Sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa hai dòng cao lương hai màu khác nhau trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh
Feb 28, 2023
Trừu tượng:
Mô hình phân tử liên quan đến vi khuẩn (MAMPs) kích hoạt khả năng miễn dịch (MTI) là thành phần chính của phản ứng miễn dịch bẩm sinh của thực vật đối với sự nhận biết của vi sinh vật. Tuy nhiên, hầu hết kiến thức hiện tại của chúng ta về MTI đến từ các cây mẫu (tức là Arabidopsis thaliana) với tương đối ít công việc được thực hiện bằng cây trồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu sự bùng nổ oxy hóa do MAMP kích hoạt (ROS) và phản ứng phiên mã ở hai kiểu gen nhị sắc của lúa miến, BTx623 và SC155-14E. SC155-14E là dòng kháng bệnh thán thư cao và dòng BTx623 dễ nhiễm bệnh thán thư. Kết quả của chúng tôi cho thấy một sự thay đổi rõ ràng trong biểu hiện gen và ROS để đáp ứng với sự kích thích của Flagellin (flg22) hoặc chitin giữa hai dòng. Mặc dù phản ứng phiên mã đối với mỗi MAMP và trong mỗi dòng là duy nhất nhưng có một mức độ chồng lấp đáng kể và chúng tôi có thể xác định một bộ gen cốt lõi liên quan đến phản ứng phiên mã MAMP của lúa miến. Thuật ngữ GO và phân tích làm giàu con đường KEGG đã phát hiện ra nhiều DEG liên quan đến khả năng miễn dịch và kháng mầm bệnh hơn trong các mẫu SC155-14E được xử lý bằng MAMP so với trong BTx623 với cùng cách xử lý. Các kết quả cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu trong tương lai để điều tra các con đường miễn dịch bẩm sinh ở lúa miến, bao gồm cả những nỗ lực tăng cường khả năng kháng bệnh.
Nhấn vào đây để mua mộtSản phẩm cải thiện khả năng miễn dịch
For more information:1950477648nn@gmail.com
từ khóa:
cao lương nhị sắc; ROS; miễn dịch bẩm sinh; MAMP; ARN-seq; biểu hiện gen
1. Giới thiệu
Thực vật tự nhiên phải đối mặt với nhiều loại áp lực, bao gồm nhiều mầm bệnh do vi khuẩn, nấm và vi rút [1]. Thực vật tự bảo vệ mình khỏi mầm bệnh bằng cách sử dụng các cấu trúc và hóa chất được hình thành sẵn, và các phản ứng do nhiễm trùng gây ra của hệ thống miễn dịch. Hệ thống miễn dịch thực vật sử dụng một hệ thống nhận thức hai tầng với hai lớp thụ thể được kết nối với nhau.
Tầng đầu tiên được kích hoạt bởi các thụ thể nhận dạng mẫu cục bộ hóa bề mặt (PRR), các thụ thể này cảm nhận các phân tử bên ngoài tế bào bằng cách nhận biết mầm bệnh xâm nhập thông qua việc phát hiện các họa tiết cấu trúc được bảo tồn, được gọi là Các mẫu phân tử liên quan đến vi khuẩn (MAMPs), kích hoạt mức độ trung bình, nhưng rộng rãi, phản ứng phòng thủ [2] . Flagellin, chitin, lipopolysaccharides, peptidoglycans (PGNs) và yếu tố kéo dài Tu là những ví dụ về MAMPs đã được nghiên cứu kỹ lưỡng [3–5]. Phản ứng phòng thủ này được gọi là miễn dịch MAMPtrigged (MTI) [6]. Tầng bảo vệ thứ hai được gọi là Miễn dịch Kích hoạt Hiệu ứng (ETI) xảy ra để đáp ứng với các protein hiệu ứng có nguồn gốc từ mầm bệnh cụ thể được thực vật nhận ra thông qua hoạt động của các protein kháng thuốc, dẫn đến phản ứng miễn dịch mạnh nhưng đặc hiệu cao. ETI thường có thể được nhận ra bằng cách gây ra hiện tượng chết tế bào cục bộ được gọi là phản ứng quá mẫn cảm (HR) [7]. Cả hệ thống MTI và ETI đều cảm nhận được mầm bệnh và phản ứng bằng cách kích hoạt hệ thống phòng thủ chống vi trùng trong tế bào bị nhiễm bệnh và các tế bào lân cận [3,8]. Thực vật cũng mang các thụ thể miễn dịch nhận biết các tác nhân gây bệnh có tính biến đổi cao, chúng bao gồm loại protein NBS-LRR [9].
Ngoài ra, tính kháng mắc phải toàn thân (SAR) là phản ứng kháng "toàn bộ cây trồng" xảy ra sau khi tiếp xúc cục bộ trước đó với mầm bệnh. SAR có liên quan đến việc tạo ra nhiều loại gen (gen liên quan đến sinh bệnh học) và việc kích hoạt SAR đòi hỏi phải tích lũy axit salicylic nội sinh (SA) [10].
Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện bằng cách sử dụng Arabidopsis đã chỉ ra rằng MTI có thể gây ra nhiều phản ứng khác nhau bao gồm những thay đổi trong quá trình sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS), sản xuất các loại nitơ phản ứng như oxit nitric (NO), lắng đọng callose, nồng độ canxi nội bào, dòng ion trong huyết tương màng tế bào, cảm ứng hoặc ức chế sự biểu hiện của một số gen liên quan đến bảo vệ thực vật, sự thay đổi trong thành tế bào thực vật, cảm ứng các hợp chất chống vi trùng và tổng hợp các protein liên quan đến sinh bệnh học (PR) [3,11].
Mặc dù một vài trong số các phản ứng MTI này có thể được coi là phản ứng chung của thực vật, nhưng mức độ của chúng có thể cụ thể theo loài thực vật và thậm chí cụ thể cho giống cây trồng [12–17]. Các phương pháp đã được phát triển để định lượng phản ứng MTI của thực vật. Các phương pháp này bao gồm đo lường quá trình sản xuất ROS hoặc NO, quá trình phosphoryl hóa protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, biểu hiện gen MAMP cụ thể, ức chế tăng trưởng cây con, lignin và phenol gắn trên thành tế bào, và khả năng kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh do MAMP gây ra [18–20].
Cao lương bicolor (L.) Moench là cây ngũ cốc quan trọng, toàn cầu đã thích nghi với nhiều môi trường sống và được lai tạo cho các mục đích đa dạng [21]. Việc trồng lúa miến dự kiến sẽ tăng đáng kể trên toàn thế giới với tư cách là một trong những cây trồng chính để sản xuất lương thực và sinh khối [22].
