Tăng Cường Protein Từ Trên Xuống Của Mô Não Với FAIMS Phần 3

Một quan sát ngay lập tức và rõ ràng là phần trăm độ phong phú càng cao thì xác suất xác định được TDP càng cao. Nói cách khác, TDP chủ yếu xác định các protein có hàm lượng rất phong phú.

Khi chúng ta già đi, nhiều người nhận thấy trí nhớ của họ đã giảm sút. Đây là một hiện tượng phổ biến, đặc biệt là sau khi chúng ta trải qua căng thẳng tinh thần kéo dài, thiếu ngủ và chế độ ăn uống không cân bằng.

Nhưng bạn có biết rằng một cách giúp chúng ta cải thiện trí nhớ là tăng cường hấp thụ lượng protein dồi dào? Protein có hàm lượng dồi dào rất giàu axit amin, có thể tổng hợp một phân tử gọi là chất dẫn truyền thần kinh trong não và cũng thúc đẩy sự phát triển và hoạt động của các tế bào thần kinh. Tế bào thần kinh là đơn vị cơ bản nhất trong não và là chìa khóa cho khả năng học tập và ghi nhớ của chúng ta. Do đó, lượng protein dồi dào có thể cải thiện trí nhớ của chúng ta bằng cách tăng cường chức năng của các tế bào thần kinh.

Nghiên cứu cũng đã chứng minh mối quan hệ giữa protein và trí nhớ. Ví dụ, một nghiên cứu cho thấy so với chế độ ăn giàu protein, chế độ ăn ít protein dẫn đến suy giảm chức năng não, bao gồm cả sự chú ý và trí nhớ.

Vì vậy, nếu muốn cải thiện trí nhớ, bạn cũng có thể bổ sung một số thực phẩm giàu protein vào chế độ ăn uống của mình, chẳng hạn như thịt gà, cá, thịt bò, trứng, đậu phụ, v.v. Tất nhiên, bạn cũng nên chú ý đến sự cân bằng. và sự đa dạng trong chế độ ăn uống của bạn, và bạn không thể chỉ ăn một loại thực phẩm.

Nói tóm lại, lượng protein dồi dào có thể giúp cải thiện trí nhớ của chúng ta. Nếu muốn có trí nhớ tốt hơn, bạn nên bắt đầu với chế độ ăn kiêng và cố gắng ăn càng nhiều thực phẩm giàu protein càng tốt! Điều này cho thấy chúng ta cần cải thiện trí nhớ và Cistanche có thể cải thiện đáng kể trí nhớ vì nó cũng có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng, rất quan trọng đối với trí nhớ và học tập. Ngoài ra, Cistanche còn có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy quá trình cung cấp oxy, điều này có thể đảm bảo não có đủ dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức bền của não.

Bấm vào biết thực phẩm bổ sung để tăng cường trí nhớ

Khoảng một nửa số gen được xác định từ bộ dữ liệu từ trên xuống (có hoặc không có FAIMS) được chứa trong 20% ​​số thùng phong phú hàng đầu để phân tích từ dưới lên (Hình 6A). Ngược lại, 71 gen chỉ có thể được tìm thấy trong bộ dữ liệu từ trên xuống (thùng "NA") (Hình 6A).

Những gen này dường như đại diện cho các protein tương đối ngắn (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Ví dụ: chỉ bao gồm trong ngăn từ trên xuống là các protein histone như H3C1, H4C1, H1–4 và H2BC12. Đúng như dự đoán, chúng tôi nhận thấy rằng FAIMS có thể cải thiện khả năng nhận dạng ở các phần trăm có nồng độ thấp hơn so với "Không FAIMS", tăng độ sâu của proteome có thể quan sát được.

Bằng cách xác định tỷ lệ FAIMS và "Không FAIMS" trên tất cả các phân vị, sự gia tăng đáng kể về số lần nhận dạng dưới phân vị thứ 40 là rõ ràng trong các CV trong phạm vi −40 đến−50 (Hình 6B).

Tuy nhiên, khi xem xét số lượng gen tuyệt đối, đóng góp chính cho lợi thế của FAIMS là thông qua việc mở rộng phổ nhận dạng trên tất cả các phân vị phong phú.

Mối quan hệ giữa CV FAIMS và việc truyền Proteoforms

Với FAIMS, chúng tôi cũng ghi nhận xu hướng giữa FAIMS CV và trọng lượng phân tử proteoform (Hình 7). Ở −50 CV, khối lượng proteoform trung bình là ∼ 5 kDa và tăng lên ∼ 15 kDa ở −20CV.

Dựa trên sự phân bố khối lượng này (Hình 7), CV nhỏ hơn −50 V có vẻ rất phù hợp cho các thí nghiệm protein từ trên xuống hoặc từ giữa xuống, trong khi CV lớn hơn −50 V có thể mang lại lợi ích tốt nhất cho các thí nghiệm peptidomic hoặc từ dưới lên.

