Tế bào khối u không thể hiện diện các epitope bị hạn chế MHC-II có nguồn gốc từ gen gây ung thư đến tế bào T CD4+
Oct 09, 2023
Tế bào T CD4+ đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch chống ung thư thông qua việc nhận biết các kháng nguyên peptide có trên MHC lớp II (MHC-II). Mặc dù một số bệnh ung thư rắn có thể được tạo ra để biểu hiện MHC-II, nhưng mức độ mà điều này cho phép các tế bào T CD4+ đặc hiệu của khối u nhận biết trực tiếp vẫn chưa rõ ràng. Chúng tôi đã phân lập và mô tả các thụ thể kháng nguyên tế bào T (TCR) từ các tế bào T CD4+ có mồi tự nhiên đặc hiệu cho 2 oncoprotein, HPV-16 E6 và đột biến KRASG12V đang kích hoạt, từ các bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào vảy ở đầu và cổ và ung thư biểu mô tuyến ống tụy, tương ứng, và xác định khả năng nhận biết các tế bào khối u biểu hiện kháng nguyên phù hợp với kháng nguyên bạch cầu tự thân hoặc bạch cầu của người. Trong cả hai trường hợp, chúng tôi nhận thấy rằng TCR có khả năng nhận biết các tế bào đích được nạp peptide biểu hiện MHC-II hoặc tế bào trình diện kháng nguyên tế bào B (APC) có liên quan khi các kháng nguyên được biểu hiện nội sinh và hướng đến con đường nội sinh nhưng không thể nhận ra khối u. các tế bào biểu hiện protein nguồn ngay cả sau khi cảm ứng sự biểu hiện MHC-II bề mặt bởi IFN- hoặc tải nạp với CIITA. Những kết quả này cho thấy rằng việc nhận dạng mồi và chức năng của cả oncoprotein hạt nhân (E6) và oncoprotein liên quan đến màng (KRAS) chủ yếu được giới hạn ở các APC trình diện chéo thay vì thông qua nhận dạng trực tiếp các tế bào khối u được tạo ra để biểu hiện MHC-II.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
Giới thiệu
Sự biến đổi ác tính của các tế bào soma được bắt đầu bằng hoạt động của các gen gây ung thư được kích hoạt làm rối loạn quá trình phát triển của tế bào và dẫn đến sự tăng sinh không được kiểm soát (1). Trong trường hợp ung thư liên quan đến HPV, sự biểu hiện của gen giai đoạn sớm E6 và E7 của HPV góp phần gây ung thư bằng cách ức chế các gen ức chế khối u p53 và Rb tương ứng (2). Ngoài ra, sự kích hoạt gen gây ung thư có thể xảy ra thông qua đột biến soma ở các gen điều chỉnh quá trình phát triển và tăng sinh tế bào, chẳng hạn như họ RAS. Thật vậy, việc kích hoạt các đột biến KRAS như KRASG12V thường được tìm thấy ở những bệnh nhân ung thư tuyến tụy, ruột kết và phổi (3). Mặc dù các gen gây ung thư thúc đẩy bệnh tật nhưng chúng cũng có thể cung cấp các mục tiêu cho hệ thống miễn dịch của vật chủ. Trong những năm gần đây, vai trò của hệ thống miễn dịch trong việc kiểm soát các bệnh ung thư liên quan đến HPV đã được công nhận rộng rãi. Các tế bào T CD8+ và CD4+ nhận biết HPV E6 và E7, cũng như các protein HPV khác, đã được xác định trong cả máu ngoại vi và tế bào lympho thâm nhiễm khối u (TIL) từ các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến HPV. bệnh ung thư (4–6). Các liệu pháp miễn dịch nhắm vào các kháng nguyên này, bao gồm vắc xin điều trị ung thư và liệu pháp tế bào nuôi dưỡng (ACT) với TIL hoặc tế bào T được thiết kế bằng TCR, là một lĩnh vực tích cực của nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (2). Phản ứng của tế bào T chống lại các đột biến gây ung thư cũng đã được mô tả rộng rãi (7–9). Hơn nữa, có bằng chứng lâm sàng trực tiếp cho thấy ACT với TIL nhắm mục tiêu KRAS đột biến có thể thúc đẩy các phản ứng khách quan (10). Mặc dù tế bào T CD8+ nhận biết các epitop có nguồn gốc từ gen gây ung thư làm trung gian cho quá trình gây độc tế bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (11–13), vai trò của tế bào T CD4+ trong khả năng miễn dịch chống ung thư vẫn chưa được hiểu rõ. Các nghiên cứu gần đây đã nêu bật một tập hợp con tế bào T CD{27}} biểu hiện các dấu hiệu gây độc tế bào, chẳng hạn như granzyme B (GrzmB), trong bệnh ung thư ở người (14, 15). Tuy nhiên, đặc tính kháng nguyên của các tế bào này và do đó tiềm năng điều trị của chúng vẫn chưa được biết rõ. Hơn nữa, để các tế bào T CD{30}} gây độc tế bào này nhận biết và tiêu diệt các tế bào khối u, không chỉ tế bào khối u phải biểu hiện MHC-II mà các kháng nguyên liên quan cũng phải được dẫn đến con đường trình diện thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng của tế bào T CD4+ đặc hiệu với oncoprotein HPV-16 E6 và KRASG12V để nhận biết các tế bào khối u biểu hiện kháng nguyên. Mặc dù cả hai TCR đều có thể nhận biết trực tiếp các kháng nguyên được xử lý và trình diện nội sinh hướng đến khoang nội nhũ của các tế bào B phù hợp với HLA, nhưng cả hai TCR đều không có khả năng nhận biết các tế bào khối u biểu hiện kháng nguyên với biểu hiện cảm ứng của MHC-II. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng chỉ một số kháng nguyên nhất định được trình bày trực tiếp trên các tế bào khối u MHC-II+, điều này có thể hạn chế nhóm tế bào T CD4+ có khả năng nhận biết và loại bỏ trực tiếp các tế bào khối u.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kết quả
Xác định các phản ứng của tế bào T-16 E6-CD cụ thể4+ và CD8+ TIL từ TIL của ung thư biểu mô tế bào vảy ở đầu và cổ. Chúng tôi đã sàng lọc một loạt mẫu nuôi cấy TIL riêng lẻ được phân lập từ các mảnh khối u 2 đến 4 mm từ một bệnh nhân (Hu-56) bị ung thư biểu mô tế bào vảy ở đầu và cổ (HNSCC) (Bảng bổ sung 1; tài liệu bổ sung) có sẵn trực tuyến với bài viết này; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) bằng xét nghiệm IFN-ELISPOT để xác định các phản ứng của tế bào T chống lại các oncoprotein E6 và E7 của vi rút HPV-16, sử dụng nhóm peptide bao gồm các phần tử 15-chồng chéo kéo dài theo chiều dài của protein E6 và E7. Đáng chú ý, các đoạn TIL 12 và 29 đã tạo ra một số lượng đáng kể các điểm trên nền khi được mô phỏng lại bằng nhóm peptide E6 và chứa cả tế bào T CD4+ và CD8+ (Hình 1A và Hình 1A bổ sung). Để xác định các tập hợp tế bào T có liên quan, chúng tôi đã phân tích các mẫu nuôi cấy TIL này bằng cách sử dụng xét nghiệm bài tiết cytokine. Điều này cho thấy đoạn TIL 29 (F29) chứa các tế bào T E6-CD phản ứng8+, trong khi đoạn 12 (F12) chứa cả tế bào T CD4+ và CD8+ có khả năng nhận biết nhóm peptide E6 (Hình 1B). Không có tế bào T CD4+ nào tạo ra IL-5 để đáp ứng với quá trình mô phỏng lại E6, xác thực kiểu hình giống Th1-. Để xác định dòng vô tính TCR của các TIL cụ thể của E{41}}, chúng tôi đã sắp xếp các ô T CD{43}} IFN- tiết từ các ô F12 và CD8+ T từ F12 và F29. Trình tự TCR cho thấy một TCR duy nhất được biểu thị bằng IFN- – tiết CD4+ tế bào T (n=31 trong số 31 ô được sắp xếp theo trình tự), cũng như một bản sao TCR duy nhất được chia sẻ bởi IFN- – CD tiết{{53 }} Ô T từ cả F12 và F29 (n=40 của 41 và 37 trong số 38 ô được sắp xếp theo trình tự tương ứng) (Bảng bổ sung 2). Những kết quả này chỉ ra rằng các tế bào T CD{61}} và CD{62}} đơn dòng phản ứng với E6 hiện diện trong TIL của bệnh nhân này. HLA-A*02:01–các tế bào T8+ CD bị hạn chế từ TIL nhận ra E6 được trình diện bởi dòng tế bào khối u có nguồn gốc từ bệnh nhân. TIL từ F29 tạo ra IFN- khi được mô phỏng lại bằng