Nghiên cứu độc tính về sự an toàn của chiết xuất Cistanche Deserticola

Tóm tắt:

Mục tiêu Đánh giá độc tính chung vàđộc tính di truyền của Cistanche Deserticola chiết xuấtvà cung cấp cơ sở chophát triển thêm các nghiên cứu chức năng. Phương pháp Anxét nghiệm độc tính cấp tính qua đường miệngvà một liều lặp lạiĐộc tính qua đường miệng 90-ngàythử nghiệm trên chuột được thực hiện để quan sát độc tính chung củaChiết xuất Cistanche Deserticola. Ba xét nghiệm gây đột biến bao gồm xét nghiệm đột biến ngược vi khuẩn (xét nghiệm Ames), hồng cầu đa sắc ở tủy xương chuột và xét nghiệm quang sai nhiễm sắc thể ở động vật có vú trong ống nghiệm đã được thực hiện để đánh giá độc tính di truyền của chiết xuất Cistanche Deserticola. Tất cả các phương pháp thử nghiệm đều được thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phép thử χ{0}} hoặc phân tích phương sai. Mức độ kiểm tra là 0,05.

Kết quảliều gây chết trung bình cấp tính qua đường miệng(LD50 ) củaChiết xuất Cistanche Deserticolaở cả chuột cái và chuột đực đều trên 10g/kg. Kết quả của thử nghiệm Ames cho thấy chiết xuất Cistanche Deserticola không gây ra bất kỳ sự gia tăng nào của các khuẩn lạc đột biến ngược ở tất cả các chủng được thử nghiệm và có kết quả âm tính. Kết quả đo hồng cầu đa sắc tủy xương chuột cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ( χ2=3. 036, 1.755, tất cả P ​​> 0.05) tỷ lệ nhân vô vi ở chuột cái và chuột đực giữa các nhóm liều và dung môi. nhóm chứng và có kết quả âm tính. Kết quả xét nghiệm quang sai nhiễm sắc thể động vật có vú in vitro cho thấy dù có hoặc không có hệ thống kích hoạt trao đổi chất đều có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (χ2=13. 244,9.955, tất cả P<0. 05) in chromosome aberration rate of Chinese hamster lung (CHL) cell between the positive control groups and the solvent control groups, and there were no statistically significant differences (χ 2 = 0. 436,1. 008, all P>0. 05) về tỷ lệ tế bào sai lệch nhiễm sắc thể giữa các nhóm liều chiết xuất Cistanche Deserticola và nhóm kiểm soát dung môi, và đã có kết quả âm tính. Trong thời gian thử nghiệm độc tính qua đường uống với liều lặp lại 90-ngày ở chuột, các hoạt động, mức tiêu thụ thức ăn và nước uống của động vật đều bình thường. Không quan sát thấy sự thay đổi hành vi rõ ràng và biểu hiện ngộ độc và không quan sát thấy trường hợp tử vong. So với nhóm đối chứng, không có sự bất thường rõ ràng nào về khối lượng cơ thể, lượng thức ăn tiêu thụ, các chỉ số huyết học và sinh hóa, trọng lượng cơ quan và trọng lượng cơ quan tương đối của chuột trong mỗi nhóm liều. Không có thay đổi bất thường về bệnh lý rõ ràng được tìm thấy trong xét nghiệm mô bệnh học. Kết luận Trong các điều kiện thí nghiệm hiện tại, chiết xuất Cistanche Deserticola không có độc tính chung và độc tính di truyền, và các nghiên cứu chức năng sâu hơn có thể được thực hiện.

