Tác dụng điều trị của Cistanoside A đối với quá trình chuyển hóa xương của chuột bị cắt bỏ buồng trứng

1. Giới thiệu

Loãng xương, một “kẻ giết người thầm lặng” trong hệ thống xương, đã trở thành mối nguy hiểm lớn đối với sức khỏe của hơn 2000 triệu người trên toàn thế giới trong những năm gần đây.. Nó được đặc trưng bởi mật độ khối xương (BMD) thấp và sự suy giảm cấu trúc vi mô, xuất phát từ sự tiêu xương quá mức trong quá trình hình thành xương và cuối cùng dẫn đến gãy xương do loãng xương.. Ngày nay, việc xác định các tác nhân ngăn chặn sự biệt hóa và tái hấp thu hủy xương là chiến lược phổ biến và thành công để phát triển các loại thuốc điều trị bệnh loãng xương.và thực sự có nhiều chất tổng hợp, bao gồm estradiol valerate và alendronate natri, có thểngăn ngừa và điều trị loãng xương. Tuy nhiên, thuốc chữa bệnh còn lâu mới đạt mức lý tưởng; một số loại thuốc này có thể làm tăng nguy cơ ung thư nội mạc tử cung và ung thư vú và cũng có một số tác dụng phụ, chẳng hạn như tăng canxi máu, tăng canxi niệu, v.v., làm hạn chế ứng dụng lâm sàng của chúng. Do đó, trong hơn một thiên niên kỷ, các loại thuốc cổ truyền Trung Quốc (TCM), đặc biệt là TCM ăn được với các hợp chất và phân đoạn có hoạt tính sinh học biệt lập, đã được sử dụng rộng rãi một cách an toàn và hiệu quả ở các nước châu Á để ngăn ngừa và điều trị các bệnh khác nhau, bao gồm cả bệnh loãng xương.. 

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ ĐIỀU TRỊ VÀ NGĂN NGỪA BỆNH Loãng xương PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Loãng xương được đặc trưng là sự tăng cường khả năng tiêu xương do tăng sinh hủy cốt bào, và quá trình này liên quan đến sự gắn kết của các bạch cầu đơn nhân tạo máu vào các tiền chất hủy cốt bào, hợp nhất để hình thành các nguyên bào xương đa nhân nhắm vào các vị trí xương đang trong quá trình tái cấu trúc [4]. Chất kích hoạt thụ thể cho phối tử-κB hạt nhân (RANKL), một yếu tố chính được tiết ra từ các nguyên bào xương, kích thích sự biệt hóa tế bào đơn nhân thành các nguyên bào xương [8,9]. Sự tương tác của RANKL với RANK thụ thể của nó dẫn đến một loạt các sự kiện nội bào, bao gồm NF-κB, PI3K/Akt và kinase phụ thuộc canxi/calmodulin bằng cách tuyển dụng yếu tố liên quan đến thụ thể TNF protein tín hiệu (TRAF6). Kết quả là, một số gen đánh dấu liên quan đến hủy cốt bào, bao gồm TRAP, cathepsin K và DPD, được điều hòa lại và quá trình tiêu xương được đẩy nhanh.