peptide E629-38, cho thấy rằng F29 TCR đã nhận ra epitope bị hạn chế HLA-A*02:01 được mô tả trước đây (Hình bổ sung 1B) (11). Điều này đã được xác nhận bởi các nghiên cứu liên kết với tetramer bằng cách sử dụng E629-38/HLA-A*02:01 để dán nhãn các tế bào J76 thiếu TCR biểu hiện CD8 ở người và sử dụng TCR đặc hiệu E628-38–đặc hiệu được mô tả trước đây làm kết quả dương tính điều khiển (Hình 2A) (11). Cả hai TCR đều thể hiện mức độ ái lực chức năng tương tự nhau, như được chứng minh bằng sự điều chỉnh tăng của dấu hiệu kích hoạt cấp tính CD69 trên J76 sau khi kích thích bằng các dòng tế bào nguyên bào lympho B tự thân (B-LCL) được tạo xung với nồng độ peptide E629-38 đã được chuẩn độ (Hình 2, B và C). Những dữ liệu này xác nhận sự hiện diện của một bản sao tế bào T CD8+ đặc hiệu cho một epitop đã biết của E6 với các đặc điểm chức năng tương tự như một TCR đã được thử nghiệm trong môi trường lâm sàng (16). Tiếp theo, chúng tôi tìm cách xác định xem liệu TCR đặc hiệu của E6-CD{99}} có thể nhận ra các kháng nguyên được biểu hiện nội sinh và từ đó điều hòa hoạt tính gây độc tế bào chống khối u hay không. Để làm điều này, chúng tôi đã sử dụng dòng khối u HLA-A*02:01+ HPV{104}} có đặc tính rõ ràng, CaSki, cũng như dòng tế bào khối u tự thân, HNSCC-56, được tạo ra thông qua lập trình lại tế bào của mô khối u nguyên phát như đã mô tả trước đây (17) để xét nghiệm độc tế bào trong ống nghiệm. Phân tích RNA-Seq đã xác thực sự biểu hiện của các gen ban đầu của HPV{108}}, bao gồm cả E6, bằng cả mẫu khối u nguyên phát và dòng tế bào tự thân (Hình 1C bổ sung). Các tế bào T CD8+ sơ cấp ở người biểu hiện F29 TCR có thể làm trung gian tiêu diệt tế bào của cả CaSki và HNSCC-56 ở nhiều tỷ lệ tác nhân trên mục tiêu trong ống nghiệm (Hình 2, D và E). Cùng với nhau, những dữ liệu này xác nhận rằng F29 TCR nhận ra kháng nguyên E6 được biểu hiện nội sinh. Nhận dạng tế bào T{121}} E{120}CD cụ thể{121}} bị hạn chế HLA-DQ từ TIL. Để mở rộng các TIL cụ thể của E{122}} nhằm phân tích chức năng sâu hơn, chúng tôi đã sử dụng giao thức nuôi cấy mở rộng nhanh được mô tả trước đây với OKT-3 và chiếu xạ PBMC dị sinh để mở rộng các TIL từ F12. Mặc dù môi trường nuôi cấy F12 sơ cấp ban đầu chứa cả tế bào T CD8+ và CD4+ có khả năng phản ứng E6, nhưng sản phẩm tế bào cuối cùng sau khi mở rộng nhanh chóng chứa 99% tế bào T CD4+, trong đó có khoảng 38,33 % thể hiện khả năng phản ứng chống lại E6, như được chứng minh bằng nhuộm cytokine nội bào để tìm IFN- (Hình 3A).
Cây cistanche thảo mộc Trung Quốc-Chống ung thư
Ngoài IFN-, các TIL E{1}}CD cụ thể4+ được kích thích có thể tiết ra TNF- nhưng không tiết ra IL-2 (Hình bổ sung 2A). Mặc dù tổng tần số của các tế bào GrzmB+ không tăng khi kích thích kháng nguyên, nhưng việc xác định các tế bào tiết TNF- tiết lộ rằng các TIL E6-CD cụ thể4+ chứa nhiều GrzmB nội bào được lưu trữ hơn so với các TIL không đặc hiệu (Hình 2B bổ sung ). CD tiết ra IFN-{12}} TIL cũng thể hiện sự chết tế bào được lập trình bằng điểm đánh dấu đồng thời 1 (PD-1), phù hợp với các dấu hiệu đã được công bố của CD phản ứng với khối u4+ TIL (Hình 2C bổ sung) ( 18, 19). E{20}}CD cụ thể4+ TIL thể hiện ái lực chức năng cao vì những tế bào này có thể tiết ra cytokine ở nồng độ peptide dưới 1 ug/mL (Hình 3B). Để xác định tính đặc hiệu của môi trường nuôi cấy F12 TIL, chúng tôi đã tạo xung B-LCL tự thân với các peptide riêng lẻ tương ứng với từng peptide trong số 37 peptide có trong nhóm E6 ban đầu (Bảng bổ sung 3). CD4+ TIL từ F12 tiết ra IFN- khi được kích thích bằng peptide E61-15 và E65-19, có chung trình tự lõi 11–axit amin (Hình 2D bổ sung). Các thí nghiệm nuôi cấy kết hợp với sự hiện diện của Abs chặn HLA cho thấy TILs tiết ra IFN giảm đáng kể khi B-LCL bị chặn bằng abs kháng HLA-DQ nhưng không chặn abs kháng HLA-DR hoặc isotype (Hình 3C). Để xác định các alen HLA-DQ nào chịu trách nhiệm cho việc trình bày văn bia này, chúng tôi đã tạo xung B-LCL biểu thị các alen HLA-DQ đã biết (Bảng bổ sung 4) với E61-15 và nhận thấy rằng các tế bào KAS011 biểu hiện HLA-DQA1*01 :02 và DQB1*05:02, nhưng không phải Hu-195 B-LCL biểu hiện DQA1*05:05 và DQB1*03:01, có thể trình diện kháng nguyên cho TIL theo cách tương đương với Hu tự thân{63} } B-LCL (Hình 3D). Cuối cùng, chúng tôi đã tìm cách xác minh rằng trình tự TCR được xác định trước đó thực sự chịu trách nhiệm nhận dạng E6. Sự biểu hiện của F12 TCR trong các tế bào T CD{68}} của người hiến tặng khỏe mạnh ban đầu ở người là đủ để thúc đẩy sự nhận biết peptide E61-15, bằng chứng là sự điều hòa tăng của CD69 và PD-1 (Hình 3E ). Kết hợp lại với nhau, những kết quả này chứng minh việc xác định một epitope hạn chế HLA-DQ của E6 được công nhận bởi các TIL CD{75}} đơn dòng. Các tế bào T6-CD4+ cụ thể không nhận ra hoặc tiêu diệt các tế bào khối u tự thân biểu hiện MHC-II. Các nghiên cứu gần đây đã xác định được dấu hiệu di truyền của CD4+ TIL gây độc tế bào trong một số bệnh ung thư ở người (14, 15). Tuy nhiên, liệu tế bào T CD{82}} gây độc tế bào có đóng vai trò trong các bệnh ung thư do HPV gây ra hay không vẫn chưa được biết rõ. Để xác định xem các tế bào T6-CD4+ cụ thể từ TIL có thể nhận dạng trực tiếp HNSCC-56 hay không, trước tiên chúng tôi đã điều tra trạng thái biểu hiện MHC-II của nó. Mặc dù các tế bào khối u không biểu hiện MHC-II bề mặt có thể phát hiện được trong môi trường nuôi cấy, việc điều trị bằng IFN- trong 72 giờ là đủ để tạo ra sự điều hòa lên của MHC-II (Hình 4A). Tiếp theo, chúng tôi nuôi cấy HNSCC-56 bằng CD4+ F12 TIL. Điều quan trọng là các tế bào khối u MHC-II+ được điều hòa trước bằng IFN- không thể kích thích CD4+ TIL như được đo bằng sự bài tiết IFN- (Hình 4B).
Hình 1. Nhận dạng E6-CD phản ứng4+ và CD8+ TIL từ HPV-16+ HNSCC. (MỘT)
Hình 2. Các đặc điểm chức năng của TIL cụ thể E6-bị hạn chế HLA-A*02:01 từ Hu-56 TIL. (MỘT)
Tuy nhiên, các dòng tế bào khối u được điều trị bằng IFN được tạo xung bằng E61-15 trước khi bổ sung TIL có thể kích thích phản ứng của tế bào T, cho thấy rằng biểu hiện bề mặt của các alen HLA-DQ hạn chế trong dòng tế bào biểu hiện nội sinh E6 không đủ để nhận biết khối u nhưng cần phải nạp peptide mục tiêu ngoại sinh. Yêu cầu tương tự về lượng peptide mục tiêu ngoại sinh cũng được quan sát thấy với các tế bào khối u được tải nạp CIITA (HNSCC-56 CIITA), biểu hiện cấu thành mức độ cao của MHC-II bề mặt (Hình 4B). Để kiểm tra xem CD4+ TIL có thể nhận ra phiên bản được trình bày và xử lý nội sinh của epitope E6 trên APC hay không, chúng tôi đã tải nạp ngược các B-LCL tự thân với cấu trúc biểu thức mã hóa 50 axit amin đầu tiên của E6 được hợp nhất với MHC- Miền xuyên màng (E6-MITD), tạo ra sự định vị trình tự axit amin hợp nhất vào màng sinh chất và hỗ trợ sự trình diện trên MHC-II thông qua vận chuyển nội sinh (20). Các B-LCL biểu thị cấu trúc E6-MITD có thể kích thích các TIL E6-CD{20}} cụ thể, cho thấy rằng epitope peptide được các TIL này nhận biết có thể được xử lý và trình bày một cách tự nhiên trên MHC-II khi hướng đến con đường thích hợp (Hình 4C).