Từ khóa:Đánh giá an toàn;Chiết xuất Cistanche Deserticola; Độc tính cấp tính; Độc tính di truyền; Độc tính chung

NGUYÊN LIỆU CISTANCHE TỰ NHIÊN ĐỂ BÁN

Chất phytochemical là một loại chất hoạt tính sinh học có trọng lượng phân tử thấp có chứa nhiều chức năng sức khỏe khác nhau bên cạnh các chất dinh dưỡng thiết yếu trong thực vật [1]. Trong những năm gần đây, với sự phát triển không ngừng của khoa học dinh dưỡng, những tác dụng có lợi của nhiều loại hóa chất thực vật đối với cơ thể con người như chống mệt mỏi, hạ lipid máu và tăng cường khả năng miễn dịch đã liên tục được phát hiện. Cistanche Deserticola hay còn gọi là thổ linh, cistanche và ngày, thường được gọi là “nhân sâm sa mạc” [2]. Ở nước tôi có 6 loài và 1 biến thể là Cistanche Deserticola, Cistanche alsa, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche lanzhouensis, Cistanche ambigua và biến thể Cistanche salsavar [3]. Cistanche Deserticola chủ yếu mọc ở vùng đất nhiễm mặn, đất cát và môi trường sa mạc. Ở nước tôi, nó chủ yếu phân bố ở Khu tự trị Nội Mông, tỉnh Cam Túc và tỉnh Thiểm Tây. Chiết xuất của nó có lợi cho sức khỏe như giữ ẩm cho ruột, tăng cường khả năng miễn dịch tế bào và bảo vệ gan [4-7]. Hiện nay, có rất ít nghiên cứu về độc tính trên động vật đối với chiết xuất Cistanche Deserticola. Nghiên cứu này đánh giá một cách có hệ thống độc tính cấp tính, độc tính chung và độc tính di truyền để đánh giá tính an toàn của nó và đặt nền tảng cho nghiên cứu chuyên sâu hơn trong tương lai.

1 Vật liệu và phương pháp

1. 1 Chất liệu

1. 1. 1 Chất thử

Chiết xuất Cistanche Deserticola là dạng bột rắn, được sản xuất và cung cấp bởi Công ty TNHH Công nghiệp Công nghệ cao Nội Mông Yuhangren, số lô: 211101. Mức tiêu thụ khuyến nghị của con người là 0,72g/ngày, được chuyển đổi thành mức tiêu thụ khuyến nghị hàng ngày là 12mg/kg·bw.

1. 1. 2 Động vật thí nghiệm

Những con chuột loại Sprague-Dawley (SD) khỏe mạnh dành riêng cho người trưởng thành không có mầm bệnh (SPF) được mua từ Hunan Slake Jingda Experimental Animal Co., Ltd., với số giấy phép sản xuất động vật là SCXK (Xiang) 2019-0014. Chúng được giữ trong phòng động vật có rào chắn của Viện Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh nghề nghiệp Hồ Nam, với nhiệt độ 21 ~ 24 độ và độ ẩm 45% ~ 68%. Số giấy phép sử dụng động vật thử nghiệm là SYXK (Xiang) 2017-0001.

1. 1. 3 Vi khuẩn

Salmonella typhimurium thiếu histidine. Các chủng TA97, TA98, TA100 và TA102 đều do MOLTOX, Hoa Kỳ cung cấp và được phòng thí nghiệm của chúng tôi xác định là đáp ứng yêu cầu.

1. 1. Dòng tế bào phổi chuột đồng Trung Quốc (CHL) 4 Cells được mua từ Ngân hàng Tế bào của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc (Thượng Hải, Trung Quốc).

