Tyrosine Kinase C-Abl tăng cường khả năng miễn dịch chống vi-rút qua trung gian Interferon bằng cách phosphoryl hóa STAT1
Nov 06, 2023
BẢN TÓM TẮT
Việc kích hoạt bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt thuộc họ phiên mã (STAT) do Interferon (IFN) gây ra là một sự kiện quan trọng trong khả năng miễn dịch chống vi-rút. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng các kinase không thụ thể c-Abl và Arg tương tác trực tiếp với STAT1 và tăng cường quá trình phosphoryl hóa STAT1 trên Y701. c-Abl/Arg có thể điều hòa quá trình phosphoryl hóa STAT1 độc lập với Janus kinase trong trường hợp không có IFNg và tăng cường quá trình phosphoryl hóa STAT1 qua trung gian IFNg. Hơn nữa, quá trình thu nhỏ STAT1, chuyển vị hạt nhân và phiên mã gen xuôi dòng được quy định bởi c-Abl/Arg. Sự thiếu hụt c-Abl/Arg (abl1/abl2) ngăn chặn đáng kể phản ứng kháng virus ở các tế bào bị nhiễm virus viêm miệng mụn nước. So với phương tiện, việc sử dụng chất ức chế chọn lọc c-Abl/Arg AMN107 dẫn đến tỷ lệ tử vong tăng đáng kể ở những con chuột bị nhiễm vi-rút cúm ở người. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng c-Abl đóng một vai trò thiết yếu trong đường truyền tín hiệu kích hoạt STAT1 và cung cấp một cách tiếp cận quan trọng để điều chỉnh khả năng miễn dịch chống vi-rút.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
GIỚI THIỆU
Interferon (IFN) đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh chống lại nhiễm virus và giám sát miễn dịch bằng cách điều chỉnh sự kích hoạt của Janus kinase (JAKs) và bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt phiên mã (STAT) và bằng cách lập trình lại biểu hiện gen của tế bào (Stark và Darnell, 2012). Sự gắn kết của IFN với các thụ thể tương ứng của chúng dẫn đến quá trình phosphoryl hóa chéo của ba JAK liên kết (JAK1, JAK2 và TYK2) và huy động các STAT, cho phép các gốc tyrosine đơn lẻ gần đầu C của các STAT này bị phosphoryl hóa bởi JAK (Platanias, 2005). STAT được kích hoạt sau đó dime hóa, di chuyển vào nhân và liên kết với các yếu tố khởi động của gen phản ứng với IFN để tạo ra sự phiên mã của chúng. Quá trình phosphoryl tyrosine của STAT là một bước thiết yếu trong con đường truyền tín hiệu IFN JAK-STAT và có liên quan đến quá trình thu nhỏ STAT, chuyển vị hạt nhân và liên kết DNA (Stark và Darnell, 2012). Do đó, quá trình phosphoryl tyrosine hoạt động như một công tắc kích hoạt STAT. Bằng chứng thu được thông qua việc phá vỡ mục tiêu các gen JAK ở chuột cho thấy rằng JAK là tyrosine kinase STAT quan trọng nhất (Villarino và cộng sự, 2017). Tuy nhiên, dư lượng tyrosine trong STAT1, STAT3 và STAT5 cũng đã được chứng minh là bị phosphoryl hóa trong các tế bào thiếu JAK bởi yếu tố tăng trưởng biểu bì và các thụ thể của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu có hoạt tính tyrosine kinase nội tại (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Ngoài ra, sự kích hoạt cấu thành STAT đã được quan sát thấy trong các tế bào biến đổi biểu hiện các tyrosine kinase gây ung thư như v-Src, v-Abl và BCR-Abl, nhưng liệu STAT có phải là cơ chất trực tiếp của các kinase này hay không vẫn chưa được xác định (Danial và Rothman). , 2000; Reddy và cộng sự, 2000). Abelson kinase c-Abl của động vật có vú được mã hóa bởi gen c-abl (abl1) và protein gen liên quan đến Abl Arg được mã hóa bởi gen arg (abl2) là thành viên của họ tyrosine kinase không thụ thể nội bào cần thiết cho nhiều quá trình tế bào, bao gồm tăng sinh, apoptosis, bám dính, di chuyển tế bào và phản ứng căng thẳng (Bradley và Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Hoạt động kinase của c-Abl được điều hòa chặt chẽ trong điều kiện sinh lý bình thường. Các sự kiện tải nạp retrovirus và chuyển vị nhiễm sắc thể làm phát sinh biểu hiện của v-Abl hoặc BCR-Abl, một dạng Abl gây ung thư, tương ứng (Advani và Pendergast, 2002). Ngoài ra, việc xóa mục tiêu gen c-abl ở chuột dẫn đến các kiểu hình đa năng liên quan đến rối loạn chức năng miễn dịch, bao gồm tỷ lệ tử vong chu sinh cao, teo lách và tuyến ức, giảm bạch cầu lympho và tăng tính nhạy cảm với nhiễm trùng (Schwartzberg và cộng sự, 1991). Hơn nữa, việc điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính (CML) có BCR-Abl dương tính bằng thuốc ức chế Abl STI571 (imatinib) và AMN107 (nilotinib) có liên quan đến tình trạng ức chế miễn dịch ở một nhóm nhỏ bệnh nhân (Dietz và cộng sự, 2004; Hochhaus và cộng sự, 2016; Mattiuzzi và cộng sự, 2003). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng cAbl đóng vai trò trong việc điều hòa sự truyền tín hiệu qua trung gian TCR (thụ thể tế bào T) - và BCR (thụ thể tế bào B), sự phát triển, tăng sinh và sản xuất cytokine (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002 ; Silberman và cộng sự, 2008). Những con chuột bị thiếu Abl cũng biểu hiện số lượng tế bào T/B giảm (Gu và cộng sự, 2009; Liberatore và Goff, 2009; Schwartzberg và cộng sự, 1991). Tuy nhiên, các cơ chế làm suy giảm khả năng miễn dịch phát sinh khi không có hoặc ức chế c-Abl vẫn khó nắm bắt. Đã có báo cáo rộng rãi rằng đường truyền tín hiệu JAK-STAT rất cần thiết cho quá trình biến đổi do BCR-Abl gây ra (Carlesso và cộng sự, 1996; Danial và cộng sự, 1998; de Groot và cộng sự, 1999). Do đó, cần điều tra xem liệu JAK-STAT cũng có thể đóng góp vào khả năng miễn dịch bẩm sinh liên quan đến c-Abl hay không. Ở đây, chúng tôi báo cáo rằng STAT1 tương tác với và bị phosphoryl hóa bởi c-Abl theo cách độc lập với JAK, nhờ đó quá trình thu nhỏ, định vị hạt nhân và phiên mã gen xuôi dòng của STAT1 được điều hòa. Những phát hiện này tiết lộ rằng, ngoài JAK kinase, c-Abl là không thể thiếu để kích hoạt hoàn toàn STAT1 và các phản ứng chống vi-rút qua trung gian IFN tiếp theo.