Xu hướng trọng lượng phân tử quan sát được có lẽ vượt quá −20 CV; tuy nhiên, chúng tôi đã giới hạn tìm kiếm của mình ở −20 CV dựa trên sự sụt giảm về nhận dạng gen và dạng protein, dẫn đến mức độ bao phủ chuỗi inproteome trong mỗi lần chạy giảm dần.

Chúng ta nên lưu ý rằng nghiên cứu trước đây sử dụng FAIMS đã tìm thấy +40 CV làm điện áp lý tưởng để truyền chuỗi nặng NIST mAb (∼51kDa) và −20 CV là tốt nhất cho chuỗi nhẹ tương ứng (∼23 kDa), hỗ trợ cho ý tưởng này rằng xu hướng mà chúng tôi quan sát được mở rộng sang các CV FAIMS tích cực.45

Điều thú vị là, mặc dù nhiều quang phổ xác định một dạng protein đơn lẻ bị giới hạn ở phạm vi 10V (3599 trên 5165), nhưng có bảy dạng protein được quan sát trên toàn bộ phạm vi CV từ −50 đến −20. Có lẽ, điều này có thể là do chúng có hàm lượng cao trong mẫu, đặc biệt trong trường hợp ubiquitin (UBB), protein cơ bản myelin và protein gắn acylCoA.

Tuy nhiên, cũng có khả năng là các trạng thái điện tích khác nhau của các dạng protein này có một số dạng phù hợp pha khí tùy thuộc vào quá trình đồng phân hóa proton của chúng, ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng.42

Bảy dạng protein này cho phép chúng tôi nghiên cứu cách thức đường bao trạng thái điện tích được truyền khác nhau thông qua điều chế CV. Để làm đại diện cho việc phân phối trạng thái điện tích ở mỗi CV, chúng tôi đã sử dụng trạng thái điện tích trung bình dựa trên các kết quả phù hợp phổ dạng protein (PrSM) được xác định ở mỗi CV và theo dõi giá trị này thay đổi như thế nào dưới dạng hàm của CV bắt đầu từ −50 CV.

Quá trình quét MS1 trong Hình S3 cho thấy trạng thái điện tích PrSM trung bình theo dõi sự phân bố trạng thái điện tích của UBB như thế nào. Trong số bảy dạng protein này, bốn dạng có mối quan hệ nghịch đảo, với trạng thái điện tích quan sát được trung bình tăng lên khi CV giảm (Hình 8).

Điều đáng chú ý là xu hướng này thường được quan sát thấy với các peptide và protein nhỏ.56,62–64 Đáng ngạc nhiên là ba dạng protein cho thấy mối quan hệ trái ngược khi CV giảm làm giảm trạng thái điện tích trung bình quan sát được (Hình 8).

Việc kiểm tra con trỏ về khối lượng tiền chất trung bình giữa hai nhóm cho thấy rằng tiền chất lớn hơn có nhiều khả năng ưu tiên trạng thái điện tích cao hơn khi CV giảm.

Để xác thực các mối quan hệ này hơn nữa, chúng tôi đã mở rộng phân tích này để bao gồm các dạng protein được xác định trong phạm vi khiêm tốn hơn nhưng vẫn rộng, 20–30 CV (n=256 dạng protein). Ở đây, các dạng protein có điện tích trung bình dịch chuyển lớn hơn một điện tích trên toàn bộ phạm vi CV được chia thành hai nhóm khác nhau tùy thuộc vào hướng dịch chuyển đó.

Những thứ dịch chuyển ít hơn một điện tích được coi là "trung lập" liên quan đến việc thay đổi CV. Tương tự như các kết quả trước đó, tiền chất lớn hơn có nhiều khả năng liên quan đến mối quan hệ nghịch đảo giữa trạng thái điện tích quan sát được và CV (Bảng S2).

Khi CV giảm, phần lớn các dạng protein dường như truyền tải ở trạng thái điện tích thấp hơn (n=177) so với những trạng thái ưa thích trạng thái điện tích cao hơn (n=39). Còn lại (n=40) được coi là "trung lập" liên quan đến những thay đổi trong CV.

Proteoforms được gắn trong nhóm trung tính đã chứng minh khối lượng tiền chất trung bình giữa các nhóm nghịch đảo và trực tiếp, một lần nữa cho thấy rằng khối lượng của proteoform về bản chất có liên quan đến hành vi này.

Tuy nhiên, các tham số dựa trên trình tự chính khác như thành phần axit amin cơ bản/axit và chỉ số béo không có mối tương quan đáng kể (Bảng S2).