1. 2 phương pháp

1. 2.1 Xét nghiệm độc tính cấp tính qua đường miệng

Thử nghiệm này đã áp dụng phương pháp giới hạn. 20 con chuột SD có trọng lượng cơ thể là 185,80 ~ 220. 00g được chọn, nửa cái và nửa đực và nhịn ăn trong 16 giờ. Lập nhóm liều 10.00g/kg·bw, lấy 50,04g mẫu thử và thêm nước tinh khiết đến 75.00 ml để chuẩn bị dung dịch thử có nồng độ 666,70 mg/ml. Dung dịch thử nghiệm được dùng bằng đường uống với liều 15.00ml/kg·bw. Thời gian quan sát là 14 ngày, các triệu chứng ngộ độc và cái chết của động vật được ghi lại hàng ngày. Các con vật được cân khi bắt đầu thí nghiệm, vào ngày thứ 7 sau khi dùng thuốc và khi kết thúc thí nghiệm. Sau thời gian quan sát, chuột bị giết bằng cách gây mê bằng CO2 và quá trình kiểm tra giải phẫu tổng thể của động vật đã được hoàn thành.

1.2.2 Phép thử Ames

Thiết lập 5 liều 50, 158, 500, 1580 và 5000ug/đĩa, đồng thời thiết lập nhóm kiểm soát đột biến dương và nhóm kiểm soát dung môi. Các chất dương tính là natri azide, 2-aminofluorene, 1, 8-dihydroxyanthraquinone và dichlorothiazide và dung môi là nước tinh khiết. Ba đĩa song song được thiết lập cho từng nhóm liều trong thử nghiệm này. Thử nghiệm được thực hiện trong hai hệ thống có S9 (men microsome gan) và không có S9, đồng thời các tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm nhiệt độ không đổi 37 độ trong 48 giờ sau khi dùng.

1.2.3 Xét nghiệm vi nhân hồng cầu đa sắc tủy xương chuột

Chuột Côn Minh, 25 con cái và 25 con đực, có trọng lượng cơ thể từ 29,3~35.0g. Thử nghiệm thiết lập ba nhóm liều 2,5, 5.0 và 10.0g/kg·bw, nhóm kiểm soát dương tính và nhóm kiểm soát dung môi. Chất dương tính là cyclophosphamide (CP; nhà sản xuất: Baxter; số lô: OH397A), liều lượng là 40 mg/kg·bw. Nhóm đối chứng dung môi và nhóm liều lượng được truyền 40 ml/kg·bw, và nhóm đối chứng dương tính được truyền 20 ml/kg·bw. Phương pháp dùng thuốc là dùng thuốc hai lần trong vòng 30 giờ và lần dùng thuốc cuối cùng được thực hiện 24 giờ sau lần dùng thuốc đầu tiên. Các con vật bị giết 6 giờ sau khi kết thúc truyền thuốc, tủy xương ức được lấy để chuẩn bị và số lượng tế bào chứa vi nhân được đếm dưới kính hiển vi (nhà sản xuất: Olympus, model: CX23).

1.2.4 Thử nghiệm quang sai nhiễm sắc thể tế bào động vật có vú trong ống nghiệm

Thử nghiệm thiết lập một nhóm kiểm soát dung môi (nước tinh khiết), các nhóm liều 250, 500 và 1000ug/ml và một nhóm kiểm soát dương tính. Kiểm soát dương tính là 20ug/ml methyl metansulfonate (MMS) (nhà sản xuất: Thuốc thử Tây Á, số lô: 20200109) (không có hệ thống kích hoạt trao đổi chất) và cyclophosphamide 10ug/ml (nhà sản xuất: Baxter, số lô:

OH397A) (có hệ thống kích hoạt trao đổi chất). Sau khi xác nhận tế bào không bị nhiễm bẩn, điều chỉnh nồng độ tế bào lên 5 × 10