Lợi ích của cistanche tubulosa-tăng cường hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
KẾT QUẢ
Sự phiên mã của các gen hạ lưu trình tự interferon được kích hoạt bằng gamma được điều hòa bởi Abl kinase
Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 đã được xác định trong c-abl/arg double-knockout (DKO) và WT MEF, trong đó 960 được điều chỉnh tăng và 784 được điều chỉnh giảm (Hình 1A, bên trái). Để nghiên cứu sâu hơn về các chức năng tế bào tiềm năng và các con đường liên quan của các DEG này, chúng tôi đã thực hiện phân tích Gene Onology (GO) (đối với các thuật ngữ trong quá trình sinh học, chức năng phân tử và thành phần tế bào) (Hình S1A). Các gen được điều hòa bởi c-Abl và Arg chủ yếu liên quan đến phản ứng phòng vệ virus (GO: 0009615, GO: 0051607 và GO: 0045071) và phản ứng miễn dịch (GO: 0002376, GO: 0045087). Phân tích sâu hơn cho thấy các gen đặc hiệu IFN (Liu và cộng sự, 2012) đã được làm giàu trong số các gen bị điều hòa quá mức (Hình 1A, bên phải và S1B). Để xác thực các cấu hình biểu hiện khác biệt, mức độ phiên mã của các gen kháng vi-rút, bao gồm cxcl10, psmb9, tap1 và isg15, đã được xác định thông qua các xét nghiệm định lượng chuỗi phản ứng sao chép ngược thời gian thực (RT-PCR) và được chuẩn hóa thành các mức psma5 , không được quy định chặt chẽ bởi c-Abl. So với WT MEF, c-abl / arg / MEF biểu hiện mức độ phiên mã của các gen này thấp hơn đáng kể, nhưng mức giảm do DKO gây ra đã bị đảo ngược hoàn toàn nhờ giải cứu c-Abl theo cách phụ thuộc vào liều (Hình 1B và S1C). Những dữ liệu này cho thấy rằng một nhóm gen do IFN gây ra đã được quy định bởi c-Abl và Arg. Để nghiên cứu các yếu tố phiên mã quan trọng do Abl kinase điều chỉnh để đáp ứng với IFN, một hệ thống báo cáo luciferase đã được xây dựng dựa trên trình khởi động hai chiều dùng chung tap1/psmb9 do IFNg điều chỉnh (Hình 1C). Đúng như dự đoán, chất ức chế chọn lọc c-Abl/Arg AMN107 đã ức chế đáng kể hoạt động phiên mã của chất kích thích tap1 (màu đỏ) (Hình 1D). Đáng chú ý, không giống như việc xóa các phần tử trình tự đồng thuận NFkB (màu xanh) hoặc IFN (màu vàng), việc xử lý AMN107 có rất ít ảnh hưởng nếu có bất kỳ ảnh hưởng nào đến hoạt động của trình khởi động tap1 khi phần tử chuỗi kích hoạt gamma (GAS) (màu xanh lá cây) bị xóa (Hình 1D ). Những phát hiện này chỉ ra rằng phần tử cis GAS nhắm mục tiêu STAT{47}}có liên quan đến quá trình phiên mã tap1 do c-Abl điều chỉnh, điều này gợi ý rõ ràng rằng STAT1 chịu trách nhiệm điều chỉnh biểu hiện gen phản ứng IFN qua trung gian c-Abl.