Khi tập quán và diện tích trồng lúa miến tăng lên, áp lực dịch bệnh sẽ tăng lên là điều khó tránh khỏi. Cao lương được phân biệt với các loại ngũ cốc khác bởi phạm vi bệnh tật rộng bất thường, đây là một trong những hạn chế quan trọng nhất đối với sản xuất của nó. Trên toàn cầu, các bệnh nấm phổ biến là bệnh hại lúa miến nghiêm trọng nhất dẫn đến thiệt hại lớn về năng suất, cả về số lượng và chất lượng của hạt [23]. Bệnh thán thư là một trong những bệnh nấm nghiêm trọng nhất ảnh hưởng đến năng suất hạt lúa miến và sản xuất sinh khối. Thiệt hại về năng suất do mầm bệnh này có thể từ 50 đến 70 phần trăm ở các giống mẫn cảm [24,25]. Thực vật đã phát triển các chiến lược phòng thủ khác nhau để chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh. Trong lúa miến, những chiến lược này bao gồm kích hoạt protein PR [26], tích lũy hydro peroxide [27] và sinh tổng hợp flavonoid phytoalexin [28]. Các phương pháp tiếp cận khác nhau đã được sử dụng để nghiên cứu các phản ứng kháng thuốc của lúa miến, xác định các hợp chất bảo vệ và xác định các rào cản vật lý chống lại bệnh thán thư (xem tài liệu tham khảo [29,30] để xem xét). Các nghiên cứu biểu hiện gen đã được sử dụng rộng rãi để xác định các gen ứng cử viên kháng bệnh ở thực vật dựa trên sự biểu hiện khác biệt giữa các giống kháng và mẫn cảm hoặc các cây không được cấy và được cấy mầm bệnh (ví dụ: tài liệu tham khảo [31–37]). Wang và cộng sự, [37] đã thực hiện phân tích phiên mã để nghiên cứu phản ứng của giống lúa miến BTx623 đối với C. subline-ola. Họ báo cáo rằng các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa phenylpropanoid và quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp được xác định là biểu hiện khác biệt khi phản ứng với sự lây nhiễm mầm bệnh so với các cây đối chứng không được cấy.
Tuy nhiên, những thí nghiệm này được tiến hành với cây con của giống BTx623 mẫn cảm. Các nghiên cứu phiên mã bổ sung để so sánh phản ứng biểu hiện gen với mầm bệnh ở các giống lúa miến mẫn cảm và kháng bệnh sẽ có giá trị. Do đó, điều quan trọng là phải hiểu cấu trúc di truyền kiểm soát khả năng kháng bệnh cơ bản của lúa miến và mối liên hệ của nó với khả năng kháng bệnh định lượng.
Là một bước đầu tiên theo hướng này, gần đây chúng tôi đã sàng lọc một tập hợp các nguồn gen lúa miến đa dạng để tìm sự biến đổi trong phản ứng của chúng đối với sự tạo ra flg22 và chitin, cũng như khả năng kháng bệnh nấm [38]. Trong trường hợp này, MTI đã được định lượng bằng cách đo sản xuất ROS khi khơi gợi MAMP. Trong số các kết quả của nghiên cứu trước đó, là việc xác định các kiểu gen lúa miến cho thấy phản ứng mạnh hoặc yếu đối với việc khơi gợi MAMP.
Giải trình tự thông lượng cao thế hệ tiếp theo và nghiên cứu các bộ phiên mã có thể giúp làm rõ các phản ứng nhiễm nấm ở thực vật và tăng hiểu biết về phản ứng của vật chủ. Các phân tích phiên mã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phản ứng của thực vật đối với nhiễm nấm ở nhiều loài thực vật bao gồm cả cây ngũ cốc (ví dụ: tài liệu tham khảo [31–37]).
Tuy nhiên, dữ liệu được công bố về phân tích phiên mã so sánh của cây ngũ cốc chủ yếu tập trung vào phản ứng với các mầm bệnh khác nhau. Trong lúa miến, một số ấn phẩm tập trung vào so sánh phiên mã của cây được xử lý bằng các mầm bệnh khác nhau, bao gồm cả bệnh thán thư [35,37]. Một số ấn phẩm trước đây cho rằng không có mối tương quan đáng kể giữa phản ứng với MAMPs và bệnh nấm. Ví dụ, Zhang et al. [17] đã báo cáo mối tương quan chặt chẽ giữa phản ứng với hai MAMPs flg22 và chitin trong quần thể lập bản đồ ngô nhưng không có sự tương ứng với phản ứng với bệnh nấm. Kimball và cộng sự. [38] cũng báo cáo mối tương quan thấp giữa flg22-điểm số phản ứng ROS do flg22-gây ra và điểm số kháng bệnh đốm lá mục tiêu trong hai quần thể lúa miến RIL bao gồm quần thể BTx623/SC155-14E. Do đó, với số lượng dữ liệu ít ỏi, chúng tôi cảm thấy điều quan trọng là phải sao chép hồ sơ phản ứng của lúa miến đối với các phương pháp điều trị MAMP.
Trong báo cáo hiện tại này, chúng tôi mở rộng phân tích trước đó của mình bằng cách đo lường phản ứng phiên mã toàn cầu đối với việc khơi gợi MAMP. Chúng tôi đã sử dụng phân tích giải trình tự RNA dựa trên Illumina để khảo sát các thay đổi phiên mã để đáp ứng với cách xử lý flg22 hoặc chitin trong kiểu gen lúa miến BTx623 và SC155-14E, mà trước đây chúng tôi đã mô tả tương ứng là phản ứng MTI yếu và mạnh tương ứng. BTx623 là dòng tham chiếu bộ gen nhị sắc của lúa miến [22] và SC155-14E là dòng thể hiện khả năng kháng bệnh thán thư cao [39]. Patil et al. [39] đã báo cáo rằng SC155-14E thể hiện mức độ kháng bệnh ổn định cao (gần như không có bệnh) đối với bệnh thán thư trong tất cả các môi trường được thử nghiệm trong khi BTx623 dễ bị bệnh nấm này. Phân tích RNA-seq của chúng tôi đã xác định lần lượt 5252 và 8085 Gen biểu hiện khác nhau (DEG) trong BTx623 được xử lý bằng flg22 và chitin, cũng như 3849 và 5786 DEG trong flg22 và SC{19}E được xử lý bằng chitin, so với các điều khiển mô phỏng không được xử lý của hai kiểu gen này.
Hơn nữa, so sánh các DEG được chọn bằng cách sử dụng hai đường ống tin sinh học khác nhau cho thấy kết quả rất giống nhau. Hồ sơ biểu hiện của các gen được biểu hiện khác nhau, phân tích làm giàu bản thể gen (GO) và phân tích làm giàu con đường KEGG cho thấy sự khác biệt rõ ràng dựa trên kiểu gen trong biểu hiện gen liên quan đến MTI. Thuật ngữ GO và kết quả làm giàu con đường KEGG cho thấy nhiều DEG liên quan đến khả năng miễn dịch và kháng mầm bệnh hơn (gen PR, gen phản ứng với chitin, gen phản ứng với axit salicylic, gen phản ứng với căng thẳng, v.v.) được trình bày trong SC{{4} được xử lý bằng MAMP }Các mẫu E liên quan đến BTx623 được xử lý bằng MAMP. Các kết quả cung cấp cơ sở để xác định các thành phần khác nhau của phản hồi MTI lúa miến.
2. Kết quả và thảo luận
2.1. Sự thay đổi của bùng nổ oxy hóa trong các loại lá cao lương khác nhau
Phân tích trước đây của chúng tôi về phản ứng MTI của các kiểu gen lúa miến khác nhau cho thấy sự khác biệt đáng kể trong vụ nổ oxy hóa do MAMP kích hoạt giữa các kiểu gen BTx623 và SC155-14E [38]. Hơn nữa, SC155-14E là dòng có khả năng kháng bệnh thán thư cao, trong khi dòng BTx623 lại mẫn cảm với bệnh thán thư [39]. Chính vì những lý do này, hai kiểu gen này đã được chọn để so sánh bằng cách sử dụng RNA-seq.