5/ml, thêm 2,00ml huyền phù tế bào vào mỗi chai, sau đó thêm 3,00ml môi trường đại bàng cải tiến (DMED) của Dulbecco (nhà sản xuất: Chiết Giang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd. , số lô: 221125{11}}1) và cho vào tủ ấm khoảng 24 giờ. Sau khi hút hết môi trường nuôi cấy trong chai, thêm 4,95ml môi trường hoàn chỉnh DMEM (không có hệ thống kích hoạt trao đổi chất) hoặc 4,45ml môi trường hoàn chỉnh DMEM và 0,50ml dung dịch hỗn hợp S9 (có hệ thống kích hoạt trao đổi chất) vào mỗi chai, cuối cùng là thêm 50ul mẫu thử hoặc mẫu đối chứng đã chuẩn bị và đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm (nhà sản xuất: Shanghai Lishen Scientific Instrument Co., Ltd., model: HF160W) trong 4 giờ tiếp xúc với chất độc. Sau khi nhiễm trùng, loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào ba lần bằng dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS) (nhà sản xuất: Chiết Giang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd., số lô: 2109220213), sau đó thêm 5.{{19} }ml Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh DMEM cho vào mỗi chai, nuôi cấy trong 24 giờ và thu hoạch tế bào.

4 giờ trước khi thu hoạch, thêm 50 ul colchicine 100 mg/ml vào mỗi chai, ủ trong 4 giờ, tiêu hóa bằng dung dịch trypsin 0,25% (nhà sản xuất: Chiết Giang Jinuo Biopharmaceutical Technology Co., Ltd., số lô: 22071201), ly tâm và thu hoạch tế bào, chuẩn bị các tiêu bản theo phương pháp thông thường, chuẩn bị một tiêu bản cho mỗi chai và nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 10% [nhà sản xuất: China Pharmaceutical (Group) Shanghai Chemical Reagent Company, số lô: 20220114].

Dưới một thấu kính ngâm trong dầu (nhà sản xuất: Olympus, model: CX23), 100 siêu hình được phân tích trong mỗi nhóm, số lượng tế bào quang sai, loại quang sai và tọa độ của trường thị giác quang sai được quan sát và ghi lại, đồng thời tốc độ quang sai của nhiễm sắc thể là tính toán.

1.2.5 90-kiểm tra độc tính qua đường miệng trong ngày ở chuột

120 chuột SD, 4 tuần tuổi, nửa cái và nửa đực, có trọng lượng cơ thể là 75.5-97.0 g khi bắt đầu thử nghiệm đối với chuột cái và 80.{{6} },8 g đối với chuột đực. Thí nghiệm thiết lập ba nhóm liều 600, 1.200 và 3.600 mg/(kg·bw·d) và một nhóm đối chứng dương, với 10 động vật đực và cái trong mỗi nhóm. Ngoài ra, còn có nhóm vệ tinh kiểm soát trung hạn, nhóm vệ tinh kiểm soát giai đoạn phục hồi, nhóm vệ tinh liều cao trung hạn và nhóm vệ tinh liều cao giai đoạn phục hồi, mỗi nhóm có 5 con chuột cái và chuột đực. Liều lượng của các nhóm liều thấp, trung bình và cao tương ứng tương ứng là 50, 100 và 300 lần mức tiêu thụ được khuyến nghị cho con người. Dung dịch thử được chuẩn bị mới mỗi ngày và thể tích ống dẫn là 10ml/(kg·bw·d). Các con vật được quan sát hàng ngày trong suốt quá trình thí nghiệm và tình trạng chung của chúng được ghi lại. Vào cuối thí nghiệm, máu được thu thập sau khi nhịn ăn trong 16 giờ, và đo định kỳ máu và sinh hóa máu, đồng thời quan sát các tổn thương tổng thể và kiểm tra mô bệnh học.

1.3 Phân tích thống kê

Phần mềm thống kê IBM SPSS Stats 20.0 đã được sử dụng để phân tích dữ liệu. Xét nghiệm vi nhân hồng cầu ở động vật có vú được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phân tích phương sai và phân bố Poisson. Thử nghiệm quang sai nhiễm sắc thể tế bào động vật có vú trong ống nghiệm được phân tích thống kê bằng thử nghiệm χ2. Thử nghiệm độc tính qua đường miệng trong 90-ngày được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều và (hoặc) thử nghiệm t. P<0.05 was considered statistically significant, and the test level was α = 0.05.