). Chúng tôi thấy rằng sự phát triển của tế bào đạt đến độ bão hòa khoảng 24 giờ sau khi ủ với 5 nM rapamycin hoặc ít hơn (Hình 4A). Tuy nhiên, việc sử dụng 10 nM rapamycin làm chậm sự phát triển của tế bào và độ bão hòa chỉ đạt được sau 48 giờ (Hình 4A). Trước đây, một xu hướng tương tự đã được quan sát thấy đối với các tế bào phát triển bằng rapamycin trong một thí nghiệm CLS [37].

Bước tiếp theo, người ta đo CLS của các tế bào phát triển ở các nồng độ rapamycin khác nhau. Chúng tôi đã xác định sự sống sót của tế bào bằng cách sử dụng huỳnh quang PI ở các thời điểm tuổi theo thời gian khác nhau. Điểm thời gian tăng trưởng 72 giờ được coi là ngày 1. Chúng ta có thể suy ra từ biểu đồ tỷ lệ sống sót rằng các nồng độ bổ sung rapamycin khác nhau kéo dài CLS của nấm men (Hình 4B). Tỷ lệ sống sót của các tế bào già được bổ sung rapamycin (5 nM và 10 nM) vào ngày thứ 4 là ~75 phần trăm ; tuy nhiên, không có rapamycin là ~50 phần trăm. Vào ngày thứ 7, tỷ lệ sống sót của các tế bào già được bổ sung rapamycin là 70%; tuy nhiên, không có rapamycin đã giảm xuống dưới 20 phần trăm. Sự mở rộng CLS của các tế bào già cũng có thể được quan sát thấy ở nồng độ thấp hơn (0,62–2,5 nM) của rapamycin (Hình 4B).

Chúng tôi đã xác thực giao thức của mình bằng cách so sánh trực tiếp giao thức đó với hai phương pháp phát triển nhanh truyền thống để đo CLS của men. Đầu tiên, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm phát triển nhanh trong môi trường lỏng để đo lường tác động của rapamycin đối với tuổi thọ. Sự sống sót của các tế bào lão hóa theo trình tự thời gian được theo dõi ở các độ tuổi khác nhau bằng cách chuyển môi trường nuôi cấy 3-µl vào 200μL môi trường YPD trong đĩa giếng 96-mới. Sự phát triển vượt bậc tương ứng với số lượng tế bào khả thi trong chất cấy (Hình 4). Sự phát triển vượt bậc của tế bào già được đăng ký thông qua độ hấp thụ OD600nm được xác định bằng cách sử dụng đầu đọc vi bản. Tỷ lệ sống sót được tính toán từ độ hấp thụ OD600nm vượt trội cho từng điểm tuổi so với ngày 1 (được coi là 100% tế bào sống sót). Biểu đồ sinh tồn được hiển thị trong Hình 4D.

Tương tự như vậy, chúng tôi đã tiến hành phát triển nhanh bằng cách phát hiện xét nghiệm trên môi trường thạch. Chúng tôi phát hiện 3-µl nuôi cấy lão hóa trên đĩa thạch YPD và ủ nó trong 48 giờ. Sự phát triển vượt bậc của các tế bào lâu năm trên đĩa thạch YPD được hiển thị bằng hệ thống hình ảnh GelDoc (Hình 4E). Đúng như dự đoán, chúng ta có thể quan sát các xu hướng kéo dài tuổi thọ bằng rapamycin trong cả thử nghiệm tăng trưởng chất lỏng và thạch YPD song song với các thử nghiệm được xác định bằng giao thức mới của chúng tôi.

Những kết quả này cho thấy giao thức HTS của chúng tôi tái tạo rapamycin kéo dài tuổi thọ của tế bào. Hơn nữa, chúng tôi đánh giá hệ số Z để đánh giá chất lượng của phương pháp này [38]. Nói chung, các hệ số Z trong phạm vi 0.5–1.0 là dấu hiệu của các thử nghiệm HTS xuất sắc. Yếu tố Z được xác định cho các nồng độ rapamycin khác nhau với huỳnh quang PI của các tế bào già (Hình bổ sung S2). Tài trợ của chúng tôi, hệ số Z {{10}}.70 cho 5nM rapamycin và 0,74 cho 10nM rapamycin đưa phương pháp HTS này vào danh mục chất lượng cao. Do đó, giao thức của chúng tôi đủ mạnh để xác định các hợp chất chống lão hóa tiềm năng.

Để khám phá xem phương pháp này có hiệu quả trong nền tảng di truyền nấm men khác hay không, chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng của rapamycin đối với CLS của chủng BY4743. Chủng Saccharomyces cerevisiae BY4743 là chất phụ trợ cho histidine, leucine và uracil. Chủng BY4743 được phát triển ở các nồng độ rapamycin khác nhau trong môi trường SD được bổ sung các thành phần phụ trợ. Sự sống sót của các tế bào già được định lượng bằng cách sử dụng huỳnh quang PI (Hình bổ sung S3). Chúng tôi nhận thấy rằng rapamycin làm tăng khả năng tồn tại của các tế bào BY4743 một cách định lượng theo cách tương tự như của CEN.PK113-7D. Do đó, những kết quả này cho thấy phương pháp của chúng tôi có hiệu quả ở các chủng nấm men khác nhau.