c-Abl tương tác trực tiếp với STAT1
Biểu thức TAP1 do IFN gây ra được điều chỉnh bởi c-Abl, có thể thông qua STAT1, cho thấy STAT1 có thể được liên kết với c-Abl. Để xác nhận giả thuyết này, các tế bào ly giải của tế bào MCF-7 đã được kích thích miễn dịch chống c-Abl, sau đó là quá trình hủy miễn dịch bằng kháng thể kháng STAT1. STAT1 có mặt trong chất chống c-Abl nhưng không có trong chất ức chế miễn dịch IgG (Hình 2A). Tiếp theo, các ô 293T đã được bảo vệ bằng Myc-cAbl và Flag-STAT1 hoặc Flag-Vector làm đối chứng. Sự hiện diện của Myc-c-Abl trong các chất kích thích miễn dịch chống Flag được điều chế từ các tế bào cùng tồn tại Flag-STAT1 nhưng không phải Flag-Vector cho thấy mối liên quan giữa Myc-c-Abl và Flag-STAT1 biểu hiện ngoài tử cung (Hình 2B, bên trái). Một kết quả tương tự cũng thu được trong một thí nghiệm thuận nghịch (Hình 2B, bên phải). Ngoài ra, thành viên khác của họ Abl, Arg (Abl2), rất tương đồng với c-Abl trong miền đầu cuối N (NTD), cũng tương tác với STAT1 (Hình S2A).
Hình 1. c-Abl điều chỉnh các yếu tố khởi động của gen phản ứng IFN thông qua các yếu tố GAS
Tiếp theo, các lysate được điều chế từ các tế bào 293T biểu hiện Flag-c-Abl được ủ với GST-STAT1 hoặc GST liên hợp với agarose và Flag-c-Abl được phát hiện trong GST-STAT1 chứ không phải các chất hấp phụ GST (Hình 2C). Để loại trừ sự liên kết gián tiếp qua trung gian bởi các thành phần khác trong dung dịch ly giải tế bào, các chất kích thích miễn dịch chống Flag được điều chế từ các tế bào 293T biểu hiện Flag-c-Abl đã được xử lý bằng SDS-PAGE (điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide) và các protein được chuyển đến màng PVDF (polyvinylidene fluoride) và sau đó thấm bằng GST-STAT1 hoặc GST hòa tan (làm đối chứng). Kết quả cho thấy GST-STAT1, chứ không phải GST, liên kết trực tiếp với c-Abl trong ống nghiệm (Hình 2D). Để xác định miền liên kết c-Abl, STAT1 có độ dài đầy đủ hoặc cắt ngắn được liên hợp với agarose và GST (Hình 2E, bảng trên) đã được ủ với các phân tử của các ô 293T biểu thị Flag-c-Abl. Phân tích các chất hấp phụ bằng phương pháp mô phỏng miễn dịch với kháng thể chống Flag đã chứng minh rằng các axit amin 577–750 của STAT1, bao gồm một vùng chứa miền SH2 và miền giao dịch, chịu trách nhiệm cho tương tác c-Abl (Hình 2E, bảng dưới) . Tương tự, Flag-STAT1 được kích thích miễn dịch bởi kháng thể chống Flag được phân tách bằng SDS-PAGE và được chuyển vào màng PVDF. Sau đó, màng này được làm mờ chỉ bằng GST-c-Abl SH3 hoặc GST-c-Abl SH2 và GST hòa tan. Kết quả cho thấy miền c-Abl SH3 là miền chính chịu trách nhiệm liên kết STAT1 (Hình 2F). Hơn nữa, sự tương tác tại chỗ của c-Abl nội sinh với STAT1 được đánh giá bằng xét nghiệm thắt gần Duolink (PLA). Các phức hợp STAT1:c-Abl được quan sát chủ yếu trong tế bào chất và sự hình thành các phức hợp này được tăng cường đáng kể nhờ kích thích IFNg (Hình 2G). Nói chung, những phát hiện này chứng minh mối liên hệ trực tiếp giữa c-Abl và STAT1 cả in vitro và in vivo.
Hình 2. c-Abl tương tác với STAT1
c-Abl làm trung gian cho quá trình phosphoryl hóa STAT1 độc lập với JAK
Để tìm hiểu xem STAT1 có phải là cơ chất của c-Abl hay không, STAT1 được gắn thẻ của Ngài đã được tinh chế đã được ủ với c-Abl tái tổ hợp (chứa miền xúc tác ở các axit amin 237–643) với sự hiện diện của ATP cho xét nghiệm kinase in vitro. Quá trình miễn dịch đánh dấu sản phẩm phản ứng bằng chất chống phospho-tyrosine và chất chống phospho-STAT1 Y701 đã chứng minh rằng STAT1 bị phosphoryl hóa trực tiếp bởi c-Abl ở (các) dư lượng tyrosine, bao gồm cả Y701, trong ống nghiệm (Hình 3A). Tiếp theo, chúng tôi phát hiện ra rằng Flag-STAT1 được biểu hiện trong các tế bào 293T đã bị tyrosine phosphoryl hóa, đặc biệt là trên dư lượng Y701, bởi Myc-c-Abl nhưng không phải là đột biến không hoạt động kinase Myc-c-Abl (K290R). Hơn nữa, khi điều trị bằng chất ức chế chọn lọc c-Abl/Arg AMN107, quá trình phosphoryl hóa STAT1 qua trung gian c-Abl gần như bị loại bỏ, điều này cho thấy rằng quá trình phosphoryl tyrosine của STAT1 phụ thuộc vào hoạt động của c-Abl kinase (Hình 