Phenylethanoid glycoside được đặc trưng bởi các gốc axit cinnamic và hydroxyl phenyl ethyl được gắn với -glucopyranose (apiose, galactose, rhamnose, xyloza, v.v.) thông qua liên kết glycosid, được phân bố rộng rãi trong cây thuốc [10]. Cistanoside A (Cis A) là một hoạt chấtphenylethanoid glycosideở Cistanche Deserticola YC Ma. Theo ghi chép của dược điển Trung Quốc, C. Deserticola theo truyền thống được sử dụng để điều trị chứng thận âm, yếu cơ, suy nhược thắt lưng, v.v. và phenylethanoid glycoside là thành phần hoạt tính sinh học chính trong loại thảo mộc này [11]. Theo thuyết “thận” của TCM, thận có thể chi phối hệ thống xương, nghĩa là sự phát triển và chức năng của xương phụ thuộc vào tinh chất thận, và tinh chất thận này có thể chuyển hóa thành tủy xương để nuôi dưỡng xương, thúc đẩy sự tăng trưởng và sửa chữa bộ xương và củng cố bộ xương [12]. Vì C. Deserticola có thể tăng cường sức khỏe cho thận nên chúng tôi cho rằng Cis A có thể ngăn ngừa và điều trị bệnh loãng xương. Do đó, nghiên cứu này được thiết kế để xác nhận tiềm năng củaCis A trong việc ngăn ngừa loãng xươngbằng cách sử dụng mô hình chuột bị cắt bỏ buồng trứng và các dấu hiệu hình thành và tiêu xương, cũng như các cơ chế tiềm năng liên quan đã được xác định để ước tính hoạt tính sinh học chống loãng xương của tác nhân này.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Kết quả

2.1.1. Tác dụng của Cis A đối với thử nghiệm uốn ba điểm xương

Để phân tích xem liệu việc điều trị bằng Cis A có làm cho xương chắc khỏe hơn hay không, chúng tôi đã thực hiện bài kiểm tra uốn cong ba điểm cho xương đùi. Như được hiển thị trong Hình 1, tải trọng tối đa được áp dụng khi gãy xương là 21,5% và 22,0% cao hơn ở động vật được điều trị bằng 20 mg/kg và 80 mg/ kg Cis A, tương ứng, so với các động vật trong nhóm cắt bỏ buồng trứng (OVX) (p < 0.05). Trong khi đó, điều trị bằng Cis A còn làm tăng độ cứng của xương; tất cả chuột được điều trị bằng Cis A đều cho thấy độ cứng tăng lên đáng kể với dữ liệu lần lượt là 121.0 ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) và 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), khi so sánh với 102,2 ± 10,7 của chuột OVX. Kết quả chỉ ra rằng sức mạnh của xương tăng lên ở chuột OVX được điều trị bằng Cis A là do lượng xương tăng lên và chất lượng xương được cải thiện.

2.1.2. Tác dụng của Cis A đối với vi kiến ​​trúc xương

Vi cấu trúc xương bè ba chiều của chuột được đo bằng micro-CT (Hình 2 và Bảng 1) cho thấy một cách trực quan rằng những con chuột trong nhóm OVX có sự giảm đáng kể về diện tích bè và số lượng bè khi so sánh với nhóm giả, cho thấy rằng phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng có thể làm giảm đáng kể mật độ khối xương (BMD, −46%), hàm lượng khoáng xương (BMC, −66%), hàm lượng khoáng mô (TMC, −85%), tỷ lệ thể tích xương (BVF, −82%), số lượng phân tử (Tb. N, −76%) và sự gia tăng sự phân tách phân tử (Tb. Sp, +80%) mà không có bất kỳ sự thay đổi nào về tổng mật độ khoáng của mô (TMD) và độ dày phân tử (Tb. Th) sau hoạt động 12 tuần. Tuy nhiên, chuột OVX được điều trị bằng Cis A dẫn đến BMD tăng phụ thuộc vào liều (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), giảm Tb nhiều hơn. Sp (−79%~88%) và tăng cường thêm Tb. N (+73%~82%) so với nhóm OVX. TMD dường như không bị ảnh hưởng bởi phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng nhưng tăng lên đáng kể khi điều trị bằng estradiol valerate (EV).