Trong khi tiến hành các phép đo ROS trước đó, chúng tôi đã tìm thấy sự khác biệt đáng kể ngay cả trong cùng một nhà máy, điều này khiến chúng tôi phải điều tra nguồn gốc của sự thay đổi này cẩn thận hơn. Cụ thể, chúng tôi đã thử nghiệm quá trình sản xuất ROS bằng cách sử dụng ba bộ lá, đi từ dưới lên trên của cây BTx623 và SC155-14E 15 ngày tuổi. Các lá được đánh dấu là #1, #2 và #3, từ dưới lên trên như trong Hình 1A. Kết quả xét nghiệm ROS (Hình 1B) cho thấy: (1) mức sản xuất ROS thấp hơn ở các lá già (lá #1), trong khi mức sản xuất ROS cao nhất để đáp ứng với flg22 hoặc chitin là từ các lá non nhất ( lá số 3). (2) Cả hai lá non nhất của BTx623 2và không được xử lý MAMP (lá #2) đều tạo ra mức sản xuất ROS tương đối thấp.
Ngược lại, các lá non thứ 2 của SC155-14E được xử lý MAMP tạo ra mức sản xuất ROS cao hơn đáng kể (ở mức 0.01) so với mẫu giả không được xử lý, cũng như mẫu BTx{ được xử lý hoặc giả {5}}lá non nhất. (3) Sự bùng nổ oxy hóa được kích hoạt bởi các ứng dụng của flg22 hoặc chitin được phát hiện trong các đĩa lá từ các lá non nhất (lá #3) của cả hai kiểu gen, mặc dù, như đã quan sát trước đó, mức độ sản xuất ROS cao hơn ở SC được xử lý bằng MAMP 155-14E so với BTx623. Tiến trình thời gian của flg22-được kích hoạt và sản xuất ROS được kích hoạt bởi chitin trong SC155-14E lá non thứ 2 cho thấy rằng quá trình sản xuất ROS được kích hoạt bởi chitin xảy ra sớm hơn so với quá trình sản xuất ROS được kích hoạt của flg22- (Hình 1C ). Kết quả tương tự đã được báo cáo bởi Zhang et al. [17] nơi quá trình sản xuất ROS do chitin kích hoạt xuất hiện sớm hơn flg22-đã kích hoạt quá trình sản xuất ROS trong flg22 và cây ngô được xử lý bằng chitin. Đã có báo cáo [40] rằng việc sản xuất ROS để đáp ứng với flg22 cho thấy sản lượng ROS cao nhất trong khoảng 12 phút và thấp nhất sau 30 phút ở cây Arabidopsis. Kết quả xét nghiệm ROS của chúng tôi trong lúa miến cho thấy sản lượng ROS cao nhất vào khoảng 13 phút và thấp nhất sau 30 phút sau khi xử lý flg22, rất giống với kết quả ở cây Arabidopsis. Vì mục tiêu của chúng tôi là tìm ra các điều kiện tối ưu để so sánh phản ứng MTI của hai kiểu gen, nên chúng tôi đã chọn lá non thứ 2 của 15-cây một ngày tuổi để chiết xuất RNA và phân tích phiên mã tiếp theo. Sự biến đổi giữa các lá của cây lúa miến đơn lẻ là một lời nhắc nhở rằng kết quả có thể khác nhau giữa các thí nghiệm tùy thuộc vào nguồn, thời gian và các đặc điểm khác của một thí nghiệm nhất định và do đó, các thông số thí nghiệm cần được kiểm soát cẩn thận.
Sự bùng nổ oxy hóa, quá trình tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) nhanh chóng, thoáng qua, là một trong những khía cạnh sớm nhất có thể quan sát được của phản ứng phòng vệ của thực vật [41]. Xem xét rằng sự bùng nổ ROS là một phản ứng ngay lập tức, thì một phản ứng phiên mã muộn hơn một chút của các gen liên quan đến MTI được mong đợi. Chúng tôi đã thu hoạch các mẫu 60 phút sau khi xử lý MAMPs để phân tích RNA-Seq.
2.2. Các gen được biểu hiện khác nhau (DEG) của BTx623 và SC155-14E để đáp ứng với các phương pháp điều trị MAMP
Để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen mã hóa protein hai màu lúa miến được chú thích cho từng mẫu, số lần đọc sạch RNA-seq được ánh xạ tới từng gen đã được tính toán và sau đó được chuẩn hóa thành FPKM (các đoạn trên mô hình exon kb trên một triệu đoạn được ánh xạ). Sự thay đổi biểu hiện của từng gen trong các đĩa lá được xử lý bằng MAMP của BTx623 và SC155-14E so với các phương pháp xử lý giả (nước) đã được nghiên cứu. Tổng số gen biểu hiện là tương tự nhau trong tất cả các phương pháp xử lý của cả hai kiểu gen: 27.171, 27.283, 27.161, 27.182, 27.512 và 27.175 gen biểu hiện trong mô phỏng BTx623, flg22-BTx623 được xử lý, BTx623 được xử lý bằng chitin, mô phỏng SC{ {22}}E, flg22-được xử lý lần lượt là SC155-14E và SC155-14E được xử lý bằng chitin. Chúng tôi đã sử dụng bộ gen tham chiếu BTx623 để đọc ánh xạ ở cả hai dòng do không có tham chiếu cụ thể cho SC155-14E. Số lượng gen biểu hiện được lấy từ BTx623 và SC{{30}}E với tất cả các điều kiện ở trên cho thấy rằng cả hai dòng đều có chung số lượng gen biểu hiện. Tỷ lệ ánh xạ đọc tổng thể của các mẫu SC155- 14E giả (3 lần lặp lại), SC155-14E được xử lý bằng flg22 (3 lần lặp lại), SC155-14E được xử lý bằng chitin (3 lần lặp lại) , BTx623 giả (3 lần nhắc lại), BTx623 xử lý bằng flg22 (3 lần lặp lại), BTx623 xử lý bằng chitin (3 lần lặp lại) là: 93,6% , 93,9% , 93,9% , 93,8% , 93,9% , 93,6% , 93,5% , 93,5% , 93,1 phần trăm , 96,9 phần trăm , 97.0 phần trăm , 97.0 phần trăm , 97,2 phần trăm , 96,8 phần trăm , 97.0 phần trăm , 96,9 phần trăm , 97.0 phần trăm , 97,0 phần trăm tương ứng. Những kết quả này cho thấy rằng các tác động khác nhau của việc xử lý MAMPs đối với bản phiên mã của BTx623 và SC155-14E không phải do sự khác biệt về trình tự bộ gen giữa hai kiểu gen
Biểu đồ PCA biểu hiện gen cung cấp thông tin chi tiết về mối liên hệ giữa các mẫu. Để khám phá sự giống nhau của các mẫu của chúng tôi, chúng tôi đã thực hiện phân tích PCA. Biểu đồ mẫu trên PC1 và PC2 (Hình 2) cho thấy bốn điều kiện thí nghiệm (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitin và SC{ {10}}E_chitin) được phân tách rộng rãi. Ngược lại, ba lần sao chép sinh học của mỗi dòng lúa miến và mỗi phương pháp xử lý MAMP, cũng như phương pháp xử lý giả, lần lượt được nhóm chặt chẽ với nhau, cho thấy khả năng tái tạo tốt giữa các lần sao chép sinh học (Hình 2).