Hình 3. Các đặc điểm chức năng của TIL mở rộng vô tính, bị hạn chế HLA-DQ, E6-CD cụ thể4+. (MỘT)
Tiếp theo, chúng tôi tìm cách xác định xem liệu các TIL đặc hiệu của F12 E{1}}CD{2}} có khả năng gây độc tế bào trực tiếp cho khối u hay không. Phù hợp với dữ liệu từ các thử nghiệm nhận dạng của chúng tôi, TIL E6-CD cụ thể4+ không thể hạn chế sự phát triển của các tế bào khối u HNSCC-56 không biểu hiện MHC-II (Hình 4D) . Hơn nữa, các tế bào khối u HNSCC-56 CIITA cũng phát triển tự do khi có sự hiện diện của CD4+ TIL. Tuy nhiên, sự phát triển của các tế bào khối u HNSCC-56 CIITA được truyền xung bằng peptit E61-15 đã bị ức chế theo cách phụ thuộc vào liều tế bào tác động. Nhìn chung, những dữ liệu này cho thấy rằng mặc dù HNSCC-56 có thể hiển thị các epitop E6 cho tế bào T CD8+, nhưng các TIL E6-CD cụ thể4+ không thể trực tiếp nhận dạng và phân giải MHC- II+ tế bào khối u tự thân. Các gen liên quan đến trình diện kháng nguyên thường bị đột biến trong bệnh ung thư, điều này có thể ngăn cản sự nhận biết của tế bào T (21). Để xác định xem các tế bào khối u HNSCC-56 có chứa bất kỳ đột biến soma nào ngăn cản sự trình diện kháng nguyên trên MHC-II hay không, chúng tôi đã thực hiện giải trình tự toàn bộ exome của các tế bào khối u và PBMC từ Hu-56 làm mẫu đối chiếu. Trong số 104 đột biến soma không đồng nghĩa được xác định, không có đột biến rõ ràng nào trong các thành phần của con đường trình bày MHC-II, bao gồm HLADMA, HLADMB và CD74 (Bảng bổ sung 5). Xác định TCR đặc hiệu KRASG12V bị hạn chế HLA-DRB5*01:01 từ máu của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ống tụy. Sau những kết quả này, chúng tôi bắt đầu xác định xem liệu việc tế bào khối u không có khả năng trình diện kháng nguyên trên MHC-II có đúng với các gen gây ung thư khác hay không. Cho rằng các tế bào T đặc hiệu của khối u lưu hành đã được xác định ở bệnh nhân ung thư ở người (8, 22), chúng tôi đã kích thích PBMC từ một bệnh nhân (Hu-66) mắc ung thư biểu mô tuyến ống tụy (Bảng bổ sung 1) bằng một nhóm peptide tương ứng với các đột biến gây ung thư phổ biến (Bảng bổ sung 6) trong 14 ngày trước khi tái kích thích bằng các peptide riêng lẻ để xác định phản ứng của tế bào T có liên quan bằng ELISPOT. Những kết quả này cho thấy sự hiện diện của phản ứng tế bào T chống lại KRASG12V, bằng chứng là số lượng điểm IFN- tăng lên trên nền để phản ứng với các axit amin KRASG12V 1–15 (Hình 5A). Để xác định các TCR có liên quan liên quan đến phản ứng này, chúng tôi lại sử dụng xét nghiệm bài tiết cytokine để sắp xếp các tế bào tiết IFN-. Xét nghiệm bài tiết cytokine cho thấy sự sản xuất cụ thể các tế bào T IFN- của CD4+ để đáp ứng với sự tái kích thích bằng KRASG12V (Hình 5B). So sánh chuỗi TCR từ các tế bào tiết IFN- – được sắp xếp với các chuỗi có trong PBMC chưa được mở rộng từ bệnh nhân này cho thấy một kiểu nhân bản TCR duy nhất hiện diện ở tần số cao nhất trong cả hai quần thể (Hình 5C và Bảng bổ sung 2). Những kết quả này chỉ ra rằng tần số của bản sao tế bào T này đã được mở rộng ở mức cơ bản trong PBMC, gợi ý về phản ứng in vivo phát sinh tự nhiên thay vì mồi in vitro trong môi trường nuôi cấy mở rộng của chúng tôi. Để xác minh tính đặc hiệu của kháng nguyên của TCR này, chúng tôi đã biểu hiện nó trong tế bào T CD4+ nguyên phát ở người bằng cách tải nạp retrovirus và nuôi cấy các tế bào này bằng B-LCL tự thân được tạo xung bằng KRASG12V đột biến hoặc peptit WT tương ứng. Các tế bào T được thiết kế đã tiết ra IFN- khi được kích thích bằng đột biến, nhưng không phải WT, peptide KRAS, xác minh rằng TCR này đặc hiệu cho KRASG12V (Hình 5D). Phù hợp với kết quả của chúng tôi từ E6 TCR, các tế bào T được thiết kế biểu hiện TCR đặc hiệu KRASG12V cũng có thể nhận ra các B-LCL biểu thị một đoạn KRASG12V, chứ không phải WT KRAS, hướng đến nội nhũ bằng cách đưa vào MITD, cho thấy rằng điều này TCR nhận biết kháng nguyên được xử lý và trình diện nội sinh (Hình 5D).
Hình 4. Các tế bào khối u tự thân không biểu hiện E61-15 nội sinh trên tế bào T MHC-II đến CD4+. (MỘT)
Hình 5. Nhận dạng TCR đặc hiệu KRASG12V bị hạn chế HLA-DRB5*01:01 từ máu của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ống tụy. (MỘT)
Để xác định alen HLA hạn chế, chúng tôi đã lặp lại các thí nghiệm kích thích peptide này bằng cách sử dụng B-LCL biểu hiện các tổ hợp gen HLA khác nhau. Các B-LCL biểu hiện kiểu đơn bội HLA-B7-DR15-DQ6 phổ biến có thể kích thích các tế bào T được thiết kế, trong khi các B-LCL không có các alen này thì không thể (Hình 5E). Cuối cùng, việc kích thích các tế bào này bằng IHW03304 xung peptide, một dòng tế bào DAP3 của chuột được truyền HLA-DRB5*01:01 của con người, đã xác minh đây là phân tử HLA hạn chế (Hình 5F). Các tế bào khối u MHC-II+ NCI-H2444 và DAN-G không biểu hiện epitope có nguồn gốc từ KRASG12V cho các tế bào T CD4+. Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng của các tế bào khối u trong việc trình bày trực tiếp các epitop có nguồn gốc KRASG12V trên MHC-II. Để tạo ra các dòng tế bào MHC-II+ phù hợp với HLA cho các nghiên cứu này, chúng tôi đã chuyển nạp các dòng tế bào KRASG12V+ NCI-H2444 và DAN-G, có nguồn gốc từ ung thư phổi và ung thư tuyến tụy ở người, tương ứng, với CIITA và cấu trúc mã hóa HLA-DRB5*01: 01 với gen chỉ thị CD34 bị cắt cụt (Hình 6A). Phù hợp với các kết quả trước đây của chúng tôi, các tế bào khối u MHC-II+ biểu hiện alen HLA hạn chế không thể kích thích các tế bào T được thiết kế bằng TCR trừ khi các tế bào đích lần đầu tiên được tạo xung bằng peptide ngoại sinh (Hình 6B). Điều quan trọng là không có đột biến soma nào được liệt kê trong các gen trình bày MHC-II (cụ thể là HLADMA, HLADMB, CD74) đối với NCI-H2444 hoặc DAN-G trong dữ liệu giải trình tự có sẵn công khai (23). Các tế bào NCI-H2444 CIITA phát triển không bị ức chế khi có sự hiện diện của các tế bào T được thiết kế bởi TCR, trong khi các tế bào NCI-H2444 CIITA phát xung với peptide KRASG12V khiến khối u phát triển chậm (Hình 6C). Phù hợp với các kết quả thu được đối với các tế bào T HNSCC-56, CD8+ biểu thị HLA-A*03:01– bị hạn chế, TCR đặc hiệu KRASG12V (24) có thể nhận dạng các tế bào NCI-H2444 nhưng không