3B). Quá trình phosphoryl hóa STAT1 qua trung gian c-Abl bị suy giảm đáng kể khi STAT1 Y701 được thay thế bằng phenylalanine, cho thấy Y701 là phosphosite chính của Abl (Hình 3C). Hơn nữa, STAT1 cũng bị phosphoryl hóa bởi Arg (Hình S2B). Để phân định rõ hơn dư lượng STAT1 cụ thể được phosphoryl hóa bởi c-Abl, Flag-STAT1 cùng tồn tại với Myc-c-Abl đã được tiến hành sắc ký lỏng kết hợp với phân tích khối phổ song song. Ngoài phosphosite STAT1 Y701 được xác định rõ ràng và có chức năng quan trọng (Schindler và cộng sự, 1992; Shuai và cộng sự, 1993), hai loại phosphosite khác là Y106 và Y665 cũng đã được xác định (Hình S4A). So với WT STAT1, cả hai đột biến Y106F và Y701F đều biểu hiện sự tổn hại đến quá trình phosphoryl tyrosine (Hình 3C). Tuy nhiên, quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 không bị ảnh hưởng đáng kể bởi quá trình phosphoryl hóa Y106 và Y665, cho thấy Y106 và Y665 có thể đóng các vai trò riêng biệt (Hình S4B). Cùng với nhau, những phát hiện này chỉ ra rằng dư lượng tyrosine của STAT1, bao gồm cả dư lượng Y701 được báo cáo trước đó, có thể bị phosphoryl hóa bởi kinase họ Abl.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
JAK chịu trách nhiệm chính cho quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 do IFN gây ra (Villarino và cộng sự, 2017). Đúng như dự đoán, quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 được tạo ra bởi IFNg và bị ức chế đáng kể bởi ruxolitinib, một chất ức chế đặc hiệu kép của JAK1 và JAK2 (Hình 3D). Đáng chú ý, sự phosphoryl hóa Y701 bị tổn hại cũng được quan sát thấy khi ức chế Abl (Hình 3D, làn 4), cho thấy rằng c-Abl góp phần một phần vào việc kích hoạt STAT1 do IFNg gây ra. Hơn nữa, quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 cũng được tạo ra bởi DPH, một chất kích hoạt c-Abl thấm vào tế bào, ở mức độ thấp hơn so với IFNg, có thể bị đảo ngược hoàn toàn bởi AMN107 (Hình 3E). Để xác nhận kích hoạt Abl do DPH gây ra, quá trình phosphoryl hóa c-Abl Y412, một chỉ báo kích hoạt Abl, cũng đã được phát hiện (Hình 3E). Người ta đã chứng minh rằng kích hoạt JAK2 xảy ra trước tiên và cần thiết cho lần kích hoạt JAK1 tiếp theo (Briscoe và cộng sự, 1996). Để loại trừ ảnh hưởng của JAK2 đến quá trình kích hoạt STAT1, chúng tôi đã thiết lập dòng tế bào jak2-KO MCF-7 thông qua CRISPR. Sự phosphoryl hóa STAT1 Y701 giảm nhưng có thể phát hiện được đã được quan sát thấy trong các tế bào jak2-KO MCF-7 so với tế bào MCF-7 của cha mẹ, có thể được tăng cường tương tự khi có Myc-c-Abl nhưng không phải Myc-c-Abl (K290R) (Hình 3F) và càng giảm đi sau khi điều trị bằng AMN107. Trong c-abl / arg/cell, quá trình phosphoryl hóa STAT1 do IFNg gây ra ở Y701 đã bị tổn hại rất nhiều theo cách phụ thuộc vào thời gian và liều lượng (Hình 3G). Tất cả những quan sát này chứng minh rằng c-Abl kinase có thể trực tiếp phosphoryl hóa và kích hoạt STAT1 độc lập với đường truyền tín hiệu IFNg-JAK và điều quan trọng là hai kinase này có thể có tác dụng hiệp đồng lên quá trình phosphoryl hóa STAT1 tại Y701.
Hình 3. STAT1 bị phosphoryl hóa bởi c-Abl
Hình 4. c-Abl thúc đẩy sự hình thành dimer STAT1 và nhập khẩu hạt nhân
Sự phosphoryl hóa qua trung gian c-Abl điều chỉnh hoạt động giao dịch STAT1
Quá trình phosphoryl tyrosine của STAT là một bước thiết yếu trong con đường truyền tín hiệu IFN JAK-STAT và có liên quan đến quá trình thu nhỏ STAT, chuyển vị hạt nhân và liên kết DNA. Để điều tra xem liệu quá trình phosphoryl hóa qua trung gian c-Abl có điều chỉnh quá trình thu nhỏ STAT hay không, GFP-STAT1 và Flag-STAT1 đã cùng tồn tại trong các tế bào 293T khi có hoặc không có Myc-c-Abl. Nồng độ GFP-STAT1 trong thuốc kích thích miễn dịch chống Flag đã được kiểm tra để chỉ ra sự giảm thiểu STAT1. Như được hiển thị trong Hình 4A, sự cùng tồn tại của c-Abl đã thúc đẩy sự hình thành các homodimer STAT1-STAT1. Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang của các tế bào MCF{18}} đã chứng minh thêm rằng việc cắt bỏ c-abl/arg hoặc điều trị bằng AMN107 làm suy giảm đáng kể sự chuyển vị hạt nhân STAT1 do IFNg gây ra (Hình 4B và 4C).