Mặc dù các protein được đưa vào pha khí có lẽ đã bị biến tính, nhưng các yếu tố thường liên quan đến protein tự nhiên như mômen lưỡng cực hoặc mặt cắt ngang va chạm có thể có giá trị dự đoán tốt hơn đối với hiện tượng này.64–66 Kết quả của chúng tôi cho thấy cách CV có thể được sử dụng để lọc các protein có loại khác nhau. khối lượng và cách vỏ trạng thái điện tích của protein cũng có thể được truyền đi một cách khác nhau thông qua FAIMS.

Công dụng của các mảnh Protein trong thí nghiệm TDP

Đáng ngạc nhiên là một số lượng đáng kể các dạng protein mà chúng tôi đã xác định được là những mảnh protein lớn hơn. Chúng tôi nhận thấy rằng chỉ có 25% dạng protein duy nhất được xác định bao phủ hơn một nửa trình tự protein mà chúng được tạo ra.

25% này có khối lượng trung bình là 11,4 kDa so với 75% còn lại có khối lượng trung bình là 5,7 kDa. Một số yếu tố có thể góp phần vào quan sát này, một số yếu tố độc lập với FAIMS.

Ví dụ, bản thân các mảnh này có thể là sản phẩm phân cắt protein được tạo ra trong điều kiện cân bằng nội môi không bình thường như là một phần của "sự thoái hóa" tế bào,67 hoặc bất chấp các biện pháp phòng ngừa khác nhau đã được áp dụng, được đưa ra trong khoảng thời gian sau khi giết mổ và xử lý mẫu.

Mô hệ thống thần kinh trung ương là một nguồn giàu peptide truyền tín hiệu được gọi là "peptide thần kinh" thường có nguồn gốc từ các protein tiền thân lớn hơn nhiều.68

Bằng cách tham chiếu chéo các thông tin nhận dạng dạng protein của chúng tôi với cơ sở dữ liệu về peptide thần kinh đã được thiết lập (NeuroPedia),69 chúng tôi có thể xác định được một số loại peptide thần kinh như vậy bao gồm vasostatin-1, secretoneurin, cholecystokinin-58 desnonopeptide, và peptide y thần kinh và nhiều biến thể trình tự không chính tắc có nguồn gốc từ các gen sản xuất peptide thần kinh đã biết.

Ngoài các yếu tố sinh học, một số thông số thiết bị nhất định cũng có thể ảnh hưởng đến việc quan sát các mảnh protein. Ví dụ, điện áp "phân mảnh" trong nguồn thấp (trong khoảng từ 10 đến 20 V) thường có thể được sử dụng để loại bỏ các chất cộng và khử các ion protein, trong khi điện áp cao hơn có thể sự phân ly do nguồn sản xuất gây ra.

Tuy nhiên, tính nhạy cảm của các liên kết amit với sự phân ly có thể rất khác nhau và khi kích thước của protein tăng lên thì khả năng nó chứa các liên kết amit không bền như Xaa-Pro.70–73 Vì các ion b- và y-có thể được tạo ra một cách vô tình thông qua điều này. cơ chế, ngay cả ở điện áp nguồn thấp, chúng tôi đã quyết định tránh sử dụng điện áp nguồn để giảm nguy cơ đưa các mảnh ion vào thiết bị.

Cũng có thể các protein dễ bị phân mảnh khi chúng đi qua điện trường được tạo ra trong FAIMS. Tuy nhiên, những mảnh này dự kiến ​​sẽ không có độ linh động giống như ion gốc, với lời cảnh báo rằng điều này có thể phụ thuộc vào kích thước của mảnh so với ion tiền thân.

Cuối cùng, cần chỉ ra một số yếu tố có thể thiên về việc quan sát các dạng protein nhỏ hơn (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Sự lan truyền tín hiệu này phần lớn có thể là do đường bao trạng thái điện tích và sự phân bố đồng vị của từng trạng thái điện tích. Cụ thể đối với thiết lập thử nghiệm của chúng tôi là việc sử dụng bộ lọc MWCO cỡ 3K làm bước lọc cuối cùng trong quá trình chuẩn bị mẫu của chúng tôi, trong trường hợp này được chọn để đảm bảo rằng các dạng protein beta amyloid nhỏ hơn có thể được thu giữ một cách hiệu quả nếu chúng có mặt.

Các yếu tố công cụ chung cũng có thể tạo ra sự thiên vị đối với các dạng protein nhỏ, bao gồm sự điều chỉnh của tứ cực, sự bắt giữ điện động lực và sự va chạm với các phân tử khí dư trong tế bào Orbitrap dẫn đến sự phân rã thoáng qua nhanh hơn đối với các phân tử lớn hơn.75 Bất kể những sai lệch này hay nguồn gốc chính xác của các mảnh vỡ, chúng vẫn có thể cung cấp những hiểu biết sâu sắc về hệ protein.