Ảnh hưởng của Glucose đến tuổi thọ theo thời gian của nấm men

Chúng tôi cũng xác thực phương pháp của mình bằng cách kiểm tra tác động của việc hạn chế calo đối với tuổi thọ theo thời gian của men. Hạn chế calo là một trong những biện pháp can thiệp đã được thiết lập để trì hoãn quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ trên toàn bộ sinh vật mẫu, bao gồm cả tế bào nấm men và động vật có vú [11, 13, 16]. Để xác định ảnh hưởng của việc hạn chế calo đối với CLS của nấm men, chúng tôi giảm hàm lượng glucose trong môi trường nuôi cấy. Chúng tôi đã nuôi cấy tế bào trong ba điều kiện môi trường SD khác nhau có chứa 0,25% , 0,5% và 2% glucose. Chúng tôi đã đo sự phát triển của tế bào tại các thời điểm khác nhau (24 giờ, 48 giờ và 72 giờ). Tất cả các nền văn hóa đạt đến độ bão hòa tăng trưởng sau 24 giờ (Hình 5A). Tốc độ tăng trưởng của tế bào thấp hơn ở 0,25 phần trăm và 0,,5 phần trăm so với 2 phần trăm glucose (Hình 5A). Chúng tôi đã đo lường sự tồn tại của quá trình lão hóa theo thời gian đối với các tế bào phát triển ở các nồng độ glucose khác nhau bằng phương pháp huỳnh quang PI (Hình 5B). Chúng tôi suy luận từ biểu đồ sinh tồn rằng việc hạn chế glucose sẽ kéo dài CLS của nấm men. Chúng tôi cũng đồng thời xác nhận việc mở rộng CLS bằng các thử nghiệm phát triển nhanh (Hình 5C, D và E), xác nhận thêm phương pháp mới của chúng tôi để xác định CLS của nấm men. Ảnh hưởng của việc hạn chế glucose đối với phần mở rộng CLS của chủng BY4743 cũng được thể hiện bằng phương pháp PICLS (Hình bổ sung S3). Do đó, cách tiếp cận của chúng tôi để đo CLS của nấm men đại diện cho một phương pháp mới, nhanh chóng và chi phí thấp để sàng lọc các tác nhân hóa học và điều kiện nuôi cấy để xác định các biện pháp can thiệp chống lão hóa.

Sàng lọc các tác nhân hóa học bằng phương pháp mới được phát triển đã xác định 2,5‑anhydrous‑D‑mannitol là một hợp chất chống lão hóa mới

Sau khi phát triển và xác thực giao thức mới, chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc hàng trăm tác nhân hóa học để xác định các hợp chất chống lão hóa (Hình bổ sung S4 và Bảng bổ sung 1). Là một trong những kết quả đáng ngạc nhiên, chúng tôi đã tìm thấy dấu hiệu cho hợp chất 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) để mở rộng CLS của men. Trong Hình 6, chúng tôi trình bày kết quả của các thí nghiệm tiếp theo chi tiết đối với hợp chất này. Chúng tôi đã thử nghiệm hoạt động chống lão hóa của 2,5-AM ở các nồng độ khác nhau trên đĩa giếng 96-. Đầu tiên, chúng tôi xác định ảnh hưởng của 2,5-AM đối với sự phát triển của tế bào. Các tế bào nấm men được ủ với nồng độ 2,5-AM khác nhau trong môi trường SD. Sự tăng trưởng của tế bào được đo tại các thời điểm khác nhau (24 giờ, 48 giờ và 72 giờ). Chúng tôi nhận thấy rằng sự phát triển của tế bào đạt đến cùng mức độ bão hòa sau 24 giờ đối với tất cả các nồng độ được thử nghiệm là 2,5-AM (Hình 6A). Sau đó, chúng tôi đo tỷ lệ sống sót của các tế bào có tuổi theo thời gian được bổ sung các nồng độ khác nhau của 2,5-AM bằng phương pháp huỳnh quang PI. Như trước đây, môi trường nuôi cấy 72h được coi là ngày đầu tiên để phân tích CLS. Biểu đồ tỷ lệ sống được vẽ cho các mốc thời gian theo trình tự thời gian khác nhau (Hình 6B). Chúng tôi thấy rằng 2,5-AM mở rộng CLS theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Tỷ lệ sống sót của các tế bào già cỗi được bổ sung 2,5-AM (8 mM) vào ngày thứ 4 là ~ 80 phần trăm ; tuy nhiên, nếu không có 2,5- AM là ~ 50 phần trăm . Vào ngày thứ 7, tỷ lệ sống sót của 25-AM tế bào già được bổ sung là ~ 75 phần trăm ; tuy nhiên, nếu không có 2,5-AM đã giảm xuống dưới 20 phần trăm . Hoạt động chống lão hóa của 2,5-AM cũng được xác minh bằng các thử nghiệm phát triển nhanh (Hình 6C, D và E).