Hơn nữa, các thử nghiệm dịch chuyển độ di động đã được sử dụng để phân tích hoạt động liên kết chất xúc tác của STAT1. Vùng quảng bá IRF1 được gắn thẻ biotin chứa trình tự đồng thuận liên kết STAT1 đã được sử dụng làm đầu dò phát hiện (Aaronson và Horvath, 2002). Đầu dò này được ủ với chiết xuất hạt nhân từ các tế bào 293T biểu hiện ngoại sinh STAT1 có hoặc không có c-Abl, được cân bằng dựa trên Hình S5A. Như được hiển thị trong Hình 4D, nhiều phức hợp liên kết với đầu dò IRF1 có chứa STAT1 đã được quan sát thấy trong chiết xuất hạt nhân (Hình 4D, làn 1). Sự hình thành phức hợp tăng nhẹ khi xử lý IFNg (Hình 4D, làn 2) và tăng đáng kể trong các tế bào biểu hiện ngoài tử cung c-Abl (Hình 4D, làn 3). Tuy nhiên, so với WT STAT1, c-Abl cho thấy rất ít nếu có bất kỳ ảnh hưởng nào đến liên kết trình khởi động của STAT1 chứa Y701F (Hình 4D, làn 7 và 8), trong khi các đột biến Y106F và Y665F gần như không có sự khác biệt với WT STAT1. Tính đặc hiệu của các phức hợp chứa STAT1 và đầu dò phát hiện đã được xác nhận khi bổ sung đầu dò của đối thủ cạnh tranh không được gắn thẻ (Hình 4D, làn 9). Hơn nữa, việc bổ sung kháng thể kháng STAT1 đã dẫn đến sự hình thành dải siêu dịch (Hình 4D, làn 11). Khi các đầu dò được gắn thẻ được ủ với chiết xuất hạt nhân của tế bào 293T làm đối chứng, không quan sát thấy phức hợp nào (Hình 4D, ngõ 10). Những kết quả này chứng minh rằng quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 qua trung gian c-Abl có khả năng liên kết STAT1 với các chất xúc tiến mục tiêu của nó.
Hình 5. c-Abl điều hòa biểu hiện gen liên quan đến IFN
Sau đó, quá trình tương tác do IFNg gây ra đối với các gen chính được điều hòa STAT{1}}, bao gồm ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 và tap1, được đánh giá bằng WT hoặc c-abl/ arg DKO MCF-7 tế bào thông qua RT-PCR. Đúng như dự đoán, quá trình phiên mã gen bị suy giảm đáng kể do sự suy giảm c-abl/arg (Hình 5A). Hơn nữa, các gen thường được tạo ra bởi IFNg và IFN không thể được kích thích bởi IFN khi có mặt AMN107 (Hình 5B và 5C). Những phát hiện này chứng minh rằng hoạt động giao dịch của STAT1 được điều chỉnh tích cực bởi c-Abl.
c-Abl phát huy tác dụng chống vi-rút phụ thuộc IFN
TAP1 và PSMB9 tham gia vào quá trình sản xuất và trình bày các peptide trong quá trình xử lý kháng nguyên MHC lớp I (Ghannam và cộng sự, 2014; Vitale và cộng sự, 1998). Theo những phát hiện trước đó, sự trình diện kháng nguyên của ovalbumin bởi tế bào JAWS II đến tế bào B3Z đã bị AMN107 ức chế đáng kể do sản xuất IL2 giảm (Hình 6A). Để đánh giá thêm về hậu quả sinh học chống vi rút của quy định STAT1 bằng c-Abl, WT và c-abl / arg / MEF được xử lý trước có hoặc không có IFNg pha loãng huyết thanh đã bị nhiễm vi rút viêm miệng mụn nước (VSV). Nhiễm VSV gây chết tế bào nghiêm trọng hơn ở c-abl/arg/MEF và tế bào WT được điều trị bằng AMN107 so với WT MEF được điều trị bằng phương tiện (Hình 6B). Điều trị bằng IFNg làm giảm đáng kể tình trạng chết tế bào do nhiễm virus, nhưng nó có tác dụng kém rõ rệt hơn khi có AMN107. Phù hợp với phát hiện này, việc cắt bỏ c-abl/arg trong MEFs dẫn đến không nhạy cảm với kích thích IFN, nhưng hiệu ứng này đã được đảo ngược đáng kể khi giải cứu c-Abl (Hình 6B). Tiếp theo, các tế bào A549 được điều trị có hoặc không có AMN107 đã bị nhiễm vi-rút bệnh Newcastle (NDV) biểu hiện GFP và kết quả cho thấy rằng sự nhân lên của vi-rút cũng được tăng cường nhờ xử lý AMN107 nhưng bị ức chế bởi biểu hiện c-Abl (Hình 6C). Theo phát hiện rằng việc chuyển gen DNA dẫn đến kích hoạt phản ứng IFN nội sinh (Park và cộng sự, 2003), việc chuyển gen bằng vec tơ pcDNA đã ức chế sự tăng sinh của virus. Đáng chú ý, việc truyền Flag-c-Abl dẫn đến tác dụng ức chế rõ rệt hơn đối với sự tăng sinh của virus so với việc truyền với một vec tơ trống (Hình 6C). Hơn nữa, điều trị bằng IFNg có rất ít tác dụng đối với tình trạng nhiễm vi-rút khi có chất ức chế chọn lọc c-Abl AMN107 (Hình 6D). Những dữ liệu này cho thấy c-Abl đóng vai trò quan trọng trong tác dụng kháng vi rút qua trung gian STAT. Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của c-Abl đối với việc lây nhiễm vi-rút ở chuột call/fl, Lck-Cre (c-abl-có điều kiện, c-abl-cKO), trong đó c-abl bị loại bỏ đặc biệt trong tế bào tuyến ức (Hình S7A ) vì việc loại bỏ gen c-abl trong dòng mầm dẫn đến bỏ chạy và chết trong vòng hai tuần đầu tiên sau khi sinh (Koleske và cộng sự, 1998; Schwartzberg và cộng sự, 1991). Sau đó, chuột WT và c-abl-cKO bị nhiễm vi-rút cúm A (IAV) qua đường mũi. Tỷ lệ tử vong cao hơn không đáng kể về mặt thống kê đã được quan sát thấy ở chuột c-abl-cKO so với chuột WT. Chuột WT liên tục sử dụng AMN107, có tác dụng ức chế một cách có hệ thống các kinase c-Abl/Arg trong tất cả các mô, cho thấy độ nhạy cảm với IAV tăng lên đáng kể (Hình 6E). Nói chung, những phát hiện này chỉ ra rằng c-Abl cần thiết cho khả năng miễn dịch chống vi-rút ở động vật.