Tế bào CaSki, biểu thị HLA-A*03:01 nhưng không biểu thị KRASG12V (Hình 6D). Những kết quả này chứng minh rằng một gen gây ung thư riêng biệt có trong bào tương cũng không thể được các tế bào khối u MHC-II+ trình diện mặc dù được trình bày một cách hiệu quả trên MHC-I. Sự biểu hiện của các phối tử đồng ức chế như phối tử chết tế bào được lập trình 1 (PD-L1) bởi các tế bào khối u sẽ hạn chế tín hiệu TCR trong tế bào T (25). Để xác định xem liệu cơ chế này có thể ngăn cản sự nhận biết các tế bào khối u MHC-II+ của tế bào T CD4+ hay không, chúng tôi đã nuôi cấy tế bào T CD4+ biểu hiện TCR đặc hiệu KRASG12V hoặc đặc hiệu E{86}} F12 TCR với NCI-H2444 CIITA và HNSCC-56 CIITA, tương ứng, có hoặc không có abs chống chặn PD-L1. Việc chặn các tương tác PD-L1/PD-1 là không đủ để thúc đẩy khả năng nhận dạng tế bào khối u (Hình bổ sung 3). Tương tự, việc bổ sung chất chủ vận kháng CD28 Ab không điều chỉnh khả năng nhận biết tế bào khối u. Những kết quả này cho thấy rằng việc thiếu trình bày kháng nguyên, thay vì sự hiện diện hay vắng mặt của các tín hiệu đồng ức chế hoặc đồng kích thích tương ứng, là nguyên nhân gây ra kiểu hình này. Một số nghiên cứu cho thấy rằng các protein nội sinh được hấp thụ từ màng sinh chất được ưu tiên nạp vào MHC-II để trình bày, so với các ngăn dưới tế bào khác (26). Mặc dù protein KRAS thường được liên kết với màng thông qua sửa đổi lipid, nhưng chúng không biểu hiện miền xuyên màng và những tương tác này không ổn định (3, 27). Do đó, chúng tôi lập luận rằng việc gắn mảnh miễn dịch của KRASG12V vào màng huyết tương của tế bào khối u có thể cho phép tế bào T CD{103}} nhận dạng kháng nguyên trực tiếp. Tuy nhiên, các tế bào khối u biểu hiện cấu trúc KRASG12V-MITD, được chứng minh bằng biểu hiện của trình báo cáo EGFP được liên kết với P2A, cũng không thể kích thích các tế bào T CD{109}} được xử lý bằng TCR (Bổ sung Hình 4). Những kết quả này cho thấy rằng việc định vị gen gây ung thư dưới tế bào không phải là yếu tố quyết định duy nhất cho sự biểu hiện trực tiếp MHC-II của các tế bào khối u. Ngoài ra, những kết quả này cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức của kháng nguyên là không đủ để thúc đẩy sự hiện diện của MHC-II. Cho đến nay, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các tế bào T CD4+ đặc hiệu của khối u có thể có nhiều khả năng nhận ra các kháng nguyên do APC trình bày hơn là chính các tế bào khối u. Do đó, chúng tôi đã đánh giá khả năng của HLARBB5*01:{117}} DC trong việc trình diện các kháng nguyên có nguồn gốc từ protein ngoại sinh. Các DC phù hợp với HLA được tạo ra trong ống nghiệm có khả năng kích thích các tế bào T CD{120}} được thiết kế bởi TCR biểu hiện TCR đặc hiệu KRASG12V khi các DC chưa trưởng thành được truyền xung bằng peptit KRASG12V 20-hoặc được cho ăn toàn bộ protein KRASG12V nhưng không phải protein KRAS WT (Hình 6E). Những kết quả này cho thấy rằng mặc dù TCR không thể nhận ra các kháng nguyên nội sinh được trình bày bởi các tế bào khối u, nhưng nó có thể nhận ra các kháng nguyên ngoại sinh được trình bày chéo trong bối cảnh các DC.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Cuộc thảo luận
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định xem liệu TCR được phân lập từ tế bào T có nguồn gốc tự nhiên thu được từ bệnh nhân ung thư có thể nhận ra các tế bào khối u biểu hiện gen gây ung thư hay không. Đối với loại I (HLA-A*02:01), bị hạn chế, HPV-16 E629-38 TCR thu được từ HNSCC TIL, có lẽ không có gì đáng ngạc nhiên khi sự công nhận đã được khẳng định đối với cả dòng tế bào khối u tự thân và tế bào khối u biểu hiện E6-có đặc điểm phù hợp với HLA và CaSki (quan trọng là xem Hình 2). Các TIL tương tự (Hình 1) cũng chứa một số lượng đáng kể các tế bào T cụ thể E{11}}CD{12}} sản xuất IFN (Hình 3), ngược lại, không nhận ra E{14}} biểu hiện các tế bào khối u, ngay cả khi chúng được tạo ra để biểu hiện nhiều loại MHC lớp II trên bề mặt của alen biểu hiện chính xác (DQA1*01:02/DQB1*05:02) bằng cách xử lý bằng IFN- hoặc tải nạp CIITA (Hình 4). Sự biểu hiện CIITA không chỉ tạo ra sự biểu hiện bề mặt của protein MHC-II mà còn cả HLA-DM và các phân tử chuỗi bất biến, cần thiết cho quá trình xử lý và trình diện kháng nguyên (28). Ngược lại, các tế bào B phù hợp với HLA được TCR này nhận ra khi kháng nguyên được hướng đến con đường MHC-II. Một tình huống tương tự đã được quan sát thấy trong trường hợp TCR bị hạn chế HLA-DRB5*01:01 đặc hiệu KRASG12V, có thể nhận ra các tế bào B phù hợp với HLA, nhưng không nhận ra các tế bào khối u biểu hiện MHC-II, khi kháng nguyên được hướng đến Lộ trình trình bày MHC-II. Cả hai TCR đều có đủ ái lực chức năng để làm trung gian cho việc nhận biết các kháng nguyên được biểu hiện nội sinh trong các điều kiện được mô tả ở trên và cả hai đều có thể làm trung gian cho độc tính tế bào của các tế bào đích được nạp peptide. Quan sát sau này phản ánh tình huống được trình bày trong một số báo cáo về tế bào T CD{38}} gây độc tế bào, mặc dù dữ liệu của chúng tôi mở rộng bối cảnh của quan sát này bằng cách chỉ ra rằng sự biểu hiện nội sinh của kháng nguyên nguồn và cảm ứng MHC-II bởi IFN- là khó xảy ra. để mang lại mục tiêu sinh lý trên các tế bào khối u có nguồn gốc từ biểu mô cho TCR chống lại các kháng nguyên liên quan đến hạt nhân hoặc màng. Các nghiên cứu gần đây về ung thư bàng quang và khối u ác tính ở người đã xác định được dấu hiệu di truyền tương ứng với tế bào T CD{42}} gây độc tế bào trong số TIL (14, 15). Về mặt chức năng, các CD4+ TIL gây độc tế bào này có khả năng nhận dạng trực tiếp khối u phụ thuộc MHC-II, cuối cùng dẫn đến sự phân giải mục tiêu bởi các granzyme theo cách tương tự như các đối tác CD8+ của chúng. Tuy nhiên, bản dịch trị liệu của những phát hiện này có thể bị hạn chế bởi thực tế là rất ít khối u rắn biểu hiện MHC-II. Thật vậy, kết quả của 2 nghiên cứu độc lập cho thấy chỉ khoảng 1/3 số bệnh nhân mắc khối u ác tính có bất kỳ tế bào khối u MHC-II+ nào và tần số của các tế bào này trong khối u thường dưới 10% (15, 29). Thay vào đó, nguồn tế bào chiếm ưu thế của MHC-II trong vi môi trường khối u dường như đang xâm nhập vào bạch cầu (26).