2.1.3. Tác dụng của Cis A đối với cả dấu hiệu hình thành và tiêu xương

Tác dụng của Cis A đối với các dấu hiệu tiêu xương bao gồm TRAP, DPD, chỉ số hình thành xương cathepsin K ALP và Gla-protein xương (BGP) được thể hiện trên Hình 3. Sau 12 tuần phẫu thuật cắt buồng trứng, hoạt động của TRAP, DPD và cathepsin K ở nhóm OVX tăng rõ rệt, đặc biệt DPD tăng gần 55,6%; TRAP và cathepsin K được tăng cường lần lượt là 43,5% và 38,1% so với nhóm giả dược. Cis A, dùng bằng đường uống trong 12 tuần, đã chứng minh tiềm năng đáng chú ý trong việc ngăn chặn tất cả các dấu hiệu tiêu xương nêu trên, đặc biệt là liều cao (80 mg/kg) cho thấy tác dụng đáng kể trong việc ức chế hoạt động của DPD. lần lượt là 45.0%, TRAP là 49.0% và cathepsin K là 44.0% (p < 0.01), so với Nhóm OVX (Hình 3). Mặc dù xu hướng ngày càng tăng của các hoạt động ALP và BGP đã được thể hiện ở nhóm OVX, nhưng không có thay đổi có ý nghĩa thống kê nào được quan sát thấy. Tuy nhiên, sự cải thiện đáng kể về hoạt động ALP đã được quan sát thấy ở các nhóm được điều trị bằng Cis A thấp và cao so với nhóm giả dược (p < 0,01).

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ NGĂN NGỪA BỆNH Loãng xương75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Tác dụng của Cis A đối với mức độ biểu hiện protein của TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG và RANKL

Phân tích Western blot cho thấy rằng so với nhóm giả, mức protein TRAF6, NF-κB và RANKL trong nhóm OVX đã tăng đáng kể (p < 0.05), trong khi OPG, PI3K và Akt đã giảm đáng kể (Hình 4). Cis A (20 mg/kg hoặc 80 mg/kg) biểu hiện TRAF6 bị điều chỉnh giảm đáng kể (p < 0,05), sau đó biểu thức RANKL giảm và OPG tăng, nghĩa là tỷ lệ OPG/RANKL đã được điều chỉnh tăng. Do đó, các tầng tín hiệu của NF-κB bị điều hòa quá mức và PI3K/Akt được điều chỉnh tăng lên bằng cách xử lý Cis A (p < 0,05).

2.2. Cuộc thảo luận

Do những hạn chế của các lựa chọn điều trị hiện tại đối với bệnh loãng xương, cần có những lựa chọn thay thế từ thực phẩm hoặc cây thuốc ăn được tự nhiên. Là một phần trong nỗ lực không ngừng của chúng tôi nhằm khám phá các tác nhân chống loãng xương hiệu quả từ TCM, chúng tôi đã tìm thấy một loạt chiết xuất, phân đoạn và hợp chất có tác dụng chống loãng xương [13,14]. Cistanche Deserticola là một loại thuốc TCM cổ điển quan trọng, được phát hiện là có độ an toàn thuận lợi [15] và các chức năng y học rộng rãi để điều trị bệnh thiếu thận, v.v. [16]. Theo lý luận của TCM, TCM có tác dụng bổ thận tráng dương thường đượcđược sử dụng để điều trị chứng loãng xương; phenylethanoid glycoside là thành phần có hoạt tính sinh học chính trong loại thảo dược này, do đó ngụ ý rằngglycoside phenylethanoidchứa trong C. Deserticola có thể có đặc tính chống loãng xương. Người ta đã chứng minh rằng chiết xuất C. Deserticola có thể ức chế đáng kể việc giảm BMD và ngăn ngừa sự suy giảm vi cấu trúc phân tử do OVX gây ra [17]. Trong thí nghiệm in vitro, nó cũng làm tăng đáng kể ALP, protein hình thái xương-2 và mRNA của xương, cũng như quá trình khoáng hóa xương của các nguyên bào xương được nuôi cấy [18]. Echinacoside, thành phần hoạt tính sinh học chính trong C. Deserticola được ghi nhận chính thức trong dược điển Trung Quốc [11], thể hiện hoạt tính chống loãng xương với liều lượng cao 30~270 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày [19], và các kết quả in vitro tiếp theo cho thấy rằng nó có thể thúc đẩy quá trình tái tạo xương bằng cách tăng khẩu phần OPG/RANKL trong MC3T3-E1 Subclone 14 tế bào [20]. Cis A là một trong những glycoside phenylanol được phân lập từ C. Deserticola, và một số báo cáo tiết lộ rằng hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa [21] và đặc tính chống viêm [22,23]. Một bài báo được xuất bản gần đây đã phát hiện ra rằng Cis A thể hiện các hoạt động bảo vệ đối với cả CCl4 và nhiễm độc gan do rượu gây ra ở chuột, đồng thời nó cũng cho thấy đặc tính bảo vệ đối với tổn thương do ethanol gây ra ở tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp trong ống nghiệm [24]. Trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi, kết quả cho thấy Cis A có hoạt tính chống loãng xương ở liều thấp (20 ~ 80 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày) bằng cách sử dụng mô hình chuột bị cắt bỏ buồng trứng và hoạt tính sinh học này được thực hiện bằng cách điều chỉnh giảm mức TRAF6, ức chế sự biểu hiện của RANKL và NF-κB và kích thích OPG, PI3K và Akt, có nghĩa là tác dụng điều trị của Cis A ở chuột OVX là thông qua cơ chế bất hoạt NF-kappaB qua trung gian TRAF6- và kích hoạt PI3K/Akt.