2,5-AM là một phân tử đường có thể đi vào con đường đường phân. Nó chỉ bị thủy phân ở các bước đường phân ngược dòng gây ra sự tích tụ 2,5-AM-1,6-bisphotphat (2,5-AMBP) không được chuyển hóa trong các tế bào [39–41 ]. Để kiểm tra xem 2,5-AM ở nồng độ tương tự như thí nghiệm CLS có được xử lý bằng enzym đường phân hay không, chúng tôi đã kiểm tra độ nhạy ngày càng tăng của chủng xóa gen SNF1. SNF1 là một cảm biến năng lượng tế bào và protein kinase hoạt hóa AMP (AMPK) được bảo tồn cao ở sinh vật nhân chuẩn [42, 43]. Các tế bào nấm men thiếu hoạt động AMPK có liên quan đến kiểu hình tăng trưởng quá nhạy cảm với sự có mặt của các chất trung gian đường phân không chuyển hóa [44]. Chúng tôi đã đo lường sự phát triển của chủng loại bỏ snf1Δ với các nồng độ khác nhau của 2,5-AM. Chúng tôi nhận thấy rằng 2,5-AM ức chế sự phát triển của chủng loại bỏ snf1Δ so với chủng loại dại (Hình bổ sung. S5). Kiểu hình tăng trưởng được quan sát này cho thấy rằng 2,5-AM trải qua quá trình đường phân và bị thủy phân thành các chất trung gian đường phân không chuyển hóa.

2,5-AM là một chất tương tự của nửa đường fructose [39]. Để làm rõ liệu các loại đường khác có ảnh hưởng đến CLS hay không, chúng tôi đã kiểm tra tác động của fructose, mannitol và maltose đối với quá trình lão hóa của men. Chúng tôi cũng bao gồm sorbitol, một loại đường không chuyển hóa được báo cáo là làm tăng CLS của tế bào nấm men bằng cách tăng độ thẩm thấu của môi trường nuôi cấy [20, 45]. Đầu tiên, chúng tôi đã thử nghiệm tác động của fructose, mannitol, maltose và sorbitol đối với sự phát triển của tế bào. Các tế bào nấm men được ủ với các nồng độ khác nhau của fructose, mannitol, maltose và sorbitol tương tự như 2,5-AM trong môi trường SD. Giống như các tế bào ủ 2,5-AM, fructose, mannitol, maltose và sorbitol đạt mức bão hòa tăng trưởng sau 24 giờ (Hình 7A). Tiếp theo, chúng tôi đo tỷ lệ sống sót của các tế bào có tuổi theo thứ tự thời gian vào ngày 1, ngày 7, ngày 14 và ngày 21. Không giống như 2,5-AM, việc bổ sung fructose, mannitol, maltose và sorbitol không kéo dài tuổi thọ của tế bào. men (Hình 7B, C, D, E và Hình bổ sung S6). Đáng chú ý là 2,5-AM kéo dài tuổi thọ ngay cả ở giai đoạn cuối của quá trình lão hóa theo thời gian. Các tế bào già cỗi được bổ sung 2,5-AM (8 mM) tồn tại (~65 phần trăm ) vào ngày 21. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót của các tế bào già cỗi không được bổ sung 2,5-AM là dưới 10 phần trăm .

Thật ngạc nhiên, chúng tôi thấy rằng sorbitol ở nồng độ thấp được thử nghiệm không thể làm tăng CLS (Hình 7B, C, D, E và Hình bổ sung S6). Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng nồng độ sorbitol cao hơn có thể được yêu cầu để tăng CLS. Chúng tôi đã thử nghiệm nhiều loại nồng độ cao hơn bao gồm sorbitol 1 M, nồng độ được báo cáo trước đây là ảnh hưởng đến CLS (18 phần trăm tương đương với 1 M) [20, 45]. Phù hợp với các báo cáo trước đây, chúng tôi cũng thấy rằng nồng độ sorbitol rất cao (từ 0,5 đến 1 M) làm tăng CLS của men (Hình bổ sung S7), rõ ràng bằng cách tăng độ thẩm thấu của môi trường. Thật thú vị, CLS tăng thêm 2,5-AM ở nồng độ rất thấp (2 mM) cho thấy cơ chế hoạt động chống lão hóa của nó khác với cơ chế thẩm thấu. Những kết quả này cho thấy rằng hoạt động chống lão hóa của 2,5-AM là đặc trưng cho hợp chất đường này và không được quan sát thấy đối với một số hóa chất có cấu trúc tương tự khác.

【Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】