Biểu đồ núi lửa trong Hình 3 cho thấy biểu hiện gen trong hai dòng lúa miến được xử lý bằng flg22 hoặc chitin. Biểu đồ núi lửa là một loại biểu đồ phân tán cho thấy ý nghĩa thống kê (giá trị p) so với mức độ thay đổi (thay đổi lần). Nó cho phép xác định trực quan nhanh chóng các gen có thay đổi lớn cũng có ý nghĩa thống kê. Đây có thể là những gen có ý nghĩa sinh học nhất. Trong Hình 3, các gen có −log10 (giá trị p) bằng hoặc lớn hơn 3 được coi là DEG. Các chấm màu đỏ đại diện cho DEG và các chấm màu đen đại diện cho các không phải DEG. Trong mỗi biểu đồ, các gen có log2 (thay đổi_lần) lớn hơn 0 là các gen điều hòa tăng, ngược lại là các gen điều hòa giảm. Hầu hết các gen được điều chỉnh tăng nằm ở bên phải, các gen được điều hòa giảm nhất ở bên trái và các gen có ý nghĩa thống kê nhất nằm ở phía trên cùng.
Các gen được biểu hiện khác nhau (DEG) đã được chọn từ mỗi phương pháp xử lý tùy theo mức độ biểu hiện quan trọng của chúng (giá trị p 0.001). Cần lưu ý rằng chúng tôi đã sử dụng giá trị p là 0.001 làm ngưỡng chứ không phải FDR (giá trị q) để chọn DEG trong báo cáo này. FDR (giá trị q) cũng có ý nghĩa ở cấp độ này (Bảng S2–S5). Ở giá trị p là 0.001, các FDR là 0,0039, 0,0051, 0,0025 và 0,0035 đối với BTx623 khi xử lý bằng flg22, SC155-14E khi xử lý bằng flg22, BTx623 khi xử lý bằng chitin và SC{{ 26}}E tương ứng với xử lý chitin. Giá trị p và giá trị q của gen BTx623 và SC155-14E trong mọi điều kiện được liệt kê trong Bảng S2–S5. Bằng cách phân tích các kiểu biểu hiện của những gen này trong lá BTx623 và SC155-14E được xử lý MAMP, chúng tôi đã quan sát thấy một số lượng lớn gen (14–30% tổng số gen biểu hiện) thể hiện sự khác biệt lớn sau flg22 hoặc chitin điều trị ở cả hai dòng lúa miến. Tổng số DEG của BTx623 được xử lý bằng chitin (8085) rất gần với số lượng được báo cáo trong một nghiên cứu phiên mã trước đó ở BTx623 bị nhiễm mầm bệnh thán thư C. subline-ola (8078) [37]. Số lượng DEG cao hơn ở lá BTx623 được xử lý bằng flg22 (19 phần trăm ) hoặc chitin (30 phần trăm ) so với SC155-14E (lần lượt là 14 phần trăm và 21 phần trăm ).
Mặc dù số lượng DEG cao hơn trong BTx623 được xử lý bằng MAMP so với SC155-14E trái ngược với phản ứng ROS của hai kiểu gen này, nhưng điều này có lẽ không gây ngạc nhiên vì phản ứng ROS và phản ứng biểu hiện gen đối với xử lý MAMP xảy ra ở thời điểm khác nhau, phần lớn là độc lập và được trung gian bởi các cơ chế khác nhau [42,43]. Thuật ngữ GO và làm giàu con đường KEGG tiết lộ nhiều DEG liên quan đến khả năng miễn dịch và kháng mầm bệnh được trình bày trong các mẫu SC155-14E được xử lý bằng MAMP. Ngoài ra, thực tế là số lượng DEG cao hơn trong các mẫu được xử lý bằng chitin so với các mẫu được xử lý bằng flg22 phù hợp tốt với các thử nghiệm phản ứng ROS (Hình 1B), nơi chúng tôi thấy phản ứng ROS mạnh hơn khi xử lý bằng chitin.
Để tìm hiểu mức độ các gen và quá trình sinh học được chia sẻ giữa các phương pháp xử lý flg22 và chitin trong BTx623 và SC155-14E, chúng tôi đã so sánh DEG của chúng một cách chi tiết hơn. Biểu đồ Venn trong Hình 4A cho thấy sự trùng lặp về DEG trong tổng số, bộ gen điều chỉnh tăng và giảm ở giá trị p là 0.001. Trong tổng số 10.535 DEG, một bộ cốt lõi gồm 2272 gen đã phản ứng với cả cách xử lý flg22 và chitin ở cả hai dòng lúa miến. Tương tự như vậy, trong tổng số 5410 gen điều chỉnh tăng, một bộ lõi gồm 1778 gen được điều chỉnh tăng ở cả hai kiểu gen, trong khi, trong tổng số 5125 gen điều hòa giảm, một bộ lõi gồm 474 gen điều hòa giảm ở cả hai kiểu gen. kiểu gen.
Dữ liệu RNA seq trình bày ở đây được phân tích bằng cách sử dụng quy trình tin sinh học với các công cụ Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 và Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) với các tham số mặc định (quy trình số 1). Để xác nhận thêm kết quả xét nghiệm, chúng tôi đã sử dụng một quy trình khác (quy trình số 2) với HiSat2, HTSeq và edgeR để thực hiện phân tích. HiSat2 là bước phát triển tiếp theo của TopHat2. Chúng tôi đã so sánh các DEG của từng điều kiện (nghĩa là hai kiểu gen được xử lý bằng flg22 hoặc chitin, tất cả, các DEG được điều chỉnh tăng hoặc giảm) được chọn bằng cả hai quy trình. Kết quả (Hình 5) cho thấy các số DEG được chọn bằng cách sử dụng cả hai đường ống là rất gần nhau.
Tổng số DEG được chọn với quy trình số 1 so với quy trình số 2 là BTx623_flg22: 5241 so với 5413; SC155-14E_flg22: 3849 so với 3476; BTx623_chitin: 8085 so với 8320; SC155-14E_chitin: 5786 so với 5383. Các DEG được điều chỉnh tăng được chọn với quy trình số 1 so với quy trình số 2 là BTx623_flg22: 3074 so với 3076; SC155-14E_flg22: 2591 so với 2483; BTx623_chitin: 4156 so với 4583; SC155-14E_chitin: 3486 so với 3346. Các DEG được điều chỉnh giảm được chọn với đường ống số 1 so với đường ống số 2 là BTx623_flg22: 2152 so với 2237; SC155-14E_flg22: 1257 so với 993; BTx623_chitin: 3919 so với 3757; SC155-14E_chitin: 2296 so với 2037. Ngoài ra, kết quả trong Hình 5 cũng cho thấy rằng một tỷ lệ cao DEG được chọn bằng cách sử dụng hai đường ống trùng nhau trong mọi điều kiện. Tỷ lệ phần trăm số DEG trùng lặp/số DEG được chọn bằng đường ống số 1 là 79,6 phần trăm và 73,7 phần trăm . 80,8 phần trăm và 74,4 phần trăm tổng số DEG của BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin và SC155-14E{{73} }chitin tương ứng; 83% , 80,6% , 85,3% và 81,1% DEG được điều chỉnh tăng của BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin và SC{{ 88}}E_chitin tương ứng; 75,1% , 59,5% , 75,8% và 67,4% DEG được điều chỉnh giảm của BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin và SC{{ 105}}E_chitin tương ứng. Do đó, những kết quả so sánh này đã chứng minh rằng dữ liệu trình tự RNA được trình bày là chính xác bất kể phương pháp nào trong hai phương pháp được sử dụng để phân tích.