Người ta biết rõ rằng phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng có thể gây ra bệnh loãng xương với sự giảm rõ rệt về BMD, sức mạnh cơ sinh học, chất lượng xương và vi cấu trúc xương xốp, và những thay đổi trên một phần là do thiếu hụt estrogen [25]. Bây giờ, trong thí nghiệm in vivo hiện tại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng chứng loãng xương do cắt bỏ buồng trứng dẫn đến giảm đáng kể sức mạnh cơ sinh học và các thông số cấu trúc phân tử, bao gồm BMD, BMC, TMC và Tb. N và tăng Tb. Sp; và điều trị bằng Cis A đã cải thiện đáng kể các đặc tính cơ học của xương bao gồm tải trọng và độ cứng tối đa, tăng cường BMD và cải thiện hầu hết các thông số cấu trúc vi cấu trúc phân tử xương so với chuột trong nhóm OVX, cho thấy Cis A có hiệu quả trong việc cải thiện chất lượng xương. và vi kiến ​​trúc phân tử ở chuột OVX.

Bên cạnh BMD tổng, thử nghiệm uốn cong ba điểm và đo vi cấu trúc xương phân tử có thể chẩn đoán trực tiếp chứng loãng xương, các dấu hiệu hình thành xương, bao gồm ALP và BGP, và chỉ số hủy xương, bao gồm TRAP, DPD và cathepsin K, cũng được sử dụng để làm sáng tỏ các cơ chế chống loãng xương liên quan của Cis A. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hoạt động ALP ở chuột nhóm OVX cho thấy xu hướng tăng không đáng kể, điều này cho thấy tốc độ luân chuyển xương tăng lên [26,27] trong bệnh loãng xương sau mãn kinh; liều cao (80 mg/kg thể trọng/ngày) và liều thấp (20 mg/kg thể trọng/ngày) của phương pháp điều trị Cis A cho thấy sự cải thiện đáng kể về hoạt động ALP so với nhóm giả, trong khi hoạt động BGP dường như không bị ảnh hưởng bởi cắt bỏ buồng trứng ở tất cả các nhóm được điều trị; TRAP, DPD và cathepsin K tăng đáng kể ở nhóm OVX và việc sử dụng Cis A làm giảm đáng kể cả ba dấu hiệu tiêu xương. Dữ liệu trên ngụ ý rằng Cis A có hoạt tính chống loãng xương tiềm tàng và tác dụng này được tạo ra nhờ sự điều hòa chuyển hóa xương, bao gồm cả việc ức chế quá trình tiêu xương và tăng cường hình thành xương.