Hình 6. c-Abl phát huy tác dụng kháng virus phụ thuộc vào IFN
CUỘC THẢO LUẬN
IFNg là một trong những cytokine điều chỉnh miễn dịch quan trọng nhất và đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh chống lại nhiễm virus. Trong tín hiệu IFNg chính tắc, khi kích thích IFNg, JAK1 và JAK2 được tuyển dụng vào đuôi tế bào chất của các thụ thể IFNg tổng hợp (IFNGR) và được kích hoạt thông qua các sự kiện tự phosphoryl hóa và chuyển hóa phosphoryl hóa tuần tự (Stark, 2007; Villarino và cộng sự, 2017). Sau đó, STAT1 gắn vào IFNGR bằng cách liên kết miền SH2 của nó với trình tự nhận dạng trong IFNGR (Y440DKPH444), trong đó Y440 bị phosphoryl hóa bởi JAKs (Greenlund và cộng sự, 1995). Sau quá trình phosphoryl hóa tại Y701 bởi JAK, STAT1 thu nhỏ và chuyển vị trí vào nhân, nơi nó thúc đẩy quá trình phiên mã của một loạt gen phản ứng IFNg (Aaronson và Horvath, 2002; Stark và Darnell, 2012). Sự cắt bỏ Stat1 ở chuột dẫn đến không có phản ứng phiên mã với IFN và thiếu các hoạt động kháng khuẩn và kháng vi-rút do IFN gây ra trong tế bào (Meraz et al., 1996). Stat1 / chuột cũng cho thấy tính nhạy cảm ngày càng tăng đối với sự phát triển của các khối u tự phát và do hóa chất ({20}}methylcholanthrene) (Kaplan và cộng sự, 1998) và mẫn cảm với một số bệnh lý viêm (Bettelli và cộng sự, 2004; Villarino và cộng sự ., 2010). Hơn nữa, tín hiệu STAT1 bảo vệ tế bào T khỏi độc tế bào qua trung gian tế bào giết người tự nhiên (Kang và cộng sự, 2019).Những phát hiện này cho thấy STAT1 làm trung gian kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch khối u.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Schlatterer và cộng sự. báo cáo rằng c-Abl, chứ không phải Arg, có thể gây mất tế bào thần kinh bằng cách thúc đẩy kích hoạt STAT1 và sản xuất interferon. Tuy nhiên, cơ chế chính xác chịu trách nhiệm kích hoạt STAT1 phụ thuộc vào c-Abl vẫn chưa được làm rõ (Schlatterer và cộng sự, 2012). Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng c-Abl liên kết và phosphoryl hóa STAT1 và tương tác trực tiếp với STAT2 trong ống nghiệm (Hình 2 và 3, S8A, S9A và S10A). STAT1 Y701 được phosphoryl hóa độc quyền bởi JAK kinase, điều chỉnh sự hình thành dimer STAT1 (Schindler và cộng sự, 1992; Shuai và cộng sự, 1993) và sự chuyển dịch nucleocytoplasmic trong quá trình truyền tín hiệu IFNg (Mao và cộng sự, 2005; Mertens và cộng sự, 2006; Chung và cộng sự, 2005). Nghiên cứu của chúng tôi bất ngờ phát hiện ra rằng c-Abl, một kinase khác ngoài JAK, cũng góp phần vào quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 một cách độc lập (Hình 3). Mặc dù quá trình phosphoryl hóa Y701 qua trung gian c-Abl không mạnh bằng JAK, nhưng có vẻ như Y701 cần đạt được mức phosphoryl hóa tối đa vì quá trình phosphoryl hóa Y701 bị suy giảm nghiêm trọng đã được quan sát thấy trong c-abl / arg/cell khi kích thích IFNg và IFNg- Sự phosphoryl hóa STAT1 Y701 gây ra đã bị ức chế bởi AMN107, từ 1,25 mM đến 5 mM, theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 3G và S11A). Tuy nhiên, quá trình phosphoryl hóa Y701 không bị ảnh hưởng nhiều bởi trạng thái phosphoryl hóa của Y106 và Y665, hai phosphosite khác của c-Abl, cho thấy rằng quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 mạnh không phải là kết quả của quá trình phosphoryl hóa đa vị trí qua trung gian c-Abl của STAT1 nhưng có thể được cho là do hoạt động JAK được tăng cường. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sự kích hoạt cấu thành JAK1 và sự kích hoạt biến đổi của JAK2 đã được quan sát thấy trong các tế bào biểu hiện BCR-Abl (Chai và cộng sự, 1997; Henderson và cộng sự, 1997; Shuai và cộng sự, 1996). Hơn nữa, BCR-Abl đã được chứng minh là có khả năng kích hoạt STAT1 và STAT2 một cách khiêm tốn thông qua quá trình phosphoryl tyrosine của JAK1, JAK2 và JAK3 (Henderson và cộng sự, 1997). Bằng chứng hiện tại chứng minh rằng Abl và JAK có thể có tác dụng hiệp đồng rõ rệt đối với quá trình phosphoryl hóa STAT1 tại Y701 (Hình 3E).