Sơ đồ nhiệt của cấu hình biểu hiện nhóm của DEG của BTx623 và SC155-14E được xử lý bằng flg22 hoặc chitin cho ba lần sao chép sinh học được hiển thị trong Hình 6. Các giá trị biểu hiện gen được chuẩn hóa thành điểm số z. Màu chuyển từ tím sang đỏ khi giá trị tăng lên, cho thấy biểu hiện gen từ thấp đến cao. Bản đồ nhiệt này cho thấy rõ sự điều hòa khác biệt của các gen trong BTx623 và SC155-14E để đáp ứng với flg22 hoặc xử lý chitin. Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy bản đồ nhiệt của ba lần sao chép sinh học trong mỗi điều kiện rất gần nhau, cho thấy khả năng tái tạo tốt giữa các lần sao chép sinh học.
Ngoài ra, các phép so sánh theo cặp (Hình 7A) giữa các DEG được điều chỉnh tăng và giảm từ các phương pháp xử lý flg22 và chitin cho thấy có sự trùng lặp lớn giữa BTx623 và SC155-14E. Trong số 3074 flg22-gen cảm ứng trong BTx623, 83,8 phần trăm cũng được tạo ra trong BTx623 để đáp ứng với xử lý chitin, trong khi 2591 flg22-gen cảm ứng trong SC155-14E, {{ 16}}.6 phần trăm cũng phản ứng với SC155-14E được xử lý bằng chitin. Điều này có lẽ không có gì đáng ngạc nhiên vì các nghiên cứu trước đây về Arabidopsis thaliana đã cho thấy sự chồng chéo đáng kể trong các gen phản ứng với nhiều loại MAMP khác nhau, xác định các con đường MTI chung [44–46].
Hơn nữa, Zhang et al. [17] cũng báo cáo mối tương quan đáng kể giữa phản ứng flg22 và chitin ở ngô. Quan sát thấy ít chồng lấp hơn giữa các đĩa lá BTx623 và SC155-14E được xử lý bằng cùng một MAMP (Hình 7A). 64,3% gen cảm ứng flg22-trong BTx623 được cảm ứng trong flg22-SC155-14E đã xử lý và 68,3% gen cảm ứng chitin trong BTx623 được cảm ứng trong SC155-14 xử lý chitin e. Tương tự, trong số 2152 gen được điều hòa giảm khi xử lý flg22 của BTx623, một tỷ lệ phần trăm cao (75,9 phần trăm ) cũng được điều chỉnh giảm bởi chitin trong BTx623. Trong số 1257 gen được điều hòa giảm bởi flg22 trong SC155-14E, 70,8 phần trăm cũng được điều hòa bởi chitin trong SC155-14E. Tuy nhiên, chỉ có 29% gen bị điều hòa giảm của flg22 trong BTx623 cũng bị điều hòa giảm trong flg22-SC155-14E đã xử lý và 45% gen bị điều hòa giảm chitin trong BTx623 cũng bị điều hòa giảm trong SC155-14E được xử lý bằng chitin (Hình 7A). Do đó, mặc dù có sự hội tụ đáng kể trong các con đường MTI đến flg22 và chitin trong hai kiểu gen được so sánh, nhưng dữ liệu cũng gợi ý về sự phức tạp thú vị về cách hai kiểu gen này phản ứng với các MAMP khác nhau.
2.3. Phân tích làm giàu chức năng gen So sánh phản hồi MTI của BTx623 và SC155-14E
Để xác định các loại gen chức năng được quy định để đáp ứng với flg22 hoặc chitin và phản ứng khác biệt của hai dòng lúa miến được thử nghiệm, chúng tôi đã sử dụng nền tảng PlantRegMap [47,48] để thực hiện Phân tích làm giàu bộ gen dựa trên các DEG được phát hiện trong mô hình sinh học. hạng mục quy trình. Hình 8A và B hiển thị các thuật ngữ GO hàng đầu của các gen được làm giàu theo quy trình sinh học với DEG được điều chỉnh tăng và DEG điều chỉnh giảm từ cả BTx623 và SC155-14E. Danh sách đầy đủ các DEG được cung cấp trong Bảng S6–S13. Nhiều gen trong số này có liên quan đến các quá trình bao gồm phản ứng với stress, phản ứng bảo vệ thực vật, phản ứng với kích thích, phản ứng với kích thích sinh học, phản ứng với vi khuẩn, phản ứng với sinh vật khác, giao tiếp tế bào, quá trình trao đổi chất phốt pho và quá trình phosphoryl hóa protein.
Các kết quả trong Hình 8A và B cho thấy sự khác biệt rõ ràng trong biểu hiện của các gen thường liên quan đến khả năng miễn dịch bẩm sinh giữa hai kiểu gen lúa miến. Trong các thuật ngữ GO phong phú đó, một số DEG duy nhất đã được tìm thấy trong mỗi điều kiện có sự trùng lặp. Ví dụ: phản hồi bảo vệ thuật ngữ GO (GO 0006952): 91 và 84 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm giàu trong BTx623 hoặc SC155-14E được xử lý bằng flg22, tương ứng. Trong các DEG đó, 24 DEG là duy nhất trong BTx623 và 15 DEG chỉ được tìm thấy trong SC155-14E và các DEG khác được trình bày trong cả hai kiểu gen lúa miến. Tương tự, 102 và 93 DEG được điều chỉnh tăng tương ứng được làm giàu trong BTx623 hoặc SC155-14E được xử lý bằng chitin. Trong các DEG đó, 20 DEG là duy nhất trong BTx623 và 14 DEG là duy nhất trong SC155-14E và các DEG khác được trình bày trong cả hai kiểu gen lúa miến.
Trong thuật ngữ GO về "phản ứng với chitin (GO: 0010200)", chúng tôi đã quan sát thấy 18 DEG được điều chỉnh tăng trong tổng số 779 gen trong danh mục này được làm giàu trong các mẫu SC155-14E được xử lý bằng chitin (Hình 8 ), trong khi không có gen nào được làm giàu trong các mẫu BTx623 được xử lý bằng chitin. Ngoài ra, 16 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm giàu trong các mẫu SC155-14E được xử lý bằng flg22-và 12 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm giàu trong các mẫu BTx623 được xử lý bằng flg22-(Hình 8). So sánh các danh sách DEG của thuật ngữ GO "phản ứng với chitin" trong flg22 và BTX623 được xử lý bằng chitin và SC155-14E (Bảng S9) cho thấy rằng các DEG được làm giàu trong flg22 hoặc SC được xử lý bằng chitin155- 14 E giống nhau ngoại trừ chitin tạo ra hai DEG nhiều hơn flg22. Ngược lại, tất cả 12 DEG được làm giàu trong BTX623 được xử lý bằng flg22-khác với DEG do MAMP tạo ra trong SC155-14E. Các DEG do MAMPs đó có thể góp phần vào phản ứng kháng bệnh thán thư trong SC155-14E vì chitin là một phân tử MAMP điển hình từ thành tế bào nấm tạo ra các phản ứng miễn dịch của thực vật. Stringlis và cộng sự. [49] cũng báo cáo một tập hợp các DEG được điều chỉnh tăng đã được làm giàu theo thuật ngữ GO về "phản ứng với chitin" từ chitin, flg22, và một loại vi khuẩn rhizobacteria có lợi cho cây trồng Pseudomonas simiae WCS417 đã xử lý cây Arabidopsis. Matic và cộng sự. [33] đã báo cáo rằng 21 DEG đã được làm giàu trong thuật ngữ GO về "phản ứng với chitin" từ phân tích RNA-seq của lá lúa của một giống kháng bệnh nhưng không phải từ một giống mẫn cảm sau khi nhiễm mầm bệnh nấm Fusarium fujikuroi.