Hình 6. Các tế bào khối u MHC-II+ KRASG12V+ không biểu hiện các epitop có nguồn gốc từ KRASG12V cho các tế bào T CD4+. (MỘT)
Mặc dù một số tế bào khối u rắn biểu hiện MHC-II cấu thành hoặc cảm ứng, nhưng kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng mặc dù có sự hiện diện của các tế bào T CD4+ đặc hiệu gen gây ung thư trong số TIL và PBMC, những tế bào này không thể trực tiếp nhận biết và loại bỏ biểu hiện kháng nguyên. Các tế bào khối u MHC-II+, trong khi các epitop từ cùng một loại protein có thể được trình diện một cách hiệu quả cho các tế bào T CD8+ trên MHC-I (13). Điều này cho thấy rằng việc chỉ biểu hiện kháng nguyên đích có thể không đủ để khiến tế bào T CD{10}} nhận biết đối với tập hợp con các khối u biểu hiện MHC-II. Hơn nữa, những kết quả này dường như nhất quán trên nhiều loại khối u, bởi vì các dòng tế bào được truy vấn trong nghiên cứu này bao gồm những dòng có nguồn gốc từ HNSCC, ung thư biểu mô tuyến phổi và ung thư tuyến tụy. Nhận dạng tế bào T CD4+ trực tiếp của các dòng tế bào u ác tính biểu hiện MHC-II một cách tự nhiên hoặc sau khi tải nạp CIITA đã được báo cáo trong 2 nghiên cứu (30, 31). Tuy nhiên, trong cả hai nghiên cứu này, một phần đáng kể TCR được thử nghiệm không nhận dạng trực tiếp các tế bào khối u. Không rõ liệu các TCR này đại diện cho các kiểu nhân bản "người ngoài cuộc" không nhận ra kháng nguyên khối u hay các TCR đặc hiệu của khối u không thể nhận ra kháng nguyên nhận thức của chúng do thiếu hụt trình bày kháng nguyên như những gì được nêu bật trong nghiên cứu này. Oliveira và cộng sự. (31) đã chứng minh rằng sự nhận biết trực tiếp của tế bào T CD4+ bị giới hạn ở 2 khối u ác tính với gánh nặng đột biến khối u cực kỳ cao, cho thấy kiểu hình này có thể tạo ra những thay đổi cần thiết bổ sung cho phép trình bày kháng nguyên khối u MHC-II. Mặc dù việc gắn MITD vào đoạn miễn dịch của KRASG12V không dẫn đến sự nhận biết trực tiếp các tế bào khối u bởi tế bào T CD{23}}, nhưng các nghiên cứu đã mô tả sự thiên vị đối với các peptide nội sinh có nguồn gốc từ các protein gắn màng được rửa giải từ MHC-II, có lẽ là do tái chế màng (26, 32). Kháng nguyên khối u ác tính Trp1 tồn tại trong màng sinh chất, điều này có thể tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào khối u B16 trình bày trực tiếp tới tế bào T CD4+ (33). Một kháng nguyên khác liên quan đến khối u ác tính, gp100, được các tế bào khối u trình diện cho tế bào T CD4+ theo cách phụ thuộc vào miền xuyên màng của gp100 (34). Trong nghiên cứu gần đây nghiên cứu vai trò của tế bào T CD4+ đặc hiệu tân kháng nguyên trong mô hình sarcoma ở chuột, các epitop có nguồn gốc từ tiểu đơn vị integrin đột biến, cũng là protein gắn màng, đã được loại bỏ khỏi MHC-II trên khối u được tải nạp CIITA tế bào (35). Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng mặc dù các protein gắn màng có thể được ưu tiên chuyển đến nội nhũ để trình bày trực tiếp trên MHC-II, nhưng chỉ sự hiện diện của protein màng miễn dịch là không đủ để thúc đẩy sự trình bày này. Các con đường trình diện không phân lớp khác đã được mô tả có thể cho phép các protein tế bào hoặc hạt nhân tiếp cận với MHC-II, bao gồm sự trình diện liên quan đến quá trình tự thực của các protein nội bào và chất vận chuyển liên quan đến quá trình xử lý kháng nguyên-sự trình diện phụ thuộc vào các tế bào T CD{48}}, nhờ đó các kháng nguyên được trình diện. peptide có lẽ được chuyển từ MHC-I sang MHC-II trong quá trình tái chế màng (36, 37). Sự nhận dạng trực tiếp phụ thuộc vào MHC-II của các tế bào khối u tự thân bằng tế bào T CD4+ đặc hiệu cho các epitop E7 đã được báo cáo (38, 39); tuy nhiên, những nghiên cứu này đều quan tâm đến các protein E7 được biểu hiện bằng các phân nhóm HPV gây ung thư ít phổ biến hơn (cụ thể là HPV-33 và HPV-59) do các tế bào ung thư cổ tử cung biểu hiện trên các phân tử HLA-DR. Do đó, có thể phân nhóm HPV, mô học khối u và các alen HLA hạn chế cũng có thể là những yếu tố liên quan trong sự trình bày khác biệt của kháng nguyên HPV hạt nhân trên tế bào khối u MHC-II+. Mặc dù dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng khả năng gây độc tế bào khối u trực tiếp không phải là cơ chế có thể xảy ra của tế bào T CD6- và KRASG12V đặc hiệu, các cơ chế chống ung thư khác của tế bào T CD4+ đã được mô tả và Việc chuyển giao tế bào T CD4+ đặc hiệu cho khối u ở bệnh nhân ung thư đã chứng minh hoạt động chống ung thư (7, 40, 41). Do đó, các TCR bị hạn chế bởi MHC-II như những TCR được xác định trong nghiên cứu này có thể hữu ích cho ACT ở bệnh nhân ở người, do việc nhắm mục tiêu của các TCR đó vào các epitope có nguồn gốc từ các oncoprotein điều khiển được giới hạn ở các haplotype HLA ước tính ở mức 1,27% và 16,10% của Hoa Kỳ. dân số tương ứng cho HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 và HLA-DRB5*01:01 (42). Đáng chú ý, tế bào T CD4+ hỗ trợ mồi cho tế bào T CD8+ đặc hiệu của khối u bằng cách cấp phép cho các DC mang kháng nguyên theo cách phụ thuộc CD40L (43–45). Chúng tôi chứng minh rằng TCR đặc hiệu KRASG12V được xác định trong nghiên cứu này nhận ra các kháng nguyên được trình bày chéo trong bối cảnh DC, cho thấy các tế bào này có thể góp phần vào khả năng miễn dịch chống ung thư thông qua chức năng này. Tế bào T CD4+ cũng có thể cung cấp trợ giúp cục bộ cho tế bào T CD8+ trong khối u bằng cách tiết ra các cytokine như IL-2 và IFN-, hỗ trợ sự sống sót của tế bào T CD8+ và huy động vào khối u (46). Ngoài ra, CD{106}} TIL có thể nhận ra các kháng nguyên trong vi môi trường khối u trên các tế bào dòng tủy chẳng hạn như đại thực bào. Thật vậy, các nghiên cứu tiền lâm sàng đã chứng minh rằng khi không có MHC-II trên tế bào khối u, các tế bào T Trp1 CD{109}} được chuyển tiếp nuôi vẫn có thể phát huy khả năng miễn dịch chống ung thư phụ thuộc vào IFN- và tương quan với hoạt động gây độc tế bào tăng lên của đại thực bào (47). Tuy nhiên, hiện tượng này dường như phụ thuộc vào sự tiết kháng nguyên của khối u, điều mà chúng tôi cũng suy đoán là rất ít trong trường hợp của hầu hết các gen gây ung thư. Nhìn chung, nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh tính chọn lọc của việc trình diện trực tiếp các kháng nguyên nội sinh bởi các tế bào khối u MHC-II+ và chứng minh rằng cả biểu hiện CIITA lẫn sự hiện diện của kháng nguyên gắn màng đều không đủ để thúc đẩy sự nhận biết trực tiếp của các tế bào khối u bằng CD{115} } Tế bào T. Cần có nhiều nghiên cứu hơn để xác định đặc điểm của kháng nguyên nào có thể được tế bào khối u MHC-II+ trình diện trực tiếp trong những điều kiện nào để hiểu đầy đủ về vai trò phụ thuộc vào ngữ cảnh của tế bào T CD{119}} trong bệnh ung thư.
cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch
phương pháp
Nuôi cấy tế bào. TIL được thu hoạch và nuôi cấy như mô tả trước đây (48). Tóm lại, mô khối u nguyên phát được mổ thành các mảnh 2–3 mm, được đặt vào một 24-đĩa giếng và nuôi cấy trong RPMI-1640 được bổ sung 1{{102}}% huyết thanh AB người, penicillin-streptomycin, HEPES, gentamicin và 6,000 IU/ mL IL-2. TIL thoát mạch được nuôi cấy bằng cách thay thế một nửa phương tiện cứ sau 2–3 ngày. Tế bào T sơ cấp của người từ máu ngoại vi được nuôi cấy trong môi trường 50:50 bao gồm 50% AIM V cộng với 50% RPMI-1640 được bổ sung 10% huyết thanh AB người, penicillin-streptomycin (100 U/ mL mỗi loại; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 và 5 ng/mL IL-15. Các dòng tế bào khối u có nguồn gốc từ bệnh nhân đã được tạo ra và nuôi cấy như mô tả trước đây (17). Tóm lại, mô khối u nguyên phát được cắt thành các mảnh nhỏ hơn 2 mm và phân tách bằng Máy phân ly Octo GentleMACS (Miltenyi Biotec). Các tế bào khối u được treo lại trong F-Media chứa chất ức chế Rho kinase 5 μM và được đặt trên một lớp nguyên bào sợi 3T3 đã chiếu xạ (30 Gy). Sau quá trình nuôi cấy ban đầu, các tế bào khối u được nhân lên trong hỗn hợp 3:1 giữa môi trường điều hòa 3T3-được chiếu xạ và F-Media chứa chất ức chế Rho kinase 5 μM. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L và B-LCL được duy trì trong môi trường RPMI bổ sung l-glutamine và HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM natri pyruvate (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM axit amin không thiết yếu (Gibco, Thermo Fisher Scientific) và penicillin-streptomycin (100 U/ mL mỗi loại; Gibco). Chúng tôi duy trì 293GP (ATCC) trong môi trường bổ sung DMEM với 10% FBS và penicillin-streptomycin (mỗi loại 100 U/mL; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Các tế bào IHW03304, GM3107, KAS011, D8 và D66 là quà tặng từ Alessandro Sette (Viện Miễn dịch học La Jolla). Xét nghiệm ELISPOT. TIL hoặc PBMC được mạ ở mức 100,000 ô trên mỗi giếng trong các tấm ELISPOT được phủ antiIFN– Abs (1-D1K, Mabtech). Các tế bào được mô phỏng lại bằng các nhóm peptide HPV{70}} E6 và E7 PepMix (JPT), các nhóm peptide đại diện cho các đột biến gây ung thư chọn lọc hoặc các peptide riêng lẻ được chỉ định ở mức 5 ug/mL đối với nhóm hoặc 10 ug/mL đối với peptide trong 22 giờ trước khi phát triển Tấm ELISPOT theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Mabtech). Để kiểm soát dương tính, người ta sử dụng 5 ug/mL phytohemagglutinin-L. Văn hóa mở rộng ex vivo. PBMC được mạ một nhóm peptide đại diện cho các đột biến gây ung thư chọn lọc ở mức 5 ug/mL. Môi trường tươi chứa 10 IU/mL IL-2 đã được thêm vào các ngày 4, 7 và 10. Vào ngày 14, PBMC đã được mô phỏng lại để sử dụng trong các xét nghiệm bài tiết ELISPOT hoặc cytokine. Trình tự TCR. TIL hoặc PBMC được mô phỏng lại bằng 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) hoặc peptide KRASG12V và các tế bào tiết IFN- được gắn thẻ huỳnh quang bằng cách sử dụng bộ Xét nghiệm bài tiết IFN ở người theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Miltenyi Biotec) . Các tế bào IFN{91}} đơn lẻ được sắp xếp vào một đĩa giếng 96-bằng FACSAria (BD Biosciences) và RNA-Seq được thực hiện bằng Illumina Miseq để xác định TCR và chuỗi ghép đôi. Để xác định bản sao TCR cụ thể của E6-CD{95}}, các tế bào tiết IFN- được sắp xếp như trên và các chuỗi TCR và TCR được khuếch đại bằng PCR lồng ghép, như đã mô tả trước đây (49). Các sản phẩm PCR đã được gửi để giải trình tự Sanger (ETON Bioscatics). Để phân tích tần số TCR, PBMC trước và sau 14-ngày mở rộng ex vivo với các peptide được chỉ định đã được gửi đến Công nghệ sinh học thích ứng. Phân tích biểu hiện HPV. RNA được phân lập từ tế bào khối u nguyên phát Hu-56 và dòng tế bào khối u và gửi đến RNA-Seq số lượng lớn. Các lần đọc trình tự đầu cặp được ánh xạ bằng cách sử dụng BWA (v0.7.12) (50) tới bộ gen hoàn chỉnh của HPV (số đăng nhập GenBank. NC{106}}.2) và bản phiên mã tương ứng của nó. Tệp bản đồ căn chỉnh trình tự thu được đã được chuyển đổi thành bản đồ căn chỉnh nhị phân được sắp xếp và lập chỉ mục, sau đó đếm số lần đọc được ánh xạ bằng SAMtools (v1.2) (50). Trình tự toàn bộ exome. Trình tự toàn bộ exome và RNA-Seq đã được thực hiện tại Viện trình tự trình tự miễn dịch học La Jolla bằng cách sử dụng bộ dụng cụ chụp toàn bộ exome và Illumina của Agilent tương ứng. Các mẫu sinh học FFPE đã được Trung tâm Ung thư Moores phân phối đến Tempus để giải trình tự thế hệ tiếp theo cùng với DNA tham chiếu phù hợp bằng cách sử dụng các mẫu máu ngoại vi. Trình tự đọc từ trình tự exome của khối u và các mẫu bình thường được căn chỉnh theo bộ gen tham chiếu GRCh38 bằng cách sử dụng SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Các biến thể exome được xác định bằng SpeedSeq Somatic và các biến thể được chú thích bằng SNPeff (v4.3i) (52). Dữ liệu giải trình tự RNA-Seq và toàn bộ exome cho bản thảo này đã được tải lên NCBI BioProject, số đăng nhập PRJNA924789. Sự tải nạp retrovirus của tế bào T. Trình tự nucleotide TCR đã được tổng hợp và nhân bản trong xương sống retrovirus MSGV1 bằng BioXP 3200 (Codex). Trình tự này được tối ưu hóa codon để biểu hiện trong tế bào người. Các vùng cố định TCR của con người được trao đổi lấy các vùng cố định TCR của chuột với các chất thay thế để tăng cường biểu hiện bề mặt và thúc đẩy sự ghép đôi ưu tiên (53, 54). PBMC của con người được phân lập từ áo khoác đệm. Các tế bào T CD4+ hoặc CD8+ đã bị loại bỏ bằng phương pháp chọn lọc từ tính và phần âm tính chứa tất cả các tế bào lympho còn lại được nuôi cấy trong môi trường tế bào T có kháng thể CD3 Ab (OKT3) 50 ng/mL trong 2 ngày.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
Các chất nổi phía trên retrovirus TCR được tạo ra bằng cách đồng chuyển hóa các tế bào 293GP với vectơ MSGV1 chứa trình tự TCR có liên quan và plasmid RD113. Hai ngày sau khi truyền nhiễm, chất nổi phía trên retrovirus được thu hoạch và sử dụng tươi hoặc đông lạnh ở nhiệt độ -80 . Quá trình tải nạp được thực hiện trên các tấm được phủ RetroNectin (Takara), như được mô tả trước đây (5). Biểu hiện vùng không đổi TCR của Murine được đánh giá bằng phương pháp tế bào học dòng chảy để xác định hiệu quả tải nạp. Các tế bào T được thiết kế bằng TCR đã được sử dụng không sớm hơn ngày thứ 7 sau lần kích thích ban đầu. Xét nghiệm chức năng tế bào T. Chúng tôi đã nuôi cấy 5 × 104 TIL, tế bào T được tải nạp hoặc tế bào J76 Jurkat với 1 × 105 B-LCL được đập qua đêm với nồng độ peptide hoặc tế bào khối u 5 × 103 được chỉ định vào ngày hôm trước trong {{16} }tấm đáy chữ U hoặc đáy phẳng tương ứng. Trong trường hợp được chỉ định, chất chủ vận kháng CD28 (bản sao CD28.2, BioLegend) hoặc chất chống chặn PD-L1 (bản sao 29E.2A3, BioLegend) Abs đã được thêm vào các tế bào T và tế bào khối u nuôi cấy ở mức tương ứng là 5 và 10 ug/mL. Đối với các xét nghiệm cytokine và chất đánh dấu kích hoạt, Cocktail kích hoạt tế bào 1 × (BioLegend) có chứa PMA và ionomycin đã được sử dụng làm đối chứng dương tính. Đối với các nghiên cứu ngăn chặn HLA, 20 ug/mL Abs sau đây đã được thêm vào B-LCL xung peptide ít nhất 2 giờ trước khi bổ sung tế bào T: kháng HLA-DQ (Tü169, BioLegend), kháng HLA-DR (L243, BioLegend) hoặc kiểm soát kiểu mẫu IgG2a của chuột (MOPC-173, BioLegend). Trong trường hợp được chỉ định, các tế bào khối u được nuôi cấy trong 72 giờ với IFN- tái tổ hợp 10 ng/mL trước khi bổ sung tế bào T. Chất nổi trên bề mặt được thu hoạch sau 18–24 giờ, IFN- được đo bằng ELISA (Thermo Fisher Scientific) và các viên tế bào được nhuộm màu để đo tế bào theo dòng chảy. Các thử nghiệm về độc tính tế bào được thực hiện bằng cách nuôi cấy kết hợp tế bào T với các tế bào khối u ở tỷ lệ tác động trên mục tiêu được chỉ định. Tóm lại, các tế bào khối u 5 × 103 đã được gieo hạt và nuôi cấy qua đêm trước khi thêm tế bào T theo tỷ lệ được chỉ định. Quá trình phân giải tế bào đích được xác