Những mảnh này đặc biệt hữu ích trong bối cảnh bệnh thoái hóa thần kinh trong đó sự gián đoạn trong quá trình cân bằng protein thường liên quan đến bệnh lý.76,77

Thật vậy, các mảnh tau thường được phát hiện là gây độc thần kinh và đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh tau như AD.23–26 Nói chung, các mảnh mà chúng tôi quan sát được lớn hơn nhiều so với các peptide tryptic, và trong một số trường hợp có nhiều mảnh dành cho một loại protein cụ thể , chúng tôi quan sát thấy phạm vi bảo hiểm đáng kể.

Điều này được minh họa bằng cách kiểm tra các đoạn cung cấp vùng bao phủ cho chuỗi B ∼50 kDa tubulinalpha-1(TUBA1B) và khớp thần kinh ∼70 kDa-1 (SYN1), như được hiển thị trong Hình 9A, B, cả hai đều lớn các protein khó có thể quan sát được ở dạng đầy đủ trong TDP của một mẫu phức tạp.

Xác định các Proteoforms có liên quan đến bệnh thoái hóa thần kinh

Việc sử dụng FAIMS với phân tích từ trên xuống của chúng tôi đã cho phép xác định một số biến thể mối nối Swiss-Prot và mục nhập TrEMBL duy nhất, với 267 biến thể mối nối duy nhất và 96 mục nhập TrEMBL (Bảng S3).

Đáng chú ý, chúng tôi quan sát thấy nhiều PrSM xác định rõ ràng một dạng đồng phân ORF thay thế (A{0}}A0D9SF30) cho phân tử bám dính tế bào thần kinh1 (NCAM1). Chúng tôi cũng quan sát thấy các dạng protein có nguồn gốc từ các gen có vai trò đã biết trong một số bệnh thoái hóa thần kinh, đặc biệt là -synuclein và PARK7.

Trong cả hai trường hợp này, dạng protein chiếm ưu thế đều chứa trình tự có độ dài đầy đủ. Điều thú vị là, phần lớn -synuclein, synuclein và (ở mức độ thấp hơn) -synuclein PrSM được phát hiện có chứa sự dịch chuyển khối lượng ∼ 177 Da gần đầu C (phổ -synuclein có độ dài đầy đủ với sự sửa đổi chưa xác định, như trong Hình S4A) .

Sự thay đổi khối lượng này đã được quan sát trước đây trong các tìm kiếm cơ sở dữ liệu mở và thường được tìm thấy ở Asp hoặc Gluresidues.78 Một lời giải thích tiềm năng gần giống với khối lượng trung bình và khối lượng đơn vị của sự biến đổi bao gồm một oxy với ba nguyên tử sắt cũng như sự mất đi bảy nguyên tử hydro ( dựa trên sự gia nhập Unimod #1971).

So sánh các đỉnh đồng vị của ion mảnh ay242+ từ -synuclein (Hình S4B) với phổ mô phỏng có chứa các nguyên tố nói trên được cho là thuộc về biến thể chưa biết (HìnhS4C) cho thấy sự giống nhau giữa hai phân bố đồng vị, với nhiều đỉnh đồng vị sắp xếp cách nhau trong khoảng 2 ppm.

Cũng cần chỉ ra rằng các đỉnh đồng vị ngoài cùng bên trái là duy nhất của các đồng vị sắt xuất hiện tự nhiên, và sự vắng mặt của các đỉnh này là rõ ràng khi quang phổ được mô phỏng mà không chứa ba nguyên tử sắt (Hình S4D), cho thấy mạnh mẽ rằng sự biến đổi chưa biết này rất có thể được cấu thành. của các yếu tố được đề xuất.

Các nghiên cứu trước đây cũng đã mô tả ái lực cao của -synuclein đối với các ion kim loại khác nhau và vùng mà chúng tôi quan sát thấy có sự biến đổi này trùng lặp với các gốc được biết là có liên quan đến liên kết―đặc biệt là mô típ 119DPDNEA124 (Hình S5).79–81

Dữ liệu của chúng tôi cũng gợi ý rằng các vùng đầu C của -synuclein và -synuclein có vai trò tương tự trong liên kết kim loại vì nhiều quang phổ có cùng sự dịch chuyển khối lượng chưa xác định được khớp với các chuỗi tương tự trong các protein này.

Về protein ty thể PARK7, chúng tôi đã ghi nhận sự thay đổi khối lượng ∼116.0 Da trên dư lượng Cys hoạt động duy nhất của nó, C106 (Hình S6). Một lời giải thích tiềm năng với quá trình succinyl hóa khối delta tương tự, một sự biến đổi được cho là do căng thẳng của ty thể và các dạng do Michael bổ sung fumarate vào nhóm Cys thiol.82

For more information:1950477648nn@gmail.com