Các gen PR (Pathogen-liên quan) tham gia vào phản ứng miễn dịch của thực vật [50] và có hoạt tính kháng nấm đối với nhiều loại nấm gây bệnh thực vật [51]. Protein PR-10 là các protein nội bào nhỏ, chủ yếu có tính axit, có đặc tính kháng nấm có liên quan đến các phản ứng phòng vệ ở các loài thực vật bao gồm cả lúa miến [52]. Các thành viên họ gen PR-10 đã được tạo ra bởi sự tấn công của mầm bệnh ở nhiều loài thực vật [53]. Trong lúa miến, Lo et al. [26] đã báo cáo rằng biểu hiện PR-10 đã được tạo ra như là một phần của quá trình bảo vệ tích cực của cây lúa miến chống lại mầm bệnh nấm trên lá C. heterostrophus và C. sublineolum. Katie và cộng sự. [54] đã báo cáo rằng một số giống lúa miến cho thấy sự cảm ứng đáng kể về lượng PR-10 tương đối được chuẩn hóa sau khi cấy bào tử nấm của C. lunata và F. capsicum trong các thử nghiệm trên đồng ruộng. Trong điều kiện nhà kính, các đám mây của cây được cấy cho thấy sự cảm ứng của PR-10 mRNA, và phản ứng lớn hơn ở hai giống kháng được thử nghiệm so với hai giống mẫn cảm.
Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng trong số các DEG được xác định, bốn gen PR-10 đã được tìm thấy (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). Trong SC155-14E, tất cả bốn PR-10 DEG đều được điều chỉnh tăng bằng cách xử lý bằng flg22 hoặc chitin, ngược lại, trong BTx623, SORBI_3001G401000 không được tìm thấy trong DEG và SORBI{{15} }G401300 (được điều chỉnh tăng) chỉ xuất hiện trong BTx623 với cách xử lý bằng chitin chứ không phải với cách xử lý bằng flg22. Điều này cho thấy rằng sự biểu hiện của gen PR có thể được sử dụng để đáp ứng với mức sản phẩm ROS cao hơn sau khi xử lý MAMPs và kháng lại bệnh thán thư ở SC155-14E.
Axit salicylic (SA) là một tín hiệu miễn dịch thực vật cần thiết cho cả phản ứng phòng vệ tại chỗ và sức đề kháng toàn thân. Nó đóng một vai trò quan trọng trong sức đề kháng và bảo vệ thực vật chống lại sự tấn công của mầm bệnh [55]. Trong lúa miến, Tugizimana et al. [56] đã báo cáo những thay đổi định lượng về mức độ axit jasmonic, liên hợp axit salicylic và axit abscisic trong lúa miến bị nhiễm C. subline-ola. C. subline-ola là tác nhân gây bệnh thán thư. Các kiểu gen lúa miến có hàm lượng axit amin tăng cường (tryptophan và tyrosine), axit jasmonic và liên hợp salicylic, và zeatin có khả năng kháng bệnh thán thư cao hơn. Trong nghiên cứu này, thuật ngữ GO 'phản ứng với axit salicylic' (GO: 0009751) bao gồm 19 DEG được điều chỉnh tăng chỉ được làm giàu đặc biệt trong SC155-14E được xử lý bằng chitin (Bảng S9). Do đó, lộ trình truyền tín hiệu salicylic có thể đóng vai trò quan trọng để đáp ứng mức sản xuất ROS cao hơn sau khi xử lý MAMP và kháng lại bệnh thán thư ở SC155-14E.
Hơn nữa, 169 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm phong phú trong phản ứng thuật ngữ GO đối với căng thẳng chỉ trong SC155-14E được xử lý bằng chitin (Bảng S9). Các thuật ngữ GO khác chỉ có trong SC155-14E được xử lý bằng MAMP, nhưng không có trong BTx623 với cùng cách xử lý là các quá trình trao đổi chất thứ cấp (GO:0019748), quá trình sinh tổng hợp phosphatidylcholine (GO:0006656) và quá trình sinh tổng hợp lipid ( ĐI: 0008610).
Hơn nữa, 169 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm phong phú trong phản ứng thuật ngữ GO đối với căng thẳng chỉ trong SC155-14E được xử lý bằng chitin (Bảng S9). Các thuật ngữ GO khác chỉ có trong SC155-14E được xử lý bằng MAMP, nhưng không có trong BTx623 với cùng cách xử lý là các quá trình trao đổi chất thứ cấp (GO:0019748), quá trình sinh tổng hợp phosphatidylcholine (GO:0006656) và quá trình sinh tổng hợp lipid ( ĐI: 0008610).
Chúng tôi cũng đã kiểm tra thành phần của các gen được đồng quy định giữa hai kiểu gen sau khi xử lý bằng flg22 hoặc chitin cũng như các bộ DEG cốt lõi trong tất cả các phương pháp điều trị và hai kiểu gen bằng phân tích làm giàu GO (Hình 4B và 7B). Danh sách đầy đủ các DEG được cung cấp trong Bảng S14 và S15. Hình 4B cho thấy các thuật ngữ GO phong phú của các bộ cốt lõi trong tổng số DEG được điều chỉnh tăng và giảm trong BTx623 và SC155-14E với tất cả các phương pháp xử lý. Các thuật ngữ GO liên quan đến phản ứng MAMPs và khả năng bảo vệ thực vật (ví dụ: liên kết chitin, phản ứng bảo vệ, hoạt tính protein kinase, sự phosphoryl hóa protein, hoạt tính serine/threonine kinase của protein) được làm phong phú đáng kể trong các DEG được điều chỉnh tăng trong khi thuật ngữ GO của quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp, liên kết ion sắt, hoạt động oxyoreductase chỉ được làm giàu trong các DEG được điều chỉnh xuống. Kết quả này tương tự với kết quả ở cây Arabidopsis trong đó các thuật ngữ GO liên quan đến phản ứng với elicitor (peptit flg22 từ P. simile WCS417 và P. aeruginosa PAO1, chitin và tế bào vi khuẩn của P. simile WCS417) được làm giàu đáng kể nhất trong quy định tăng bộ DEG cốt lõi [49].
Hình 7B cho thấy các thuật ngữ GO được làm giàu đáng kể của các bộ DEG được đồng điều chỉnh (nghĩa là điều chỉnh tăng hoặc giảm ở cả hai kiểu gen) giữa BTx623 và SC155-14E sau khi xử lý bằng flg22 hoặc chitin. Kết quả cho thấy rằng các thuật ngữ GO liên quan đến phản ứng MAMPs và bảo vệ thực vật (ví dụ: phản ứng bảo vệ, hoạt động protein kinase, sự phosphoryl hóa protein, hoạt động serine/threonine kinase của protein) chỉ được làm giàu trong flg22 hoặc các DEG được điều chỉnh tăng chitin ở cả hai kiểu gen trong khi các thuật ngữ GO của quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp, liên kết heme, liên kết ion sắt, hoạt tính oxyoreductase của một nguyên tử oxy và quá trình sinh tổng hợp phosphatidylcholine chỉ được làm giàu trong các bộ DEG được điều chỉnh xuống.