định bằng cách sử dụng Máy phân tích tế bào thời gian thực xCELLigence (ACEA Bioscatics), đánh giá trở kháng điện do sự bám dính của tế bào cứ sau 30 phút cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Dữ liệu được phân tích bằng gói phần mềm xCELLigence RTCA và kết quả được báo cáo khi chỉ số ô được chuẩn hóa thành 1 tại thời điểm các ô T được thêm vào. Xét nghiệm trình bày MHC-II. Các cấu trúc DNA tổng hợp mã hóa những phần sau đây được tạo ra và nhân bản vào MSGV1 bằng cách sử dụng BioXP 3200 (Codex): 25 axit amin đầu N của gen HLA-B ở người, tiếp theo là 50 axit amin đầu tiên của HPV-16 E6 hoặc 25 axit amin KRASG12V kết hợp với 55 axit amin đầu C của HLA-B ở người, yếu tố tự phân cắt T2A và trình tự mã hóa của EGFP. Các chất siêu vi rút được tạo ra như mô tả ở trên và các B-LCL tự thân được tải nạp trên các tấm phủ RetroNectin sau khi kích thích qua đêm trên một lớp tế bào 3T3 được chiếu xạ (0,5 Gy) biểu hiện CD40L (3T3-CD40L của con người). Hiệu suất tải nạp được đánh giá bằng cách định lượng tế bào học dòng biểu hiện EGFP. Các B-LCL tải nạp được kích thích bằng 3T3-CD40L với sự hiện diện của IL người tái tổ hợp 200 IU/mL-4 (PeproTech) trong 2 vòng liên tiếp trong 2–3 ngày trước khi nuôi cấy chung với TIL tự thân. Tạo DC cho xét nghiệm trình diện kháng nguyên. DC được tạo ra bằng phương pháp bám dính nhựa. PBMC đông lạnh được rã đông và mạ trong môi trường DC (RPMI-1640 bổ sung l-glutamine, huyết thanh AB người bất hoạt nhiệt 5% và 100 U/mL mỗi penicillin-streptomycin) trong 2 giờ ở 37 độ. Các tế bào không bám dính được loại bỏ bằng cách rửa bằng PBS ấm và các tế bào bám dính được nuôi cấy trong môi trường DC bổ sung 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Bioscatics) và 500 U/mL IL-4 (PeproTech) trong 6 ngày . Chúng tôi đã thêm trực tiếp 1 ug/mL KRASG12V peptide hoặc 20 ug/mL KRASG12V hoặc WT KRAS protein (Abcam) vào các DC chưa trưởng thành qua đêm. Ngày hôm sau, các DC được thu hoạch và kết hợp với các tế bào T được thiết kế bằng TCR theo tỷ lệ 1:1 qua đêm trước khi đánh giá quá trình điều hòa CD137 bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Sự tải nạp retrovirus của các tế bào khối u. Trình tự mã hóa CIITA của con người đã được tổng hợp (Công nghệ DNA tích hợp) và được Gibson Assembly nhân bản vào MSGV1. Các trình tự mã hóa của HLADRB5*01:01 và các chuỗi được phân tách bằng trình tự P2A đã được tổng hợp (Công nghệ DNA tích hợp) và được tách dòng vào vectơ lentivirus pHAGE cải biến ngược dòng trình tự T2A, sau đó là trình tự báo cáo CD34 bị cắt ngắn bởi Gibson Assembly. Chất nổi phía trên retrovirus được tạo ra bằng MSGV1, như được mô tả ở trên. Các chất siêu nhiên của lentivirus được tạo ra bằng cách đồng chuyển hóa các tế bào 293T với các plasmid pHAGE, tat, rev, gag/pol và vsv-g. Chất siêu vi rút được thu thập 24 giờ sau đó và cô đặc bằng cách ly tâm trong ống Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Các tế bào khối u được đặt vào đĩa và 1 ngày sau, môi trường được thay thế bằng chất nổi phía trên retrovirus hoặc lentivirus được bổ sung 10 ug/mL polybrene. Bốn giờ sau, chất nổi phía trên chứa virus được hút ra và thay thế bằng môi trường nuôi cấy. Các tế bào khối u MHC-II+ và CD{126}} được sắp xếp bằng máy phân loại tế bào FACS Fusion (BD Bioscatics). Dòng tế bào học. Các tế bào được dán nhãn Abs đơn dòng liên hợp fluorochrome với các kháng nguyên sau: CD3–PE chống người (OKT3, Tonbo, Cytek Bioscatics), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Bioscatics), CD8–APC (Hit8a, Tonbo , Khoa học sinh học Cytek), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) và chuột chống chuột TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Bioscatics). Các tế bào chết được nhuộm bằng DAPI hoặc LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer đã được Cơ sở lõi Tetramer NIH lắp ráp và dán nhãn. Các tế bào được nhuộm bằng tetramer 1 ug/mL trong 1 giờ trên băng. Nhuộm Ab để tìm kháng nguyên bề mặt được thực hiện trong 15 phút trên băng. Đối với nhuộm cytokine nội bào (ICS), các tế bào T được nuôi cấy bằng APC xung peptide trong 4–6 giờ với sự hiện diện của Brefeldin A. Các tế bào được thẩm thấu và nhuộm màu cho các cytokine nội bào bằng Bộ Cytofix/Cytoperm (BD Bioscatics) sau khi nhuộm bề mặt , theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Abs liên hợp fluorochrome sau đây được sử dụng để nhuộm cytokine: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) và Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Dữ liệu được thu thập bằng máy đo dòng chảy FACSCelesta (BD Bioscatics) và được phân tích bằng phần mềm FlowJo v10.7. Số liệu thống kê. Phân tích thống kê được thực hiện với Prism 8 (Phần mềm GraphPad). Để so sánh ICS, một thử nghiệm t đuôi 2-không ghép đôi đã được sử dụng. Để so sánh việc ngăn chặn HLA đối với việc ức chế tín hiệu tế bào T qua trung gian Ab–Ab, 2-cách ANOVA đã được sử dụng. P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Phê duyệt nghiên cứu. Các mẫu người đã được xác định danh tính được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy theo sự đồng ý có hiểu biết thông qua giao thức UCSD IRB 101391CX, "Xác định kiểu hình môi trường khối u và cách ly tế bào". Sự đồng ý bằng văn bản được cung cấp bởi các cá nhân trong nghiên cứu.
Người giới thiệu
1. Hanahan D, Weinberg RA. Dấu hiệu của bệnh ung thư: thế hệ tiếp theo. Tế bào. 2011;144(5):646–674.
2. Shamseddine AA, và cộng sự. Miễn dịch khối u và liệu pháp miễn dịch đối với các bệnh ung thư liên quan đến HPV. Ung thư Discov. 2021;11(8):1896–1912.
3. Simanshu DK và cộng sự. Đánh giá hàng đầu về protein RAS và chất điều hòa chúng trong bệnh ở người. Tế bào. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Một kho đa dòng lớn bất ngờ của các tế bào T đặc hiệu HPV đã sẵn sàng hoạt động ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Ung thư Res. 2010;70(7):2707–2717.
5. Stevanović S, et al. Bối cảnh của các kháng nguyên khối u miễn dịch trong liệu pháp miễn dịch thành công đối với bệnh ung thư biểu mô do virus gây ra. Khoa học. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH và cộng sự. Việc lập hồ sơ các phản ứng tế bào T đặc hiệu-16-của HPV cho thấy khả năng phản ứng kháng nguyên rộng rãi ở bệnh nhân ung thư vòm họng. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR và cộng sự. Các tế bào T CD4 + đặc hiệu BRAF V600E xâm nhập khối u tương quan với phản ứng lâm sàng hoàn toàn đối với khối u ác tính. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.
8. Veatch JR và cộng sự. Tế bào T CD4+ nội sinh nhận ra kháng nguyên mới ở bệnh nhân ung thư phổi, bao gồm các đột biến trình điều khiển KRAS và ERBB2 (Her2) gây ung thư tái phát. Ung thư miễn dịch Res. 2019;2(13):910–922.
9. Cafri G và cộng sự. Các tế bào T trí nhớ nhắm vào các đột biến gây ung thư được phát hiện trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư biểu mô. Xã Nat. 2019;10(1):449.
10. Trần Ế, et al. Liệu pháp chuyển tế bào T nhắm vào KRAS đột biến trong bệnh ung thư. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Draper LM và cộng sự. Nhắm mục tiêu các tế bào ung thư biểu mô HPV-16+ bằng các tế bào T được thiết kế gen TCR trực tiếp chống lại E6. Ung thư lâm sàng Res. 2015;21(19):4431–4439.
12. Jin BY và cộng sự. Các tế bào T được thiết kế nhắm mục tiêu E7 làm trung gian cho sự hồi quy của bệnh ung thư u nhú ở người trong mô hình chuột. Cái nhìn sâu sắc của JCI. 2018;3(8):e99488.
13. Gấu AS và cộng sự. Đặc tính sinh hóa và chức năng của các epitope KRAS đột biến xác nhận oncoprotein này để nhắm mục tiêu miễn dịch. Xã Nat. 2021;12(1):4365.
14. Ôi DY và cộng sự. Tế bào T CD4+ trong khối u làm trung gian cho quá trình gây độc tế bào chống khối u trong bệnh ung thư bàng quang ở người. Tế bào. 2020;181(7):1612–1625.
15. Cachot A và cộng sự. Tế bào T CD4 đặc hiệu khối u làm trung gian miễn dịch bảo vệ chống lại bệnh ung thư ở người. Khoa học Adv. 2021;7(9):eabe3348.