Ngoài Y701, quá trình phosphoryl hóa Y106 và Y665 cũng được xác định đồng thời (Hình 3C và S4A). Các phosphosite này không tham gia vào quá trình phosphoryl hóa STAT1 Y701 hoặc quá trình đồng hóa STAT1 (Hình S4B và S4C). Tuy nhiên, Murphy và các đồng nghiệp nhận thấy rằng sự tương tác giữa các NTD (miền tương tác protein đầu N, axit amin 1–136) của các monome là cần thiết cho quá trình dimer hóa các phân tử STAT có chiều dài đầy đủ không được phosphoryl hóa (Ota và cộng sự, 2004). Các đột biến STAT1 (F77A và/hoặc L78A) không hình thành được các dime không được phosphoryl hóa và các đột biến này biểu hiện quá trình phosphoryl hóa liên tục theo kiểu hình trong các tế bào được xử lý bằng IFN và khả năng kháng lại quá trình khử phospho qua trung gian TC{20}}trong ống nghiệm (Mertens và cộng sự, 2006). Y106 trong NTD, gần F77 và L78, có thể chịu trách nhiệm duy trì STAT1 ở trạng thái dimer phosphoryl hóa và duy trì STAT1 trong nhân dưới bức xạ ion hóa (Hình S6A và S6B). Hơn nữa, miền SH2 tương tác với miền chứa tyrosine được phosphoryl hóa khi sự hình thành homodimer được phosphoryl hóa được tạo ra bởi IFN (Shuai và cộng sự, 1994). Y665, nằm trong miền SH2, có thể ảnh hưởng đến quá trình thu nhỏ. Chức năng của các vị trí phosphoryl hóa qua trung gian c-Abl (Y106 và Y665) cần được nghiên cứu thêm.
Tương tự như JAK, quá trình phosphoryl hóa qua trung gian c-Abl điều chỉnh sự hình thành dimer STAT1 (bao gồm sự hình thành dimer STAT1- STAT1 và sự hình thành dị vòng STAT1-STAT2 (Hình 4A, S12A và S12B)), chuyển vị hạt nhân, liên kết DNA và phiên mã các gen được kích thích bằng IFN. Sự gián đoạn Abl đã góp phần làm tăng khả năng tăng sinh của virus và làm tăng sự chết tế bào do virus gây ra (Hình 6B, 6C và 6D). Hơn nữa, chúng tôi thấy rằng bức xạ ion hóa (IR) gây ra sự chuyển vị hạt nhân STAT1 khi không có chất ức chế c-Abl (Hình S6A và S6B). IR kích hoạt trực tiếp c-Abl (Pendergast, 2002) và sau đó là tín hiệu IFNg phụ thuộc STAT{21}}, có thể cung cấp một cơ chế cơ bản mà qua đó xạ trị bắt đầu một cuộc tấn công miễn dịch thích ứng và bẩm sinh theo tầng IFN lên khối u (Burnette et al ., 2011) và mang lại trạng thái miễn dịch bẩm sinh mạnh mẽ hơn để đáp ứng với các kích thích IR. So với những con chuột cùng lứa với WT, những con chuột bị loại bỏ c-abl một cách có điều kiện trong tế bào tuyến ức cho thấy tỷ lệ tử vong cao hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê. Đáng chú ý, những con chuột được sử dụng chất ức chế c-Abl/Arg AMN107 một cách có hệ thống có tỷ lệ tử vong cao hơn (Hình 6E), điều này cho thấy rằng biểu hiện c-Abl ở nhiều loại mô đã góp phần tạo ra khả năng miễn dịch chống vi-rút ở động vật. Từ những dữ liệu này, chúng tôi đề xuất rằng Abl nội sinh mang lại khả năng kháng cơ bản tiềm ẩn đối với nhiễm virus và Abl được kích hoạt được kích thích bằng cách che chắn bức xạ ion hóa các tế bào. Abl kinase được kích hoạt cơ bản ở hầu hết bệnh nhân mắc CML. Thuốc ức chế Abl kinase STI571 và AMN107 là phương pháp điều trị tuyến đầu cho liệu pháp CML. Tuy nhiên, nhiễm trùng đường hô hấp trên và ức chế miễn dịch thường được quan sát thấy, nguyên nhân có thể là do con đường điều hòa miễn dịch qua trung gian STAT bị ức chế (Hochhaus và cộng sự, 2016; Mattiuzzi và cộng sự, 2003). Những phát hiện của chúng tôi đã bổ sung thêm nền tảng lý thuyết để tối ưu hóa liệu pháp này.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Tóm lại, tyrosine kinase c-Abl được phát hiện có liên kết với STAT1 in vivo và in vitro, để thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa STAT1 ở Y701 độc lập với JAK, để tăng cường khả năng giao dịch và điều hòa các phản ứng miễn dịch bẩm sinh chống lại nhiễm trùng, đặc biệt là trong bối cảnh c-Abl -Căng thẳng liên quan đến Abl. Phát hiện của chúng tôi cung cấp một cách tiếp cận bổ sung để kích hoạt STAT1, góp phần nâng cao kiến thức ngày càng tăng về việc điều chỉnh đường dẫn tín hiệu xuôi dòng IFN.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
Aaronson, DS và Horvath, CM (2002). Lộ trình dành cho những người chưa biết JAK-STAT. Khoa học 296, 1653–1655.