2.4. Phân tích làm giàu lộ trình KEGG về phản hồi MTI của BTx623 và SC155-14E
Hình 9 cho thấy phân tích làm giàu lộ trình KEGG của các DEG được điều chỉnh tăng có trong các mẫu BTx623 và SC155-14E được xử lý MAMP bằng công cụ trực tuyến DAVID [57]. Danh sách đầy đủ các DEG được cung cấp trong Bảng S16–S20. Các kết quả xác định các con đường KEGG hàng đầu cụ thể được làm phong phú do kích hoạt MTI trong hai kiểu gen lúa miến. Trong "tương tác giữa mầm bệnh và thực vật" của lộ trình KEGG, chúng tôi đã quan sát thấy rằng 24 DEG được điều chỉnh tăng đã được làm giàu trong các mẫu SC155-14E được xử lý bằng chitin, trong khi không có DEG nào được làm giàu trong các mẫu BTx623 được xử lý bằng chitin. Phản ứng chitin mạnh hơn của kiểu gen SC155-14E tương quan với khả năng kháng bệnh thán thư bệnh nấm cao hơn của kiểu gen này [39]. Ngoài ra, quá trình làm giàu con đường KEGG cho thấy 28 gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp phenylpropanoid hạn trong SC155-14E được xử lý bằng flg22. Con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid bắt đầu với phenylalanine có thể được chuyển đổi thành các hợp chất thơm như flavonoid, benzenoid, coumarin, hydroxycinnamate và lignin [58,59]. Nhiều phenylpropanoid và flavonoid tham gia vào phản ứng kháng bệnh [28,60]. Sản xuất phytoalexin là một phản ứng bảo vệ chính chống lại mầm bệnh thán thư C. subline-ola [28] trong lúa miến. 3- deoxy anthocyanidin là một nhóm flavonoid bất thường được công nhận là phytoalexin trong lúa miến. Phytoalexin là các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng khuẩn được tạo ra sau khi nhiễm mầm bệnh [61]. Vương và cộng sự. [37] cũng phát hiện ra rằng quá trình sinh tổng hợp phenylpropanoid theo thuật ngữ KEGG đã được làm giàu đáng kể trong DEG của các cây bị nhiễm C. subline-ola trong nghiên cứu phiên mã của họ về lúa miến. Chúng ta nên lưu ý rằng kết quả làm giàu con đường KEGG (Hình 9) cũng cho thấy phản ứng cao hơn của BTx623 sau khi xử lý MAMPs trong một số con đường có thể đóng vai trò trong tương tác mầm bệnh thực vật (ví dụ: trong con đường sinh tổng hợp phenylalanine và tryptophan, sinh tổng hợp kháng sinh).
Hơn nữa, kết quả phân tích làm giàu con đường KEGG của các DEG được điều chỉnh giảm cho thấy mười DEG được điều chỉnh giảm được chú thích là 'protein ăng-ten quang hợp' và 84 DEG được chú thích khi tham gia vào 'quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp' được làm giàu trong flg22 được xử lý BTx623. Tuy nhiên, các nghiên cứu biểu hiện gen như vậy có thể xác định các gen biểu hiện khác nhau để đáp ứng với điều trị MAMPs hoặc nhiễm mầm bệnh, nhưng không nhất thiết phải chứng minh rằng các gen này rất quan trọng để kháng lại một mầm bệnh cụ thể. Do đó, cần nghiên cứu thêm để hiểu mối quan hệ nhân quả giữa tính kháng nấm và việc kích hoạt các con đường KEGG đó ở cả hai kiểu gen, như được tiết lộ bởi phân tích RNA-Seq.
Chúng tôi cũng đã thực hiện phân tích làm giàu con đường KEGG cho các bộ DEG cốt lõi trong mọi điều kiện (Hình 4) cũng như các DEG được đồng quy định giữa hai kiểu gen sau khi xử lý bằng flg22 hoặc chitin (Hình 7C). Kết quả cho thấy rằng sáu con đường quan trọng, bao gồm cả con đường tương tác mầm bệnh thực vật, chỉ được làm phong phú trong các bộ DEG cốt lõi được điều chỉnh tăng chứ không phải trong các bộ DEG cốt lõi được điều chỉnh giảm. Tương tự như vậy, bảy và ba con đường, bao gồm cả con đường tương tác mầm bệnh thực vật, đã được làm phong phú đáng kể trong các DEG được điều chỉnh tăng chitin và các DEG được điều chỉnh tăng flg22 trong BTx623 và SC155-14E, tương ứng. Ngược lại, chỉ có quá trình sinh học ribosome trong con đường của sinh vật nhân chuẩn mới được làm giàu trong các DEG được điều hòa xuống chitin ở cả hai kiểu gen.
2.5. Xác thực dữ liệu RNA-Seq bằng cách sử dụng RT-PCR định lượng của các gen chọn lọc
Để xác nhận dữ liệu cấu hình biểu hiện gen thu được bằng RNA-seq, chúng tôi đã thực hiện phân tích qRT-PCR để đánh giá biểu hiện của chín gen ứng cử viên được chọn. Chín gen đó đã được chọn dựa trên biểu hiện được quan sát bởi RNA-seq theo ba loại: (a) được biểu hiện tương tự trong BTx623 và SC155-14E với xử lý flg22 hoặc chitin; (b) chỉ được biểu thị trong các MAMP được xử lý SC155-14E nhưng với biểu hiện cực thấp trong BTx623 được xử lý và (c) được biểu thị cao hơn gấp 2–21-trong các MAMP được xử lý SC155-14E so với BTx623 . Kết quả phân tích qRT-PCR (Bảng 1) cho thấy sự đồng thuận hoàn toàn với các mức biểu hiện được xác định bằng phân tích RNA-seq cho từng gen trong số chín gen được đánh giá. Những kết quả này giúp chúng tôi tin tưởng rằng các phép đo do RNA-seq thực hiện phản ánh phản ứng phiên mã của các dòng lúa miến đối với xử lý MAMP
2.6. kết luận
Trong nghiên cứu này, trước tiên chúng tôi đã tìm thấy các điều kiện tối ưu để so sánh phản ứng MTI của hai kiểu gen bằng cách thử nghiệm quá trình sản xuất ROS bằng cách sử dụng ba bộ lá và chọn lá non thứ hai của cây 15 ngày tuổi để chiết xuất RNA và phân tích phiên mã tiếp theo. Quá trình sản xuất ROS do flg22-kích hoạt và chitin kích hoạt theo thời gian trong dòng lúa miến SC155-14E (Hình 1C) cho thấy rằng quá trình sản xuất ROS do chitin kích hoạt xảy ra sớm hơn so với quá trình sản xuất do xử lý flg22 kích hoạt. Chúng tôi đã thu được hồ sơ biểu hiện của kiểu gen lúa miến hai màu kháng bệnh thán thư SC155-14E có phản ứng cao với xử lý MAMPs đối với sản xuất ROS và kiểu gen BTx623 mẫn cảm với phản ứng thấp đối với sản phẩm ROS đối với xử lý MAMP trong giai đoạn đầu của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh.