Sự phối hợp giữa nguyên bào xương và nguyên bào xương là một yếu tố quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn của xương. Các tế bào hủy xương, biểu hiện TRAP, gắn vào bề mặt xương thông qua việc hình thành các vùng gắn kết với Actin, trong đó các enzyme phân giải protein, chẳng hạn như cathepsin K, được giải phóng, dẫn đến hình thành các hố tái hấp thu. Việc điều chỉnh quá trình tạo xương bằng các tế bào chưa trưởng thành của dòng nguyên bào xương được trung gian bởi RANKL và OPG [28]. OPG là một thụ thể mồi nhử có tác dụng ức chế sự kích hoạt RANKL của quá trình tạo xương, do đó làm giảm quá trình tiêu xương. RANKL, cung cấp tín hiệu quan trọng cho các tế bào tiền thân hủy cốt bào, là một phân tử gắn màng của họ phối tử yếu tố hoại tử khối u nhằm thúc đẩy sự hình thành các nguyên bào xương. Tỷ lệ biểu hiện OPG/RANKL được cho là thông số chính của hoạt động tạo xương và các tầng tín hiệu được kích hoạt bởi RANKL bao gồm các con đường NF-κB và PI3K [29]. Tầm quan trọng của con đường NF-κB đối với quá trình tạo xương được chứng minh bằng thực tế là việc loại bỏ NF-κB ở chuột dẫn đến sự vắng mặt của các tế bào hủy xương trưởng thành [30]. TRAF6 đã được chứng minh là mục tiêu đầy hứa hẹn cho các loại thuốc chống loãng xương mới. Những con chuột bị thiếu TRAF{11}}có biểu hiện khiếm khuyết trong quá trình tạo xương và chứng loãng xương nghiêm trọng, do đó đã chứng minh tầm quan trọng của TRAF6 trong quá trình chuyển hóa xương. Bằng chứng mới nổi chỉ ra chức năng điều tiết quan trọng đối với TRAF6 trong các tầng tín hiệu qua trung gian RANKL/RANK [4,31]. Dữ liệu của nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng việc điều trị bằng Cis A trên chuột OVX dẫn đến điều hòa giảm mức độ biểu hiện protein TRAF6, giảm RANKL và tăng biểu hiện OPG do đó ngăn chặn sự kích hoạt RANKL của NF-κB xuôi dòng và kích hoạt các đường dẫn tín hiệu PI3K/Akt, gợi ý rằng Cis A ức chế sự biệt hóa tế bào xương bằng cách bất hoạt NF-kappaB qua trung gian TRAF{20}}và kích hoạt PI3K/Akt, đồng thời tăng tỷ lệ OPG/RANKL, sau đó ức chế quá trình tạo xương và thúc đẩy quá trình hình thành xương.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN CHOHOẠT ĐỘNG CHỐNG SÓT NỀNPHGS75% ECH 30% HÀNH ĐỘNG 12%

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Nguyên liệu thực vật, chuẩn bị và xác định

Thân cây Cistanche DeserticolaYC Ma, được xác định bởi Giáo sư Xue-yan Fu thuộc Khoa Dược, Đại học Y Ninh Hạ, được thu thập vào ngày 2 tháng 9015 tại huyện Yongning, tỉnh Ninh Hạ, Trung Quốc. Một mẫu chứng từ (#20150901) đã được bảo quản trong phòng mẫu của khoa dược. Tổng cộng 30,0 kg thân cây C. Deserticola được sấy khô trong không khí được chiết hồi lưu bằng etanol 70% (180 L, 3 × 2 giờ) 3 lần. Dịch lọc được gộp lại và đưa vào cột nhựa xốp (AB-8) với hệ dung môi gradient từng bước tăng etanol trong nước (0%, 20% và 60%, mỗi loại 60 L) để thu được ba phần, sau đó 60% phần này được tinh chế thêm bằng Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Thụy Điển) và sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Đức) để thu được màu vàng nhạt cistanoside A 4,5 g (Cis A; hiệu suất là 0,015%). Cấu trúc được làm sáng tỏ chủ yếu bằng phân tích dữ liệu NMR (Bruker Avance, 400 MHz, Đức) và phổ MS (Agilent 6540, Agilent Technologies), phù hợp với dữ liệu được báo cáo [19]. Độ tinh khiết của nó được xác định bằng phương pháp chuẩn hóa vùng HPLC (Hình 5). Trong các thí nghiệm trên động vật, dựa trên thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi, liều Cis A là 20–80 mg/kg/ngày.