Advani, AS và Pendergast, AM (2002). Các biến thể BcrAbl: khía cạnh sinh học và lâm sàng. Leuk. Res. 26, 713–720.
Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH và Kuchroo, VK (2004). Mất T-bet, nhưng không phải STAT1, sẽ ngăn ngừa sự phát triển của bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm. J. Exp. Med. 200, 79–87.
Bradley, WD và Koleske, AJ (2009). Sự điều hòa sự di chuyển tế bào và hình thành hình thái bởi các kinase thuộc họ Abl: các cơ chế mới nổi và bối cảnh sinh lý. J. Khoa học tế bào. 122, 3441–3454.
Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN và Kerr, IM (1996). Các đột biến âm tính Kinase của JAK1 có thể duy trì biểu hiện gen cảm ứng interferon-gamma nhưng không ở trạng thái kháng vi-rút. EMBO J. 15, 799–809.
Carlesso, N., Frank, DA và Griffin, JD (1996). Hoạt động phosphoryl hóa Tyrosyl và liên kết DNA của các bộ chuyển đổi tín hiệu và chất kích hoạt protein phiên mã (STAT) trong các dòng tế bào tạo máu được biến đổi bởi Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.
Chai, SK, Nichols, GL và Rothman, P. (1997). Kích hoạt liên tục JAK và STAT trong các dòng tế bào biểu hiện BCR Abl và tế bào máu ngoại vi có nguồn gốc từ bệnh nhân bạch cầu. J. Miễn dịch. 159, 4720–4728.
Colicelli, J. (2010). ABL tyrosine kinase: sự phát triển của chức năng, quy định và tính đặc hiệu. Khoa học. Tín hiệu. 3, lại6.
Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY và Rothman, PB (1998). Cần có sự tương tác trực tiếp giữa Jak1 và v-Abl để kích hoạt STAT và tăng sinh do v-Abl gây ra. Mol. Tế bào sinh học. 18, 6795–6804.
Danial, NN và Rothman, P. (2000). Tín hiệu JAK-STAT được kích hoạt bởi gen gây ung thư Abl. Gen gây ung thư 19, 2523–2531.
de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R., và Koenderman, L. (1999). Kích hoạt STAT5 bởi BCR-Abl góp phần chuyển đổi các tế bào ung thư bạch cầu K562. Máu 94, 1108–1112.
Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR, và Vuk-Pavlovic, S. (2004). Imatinib mesylate ức chế sự tăng sinh tế bào T trong ống nghiệm và quá mẫn loại chậm trong cơ thể. Máu 104, 1094–1099.
Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C., và Liu, X. (2017). Quy định toàn cầu về biểu hiện gen khác biệt bằng kinase gây ung thư c-abl/arg. Med. Khoa học. Monit. 23, 2625–2635.
Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014). Sự điều hòa của các tiểu đơn vị immunoproteasome trong viêm cơ cho thấy tình trạng viêm đang hoạt động với sự tham gia của các tế bào trình diện kháng nguyên, tế bào T CD8 và IFNGamma. PLoS One 9, e104048.
Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J., và Schreiber, RD (1995). Việc tuyển dụng chỉ số bằng các thụ thể cytokine tyrosine-phosphoryl hóa: một quá trình điều khiển ái lực thuận nghịch có trật tự. Miễn dịch 2, 677–687.
Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. và Pendergast, AM (2013). Vai trò của kinase họ ABL trong bệnh ung thư: từ bệnh bạch cầu đến khối u rắn. Nat. Mục sư Ung thư 13, 559–571.
Gu, JJ, Ryu, JR và Pendergast, AM (2009). Abl tyrosine kinase trong tín hiệu tế bào T. Miễn dịch. Rev. 228, 170–183.
Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. và Deisseroth, AB (1997). Vai trò tiềm năng của bcr-abl trong việc kích hoạt JAK1 kinase. Phòng khám. Ung thư Res. 3, 145–149.
Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Lợi ích và rủi ro lâu dài của nilotinib hàng đầu so với imatinib đối với bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính ở giai đoạn mãn tính: cập nhật 5-năm của thử nghiệm ENESTnd ngẫu nhiên. Bệnh bạch cầu 30, 1044–1054.
Kang, YH, Biswas, A., Field, M. và Snapper, SB (2019). Tín hiệu STAT1 bảo vệ tế bào T khỏi độc tế bào qua trung gian tế bào NK. Nat. Cộng đồng. 10, 912.
Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ, và Schreiber, RD (1998). Trình diễn hệ thống giám sát khối u phụ thuộc gamma interferon ở chuột có hệ miễn dịch bình thường. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 95, 7556–7561.
Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA và Baltimore, D. (1998). Vai trò thiết yếu của Abl và Arg tyrosine kinase trong quá trình thần kinh. Tế bào thần kinh 21, 1259–1272.
Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE và Stark, GR (1996). Vai trò của JAK trong việc kích hoạt STAT và kích thích biểu hiện gen c-fos bằng yếu tố tăng trưởng biểu bì. Mol. Tế bào sinh học. 16, 369–375.