16. Doran SL, và cộng sự. Liệu pháp gen thụ thể tế bào T đối với bệnh ung thư biểu mô liên quan đến papillomavirus ở người: nghiên cứu giai đoạn I/II đầu tiên ở người. J lâm sàng Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Liu X và cộng sự. Lập trình lại có điều kiện và mở rộng lâu dài các tế bào khối u và bình thường từ mẫu sinh học của con người. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.
18. Veatch JR và cộng sự. Các tế bào T CD4+ đặc hiệu tân kháng nguyên trong khối u ác tính ở người có trạng thái biệt hóa đa dạng và tương quan với tế bào T CD8+, đại thực bào và chức năng tế bào B. Tế bào ung thư. 2022;40(4):393–409.
19. Lowery FJ và cộng sự. Chữ ký phân tử của tế bào T phản ứng tân kháng nguyên chống ung thư từ bệnh ung thư di căn ở người. Khoa học. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S, và cộng sự. Tăng hiệu quả trình diện kháng nguyên bằng cách ghép các kháng nguyên với tín hiệu vận chuyển MHC lớp I. J Miễn dịch. 2008;180(1):309–318.
21. Zaretsky JM và cộng sự. Các đột biến liên quan đến khả năng kháng lại sự phong tỏa PD{1}} mắc phải trong khối u ác tính. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.
22. Gros A và cộng sự. Nhận biết các tân kháng nguyên ung thư đường tiêu hóa ở người bằng cách lưu hành các tế bào lympho PD{1}}. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.
23. Scholtalbers J, và cộng sự. TCLP: danh mục dòng tế bào ung thư trực tuyến tích hợp loại HLA, dự đoán các epitope mới, virus và biểu hiện gen. Bộ gen Med. 2015;7(1):118.
24. Juneja V, Choi J, nhà phát minh; BioNTech US Inc., người được chuyển nhượng. Cấu trúc thụ thể tế bào T và cách sử dụng chúng. Bằng sáng chế Hoa Kỳ số US202103040215A1. Ngày 4 tháng 11 năm 2021.
25. Sharpe AH, Pauken KE. Các chức năng đa dạng của con đường ức chế PD1. Nat Rev Miễn dịch. 2018;18(3):153–167.
26. Abelin JG và cộng sự. Xác định các quy tắc liên kết và xử lý phối tử HLA-II bằng phép đo phổ khối giúp tăng cường dự đoán văn bia ung thư. Miễn dịch. 2019;51(4):766–779.
27. Silvius JR, và cộng sự. K-ras4B và các protein prenylat hóa thiếu "tín hiệu thứ hai" liên kết linh hoạt với màng tế bào. Tế bào sinh học Mol. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. Chất chuyển hóa loại II điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều gen liên quan đến việc trình diện kháng nguyên. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.
29. Rodig SJ và cộng sự. Protein MHC tạo ra độ nhạy khác biệt đối với sự phong tỏa CTLA-4 và PD-1 trong khối u ác tính di căn không được điều trị. Khoa học dịch thuật. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M, và cộng sự. Các tế bào T điều hòa CD4+ xâm nhập khối u của con người hiển thị một tiết mục TCR riêng biệt và biểu hiện khả năng phản ứng của khối u và tân kháng nguyên. Khoa học miễn dịch. 2019;4(31):eaao4310.
31. Oliveira G, và cộng sự. Bối cảnh của tế bào T CD{1}} trợ giúp và điều hòa chống ung thư trong khối u ác tính. Thiên nhiên. 2022;605(7910):532–538.
32. Rock KL và cộng sự. Hãy trình bày bản thân bạn! Bởi các phân tử MHC lớp I và MHC lớp II. Xu hướng miễn dịch. 2016;37(11):724–737.
33. Takechi Y và cộng sự. Protein màng melanosomal là mục tiêu bề mặt tế bào để điều trị khối u ác tính. Ung thư lâm sàng Res. 1996;2(11):1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. Trình tự nhắm mục tiêu hắc tố từ gp100 rất cần thiết cho việc trình bày và huy động epitope nội sinh bị hạn chế MHC lớp II đến các ngăn nội sinh. Ung thư Res. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach E, và cộng sự. Neoantigens MHC-II định hình khả năng miễn dịch của khối u và đáp ứng với liệu pháp miễn dịch. Thiên nhiên. 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J, và cộng sự. Autophagy thúc đẩy trình bày peptide MHC lớp II từ protein nguồn nội bào. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, và cộng sự. Cần có các con đường xử lý kháng nguyên phi cổ điển để nhận dạng khối u trực tiếp bị hạn chế MHC loại II bởi các tế bào T đặc hiệu NY-ESO-1- CD4+. Ung thư miễn dịch Res. 2009;2(4):341–350.
38. Höhn H, et al. Các tế bào lympho xâm nhập khối u CD4+ trong ung thư cổ tử cung nhận ra các peptide bị hạn chế HLA-DR do papillomavirus-E7 ở người cung cấp. J Miễn dịch. 1999;163(10):5715–5722.
39. Höhn H, et al. Các peptide papillomavirus loại 33 ở người được HLA-DR * 0402 trình bày cho các tế bào T xâm nhập khối u trong ung thư cổ tử cung. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC, et al. Điều trị bệnh nhân ung thư di căn bằng cách sử dụng thụ thể tế bào T hạn chế phức hợp tương hợp mô học loại II nhắm vào kháng nguyên mầm ung thư MAGE-A3. J lâm sàng Oncol. 2017;35(29):3322–3329.
41. Trần Ế, et al. Liệu pháp miễn dịch ung thư dựa trên tế bào T CD4+ đặc hiệu đột biến ở bệnh nhân ung thư biểu mô. Khoa học. 2014;344(6184):641–645.
42. Gonzalez-Galarza FF, và cộng sự. Bản cập nhật cơ sở dữ liệu mạng tần số alen (AFND) 2020: phân loại dữ liệu tiêu chuẩn vàng, dữ liệu kiểu gen truy cập mở và các công cụ truy vấn mới. Axit nucleic Res. 2020;48(d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP, và cộng sự. Sự hỗ trợ của tế bào T đối với tế bào lympho T gây độc tế bào được thực hiện qua trung gian tương tác CD40-CD40L. Thiên nhiên. 1998;393(6684):480–483.
44. Ahrends T, và cộng sự. Tế bào T CD4+ giúp thực hiện chương trình tác động tế bào T gây độc tế bào bao gồm điều hòa giảm thụ thể đồng ức chế và tăng khả năng xâm lấn mô. Miễn dịch. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST, và cộng sự. cDC1 nguyên tố và được các tế bào T CD4+ cấp phép để tạo ra khả năng miễn dịch chống khối u. Thiên nhiên. 2020;584(7822):624–629.
46. Bos R, Sherman LA. Cần có sự trợ giúp của tế bào T CD4+ trong môi trường khối u để tuyển dụng và thực hiện chức năng tiêu tế bào của tế bào lympho T CD8+. Ung thư Res. 2010;70(21):8368–8377.
47. Haabeth OAW, và cộng sự. Sự đào thải qua trung gian tế bào T CD4+ đối với các tế bào khối u dương tính với MHC loại II phụ thuộc vào sự tiết kháng nguyên và sự trình diện gián tiếp trên APC của vật chủ. Ung thư Res. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME, và cộng sự. Tạo ra môi trường nuôi cấy tế bào lympho xâm nhập khối u để sử dụng trong liệu pháp chuyển giao nuôi dưỡng cho bệnh nhân u ác tính. J Miễn dịch. 2003;26(4):332–342.
49. Dấu gạch ngang P, và cộng sự. Phân tích đơn bào của các tiết mục thụ thể tế bào T. Phương pháp Mol Biol. 2015;1343:181–197.
50. Li H và cộng sự. Định dạng bản đồ/căn chỉnh trình tự và các công cụ SAM. Tin sinh học. 2009;25(16):2078–2079.
51. Tưởng C, và cộng sự. SpeedSeq: phân tích và giải thích bộ gen cá nhân cực nhanh. Phương pháp Nat. 2015;12(10):966–968.
52. Cingolani P, và cộng sự. Chương trình chú thích và dự đoán ảnh hưởng của đa hình nucleotide đơn SnpEff:SNPs trong bộ gen của chủng Drosophila melanogaster w1118; iso-2; iso-3. Bay (Austin). 2012;6(2):80–92.
53. Haga-Friedman A, và cộng sự. Sự kết hợp của các đột biến kỵ nước xuyên màng trong TCR giúp tăng cường biểu hiện bề mặt và ái lực chức năng của tế bào T. J Miễn dịch. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ, và cộng sự. Tăng cường hoạt động chống ung thư của các tế bào T được thiết kế để biểu hiện các thụ thể tế bào T bằng liên kết disulfide thứ hai. Ung thư Res. 2007;67(8):3898–3903.