3.2. Hóa chất và dung môi

Những thứ sau đây đã được sử dụng: bộ chiết protein tổng số và bộ định lượng protein BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nam Kinh, Trung Quốc), kháng thể chính của TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -actin và tubulin ( Công nghệ tín hiệu tế bào, Beverly, MA, Hoa Kỳ), kháng thể thứ cấp của IgG kháng thỏ kết hợp với peroxidase của dê (ZSGB-BIO, Bắc Kinh, Trung Quốc), estradiol valerate (1 mg, Delpharm Lille SAS, Paris, Pháp), xương Gla -protein và deoxypyridinoline liên kết ngang bộ dụng cụ ELISA (Công ty TNHH Kỹ thuật sinh học Xinyu, Thượng Hải, Trung Quốc) và bộ ELISA cathepsin K (Biovision, Mountain View, CA, USA). Tất cả các hóa chất và tác nhân sinh hóa khác được sử dụng đều là thuốc thử cấp phân tích AR.

3.3. Thí nghiệm trên động vật

Sáu mươi con chuột cái dòng Côn Minh, 8 tuần tuổi với trọng lượng cơ thể 26.0 ± 1,62 g, được mua từ Đại học Y Ninh Hạ và 10 con chuột được nhốt trong một lồng với chế độ ăn tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm và nước máy trong điều kiện được kiểm soát không khí (24.0 ± 0,5 ◦C, độ ẩm 45%–50% và chu kỳ chiếu sáng sáng-tối 12 giờ/12 giờ). Sau khi được làm quen với khí hậu trong 1 tuần, phẫu thuật được thực hiện trong điều kiện vô trùng và tất cả chuột đều được gây mê bằng chloral hydrat (100 mg/kg, ip); những con chuột được phẫu thuật mà không cắt bỏ buồng trứng là nhóm giả (n=10); những người khác được phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng hai bên là nhóm OVX (n=50). Các thí nghiệm trên động vật trên được thực hiện theo hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm và đã được Ủy ban Đạo đức Sinh học của Đại học Y Ninh Hạ phê duyệt.

Sau khoảng thời gian phục hồi {0}}tuần nữa, 50 con chuột OVX ở trên được chia ngẫu nhiên và bằng nhau thành 5 nhóm: được điều trị bằng đường uống bằng estradiol valerate (1 mg/kg/ngày) làm đối chứng dương tính (EV); với 20, 40 và 80 mg/kg/ngày Cis A lần lượt là các nhóm liều thấp, trung bình và cao; với phương tiện (0,5% Carboxymethylcellulose()-Na) làm nhóm mô hình (OVX). Tất cả chuột được cho dùng đường uống với thể tích bằng nhau là 1 mL/100 g trọng lượng cơ thể, EV hoặc Cis A, bắt đầu vào tuần thứ hai sau phẫu thuật và kéo dài trong 12 tuần. Trọng lượng cơ thể được đo hai tuần một lần và điều chỉnh liều lượng cho phù hợp. Sau lần uống cuối cùng, các mẫu máu được rút ra khỏi động mạch đùi của chuột bị gây mê, để đông máu và ly tâm ở tốc độ 3000 × g trong 10 phút để thu được huyết thanh; xương đùi và xương chày bên phải bị mổ xẻ. Tất cả các mẫu được bảo quản ở −80 ◦C để đánh giá thêm về vi cấu trúc xương và các thông số sinh hóa huyết thanh liên quan đến loãng xương.

3.4. Kiểm tra uốn ba điểm

Đặc tính cơ sinh học của xương đùi phải của chuột được xác định bằng cách sử dụng cách sắp xếp uốn ba điểm. Đồ gá uốn có giá đỡ hình chữ V để cố định đầu xa và đầu gần của xương đùi trong quá trình thử nghiệm. Xương đùi được đặt nằm ngang với mặt trước hướng lên trên và tải trọng được tác động xuống phía dưới ở giữa xương đùi. Khoảng cách giữa các giá đỡ là 8 mm. Xương được tải ở tốc độ dịch chuyển không đổi 0,02 mm/s cho đến khi hỏng khi sử dụng Máy kiểm tra BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, USA). Các đường cong tải trọng-chuyển vị được thu thập và sử dụng để tính toán các đặc tính kết cấu và vật liệu, bao gồm tải trọng tối đa, tải trọng đỉnh, mô đun đàn hồi, cường độ uốn, v.v.

3.5. Phân tích chụp cắt lớp vi tính

Xương đùi bên phải của tất cả những con chuột đã được làm sạch các mô mềm bám dính và cấu trúc vi mô xương trabecular của siêu hình xương đùi ở xa bên phải ở trên được xác định bằng máy quét micro-CT (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, Canada) với độ phân giải đẳng hướng được đặt thành 8 µm ở cả ba chiều không gian. Vùng quan tâm (ROI) đã được chọn bằng cách sử dụng cùng tọa độ trong tấm tăng trưởng của xương đùi. Các thông số hình thái xương, bao gồm BMD, hàm lượng khoáng xương (BMC), hàm lượng khoáng mô (TMC), mật độ khoáng mô (TMD), tỷ lệ thể tích xương (BVF), phân tách phân tử (Tb. Sp), số lượng phân tử (Tb. N). ) và độ dày phân tử (Tb. Th), được đánh giá thông qua phân tích ROI bằng phần mềm phân tích xương ABA.

3.6. Phân tích các thông số sinh hóa

Hoạt tính của phosphatase kiềm trong huyết thanh (ALP) được đo trên máy phân tích tự động (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); nồng độ DPD, BGP và cathepsin K trong huyết thanh được xác định bằng bộ thuốc thử tương ứng và phosphatase kháng axit tartrate (TRAP) được phân tích theo tài liệu liên quan [32].

3.7. Phân tích Western Blot

Mức độ biểu hiện protein của TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG và RANKL trong các nhóm khác nhau được phát hiện bằng phân tích Western blot. Tóm lại, protein được chiết xuất từ ​​xương chày bên phải của chuột bằng cách sử dụng dung dịch đệm ly giải có chứa 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, chất ức chế protease và phosphatase. Lysate được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 12,000× g để thu được chất nổi phía trên để phân tích thêm. Nồng độ protein của lysate được đo bằng xét nghiệm định lượng axit bicinchoninic. Các protein (50–100 µg) được phân tách bằng 10% SDS-PAGE, chuyển sang màng polyvinylidene Difluoride và được ủ với các kháng thể chính đơn dòng nhắm mục tiêu TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG và -actin (1:500). Màng tương tự đã được tách ra và lọc lại, với các tín hiệu phát quang hóa học được phần mềm Image Lab phát hiện. -actin hoặc tubulin dùng làm chất kiểm soát nội bộ.

3.8. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu thu được từ các thí nghiệm trên động vật được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều với thử nghiệm của Dennett bằng SPSS (Phiên bản 22.0, Số liệu thống kê SPSS của IBM, IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA ) phần mềm; giá trị p < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê và tất cả các kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

4.Kết luận

Tóm lại, Cis A,hoạt chất phenylethanoid glycosideđược phân lập từ C. Deserticola, thể hiện hoạt tính chống loãng xương đáng kể trên chuột OVX và cơ chế phân tử có thể liên quan đến sự bất hoạt NF-kappaB qua trung gian TRAF6- và hoạt hóa PI3K/Akt, do đó có thể là một tác nhân đầy hứa hẹn để điều trị bệnh loãng xương bệnh.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN CHOHOẠT ĐỘNG CHỐNG SÓT NỀNPHGS75% ECH 30% HÀNH ĐỘNG 12%