Các kết quả cho thấy sự thay đổi rõ ràng về biểu hiện gen trong kiểu gen lúa miến BTx623 và SC155-14E để đáp ứng với điều trị MAMP. Mặc dù các phản hồi đối với hai MAMP cho thấy sự trùng lặp đáng kể trong mỗi dòng (86.6–70,8 phần trăm), nhưng chúng lại khác biệt. Một số, mặc dù thấp hơn, chồng chéo (68,3–29 phần trăm ) cũng được quan sát thấy giữa các phản hồi của hai dòng đối với cùng một MAMP. Một số lượng đáng kể DEG, 2272 trong số 10.535 DEG, đã được xác định trong cả bốn điều kiện và tạm thời xác định phản hồi MAMP cốt lõi. Danh sách các gen này sẽ hữu ích cho những phòng thí nghiệm muốn lập hồ sơ phản ứng biểu hiện gen đối với điều trị MAMP. Phân tích RNA-seq xác định tập hợp lớn các gen biểu hiện khác nhau trong BTx623 và SC155-14E được xử lý bằng flg22 hoặc chitin so với các đối chứng mô phỏng không được xử lý của hai dòng đó. Hơn nữa, so sánh các DEG được chọn bằng cách sử dụng hai đường ống tin sinh học khác nhau cho thấy kết quả rất giống nhau. Phân tích hồ sơ biểu hiện chi tiết của các DEG này, phân tích làm giàu GO và phân tích con đường KEGG cho thấy sự khác biệt rõ ràng trong phản ứng biểu hiện gen của hai kiểu gen. Thuật ngữ GO và làm giàu con đường KEGG đã phát hiện ra nhiều DEG liên quan đến khả năng miễn dịch và kháng mầm bệnh hơn (gen PR, gen phản ứng với chitin, gen phản ứng với axit salicylic, phản ứng với căng thẳng, sinh tổng hợp phenylpropanoid, v.v.) trong SC được xử lý bằng MAMP{{18} }Các mẫu E so với BTx623 có cùng cách xử lý. Thông tin này cung cấp thông tin cơ bản quan trọng về cách hệ thống miễn dịch bẩm sinh của cây trồng chủ lực này phản ứng với việc kích thích MAMPs. Do thiếu thông tin chung về phản ứng miễn dịch bẩm sinh của cây trồng, liên quan đến cây Arabidopsis mô hình, danh sách gen và phương pháp được mô tả cung cấp nguồn tài nguyên để khám phá thêm về phản ứng của lúa miến đối với mầm bệnh và sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho nỗ lực cuối cùng cải thiện khả năng kháng bệnh ở cây lúa miến. cây lương thực và sinh khối quan trọng này.
3. Vật liệu và phương pháp
3.1. Nguyên liệu thực vật
Hai dòng lúa miến do Tiến sĩ William Rooney (Đại học Texas A&M, College Station, Hoa Kỳ) và Tiến sĩ Stephen Kresovich (Đại học Clemson, Clemson, Hoa Kỳ) cung cấp đã được sử dụng trong nghiên cứu này. BTx623 là dòng lúa miến tiêu chuẩn với toàn bộ trình tự bộ gen có sẵn [22] và SC155-14E là dòng được phát triển để kháng bệnh thán thư [39].
3.2. Xét nghiệm ROS
Hạt cao lương của BTx623 và SC155-14E đã được khử trùng bề mặt (ethanol 70 phần trăm trong 1 phút và sau đó là chất tẩy trắng 10 phần trăm trong 10 phút, rửa sạch bằng ddH2O hấp khử trùng) và được trồng trong hỗn hợp bầu Sunshine đã hấp khử trùng, đồng thời nảy mầm trong các buồng tăng trưởng ( 16 giờ/8 giờ sáng/tối, 28/26 ◦C, độ ẩm 60–70 phần trăm). Cây mười lăm ngày tuổi đã được sử dụng cho các thí nghiệm.
Hai MAMP, flg22 (danh mục Genscript# RP19986) và chitin từ vỏ cua (Sigma-Aldrich, danh mục # C3641), đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Flg22 là một peptide có nguồn gốc từ đầu N của Flagellin của vi khuẩn gây bệnh thực vật và nổi tiếng là tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh cụ thể ở thực vật [62]. Chitin là một phân tử MAMP điển hình có nguồn gốc từ thành tế bào nấm, giúp kích thích phản ứng miễn dịch của thực vật [3]. Các xét nghiệm ROS đã được thực hiện theo Kimball et al. [38]. Để đánh giá sự thay đổi trong phản ứng MAMP trong các kiểu gen riêng lẻ, cũng như vị trí của các lá, cả ba lá mở rộng hoàn toàn của các cây thuộc mỗi kiểu gen đều được đánh giá riêng lẻ. Các lá từ dưới lên trên của cây lúa miến 15 ngày tuổi của mỗi kiểu gen được đánh dấu là lá #1, #2 và #3. Chúng tôi chỉ sử dụng phần giữa của lá để lấy mẫu nhằm đo lường quá trình sản xuất ROS. Ngay sau khi xử lý, tín hiệu phát quang hóa học của từng mẫu được ghi lại trong 30 phút bằng máy ảnh Photek CCD (Photek Ltd., East Sussex UK). Tám giếng chứa phương pháp xử lý giả (không có MAMP) và tám giếng chứa phương pháp xử lý (có MAMP). Trong mọi trường hợp, ba lần lặp lại sinh học với tổng số 8 mẫu được so sánh cho mỗi lần xử lý.
3.3. Xử lý mẫu bằng MAMPs
Cây mười lăm ngày tuổi đã được sử dụng cho các thí nghiệm. Các phương pháp điều trị MAMPs đã được thực hiện như mô tả trong Valdes-Lopez et al. [12] với những sửa đổi nhỏ. Tóm lại, lá thứ hai (từ ngọn tức là lá non thứ hai) từ năm cây cho mỗi dòng lúa miến được tách ra và sau đó được hút chân không bằng ddH2O đã khử trùng trong 2 phút. Khoảng 50 đĩa lá có đường kính 1 cm được cắt từ các lá thấm nước của mỗi kiểu gen và gộp lại. Bốn mươi lăm đĩa lá từ mỗi kiểu gen được chuyển vào ba đĩa Petri khác nhau (15 đĩa lá trong mỗi đĩa petri) và sau đó nổi qua đêm ở nhiệt độ phòng trên ddH2O đã hấp khử trùng với các đĩa được phủ bằng lá nhôm. Ngày hôm sau, nước được loại bỏ khỏi tất cả các đĩa Petri và thay thế bằng 10 mL ddH2O (giả), 10 mL 1 µM flg22, hoặc 10 mL dung dịch chitin 20 mg/mL. Sau khi xử lý 60-phút, các lát lá được xử lý giả và MAMP được thu hoạch vào các ống khác nhau và đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng. Các mẫu lát lá (dành cho khả năng miễn dịch BTx623 và SC155-14E với mô phỏng, flg22 hoặc chitin, ba lần sao chép sinh học) được bảo quản ở −80 ◦C để chiết xuất RNA. Tất cả các quy trình được mô tả ở trên được thực hiện trong điều kiện tối để loại bỏ bất kỳ hiệu ứng quang hợp nào có thể xảy ra.
3.4. Khai thác RNA, giải trình tự và xây dựng thư viện
Quá trình trích xuất RNA được thực hiện bằng bộ Direct-zol RNA Miniprep Plus của Zymoresearch (danh mục #R2071) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Trình tự thông lượng cao đã được thực hiện tại Cơ sở Lõi DNA của Đại học Missouri. Mười tám thư viện được xây dựng theo giao thức của nhà sản xuất với thuốc thử được cung cấp trong bộ chuẩn bị mẫu sợi TruSeq mRNA của Illumina. Nồng độ mẫu được xác định bằng máy đo huỳnh quang Qubit (Invitrogen) bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Qubit HS RNA và tính toàn vẹn của RNA được kiểm tra bằng hệ thống điện di tự động Fragment Analyzer. Tóm lại, mRNA chứa poly-A đã được tinh chế từ RNA tổng số (1 µg), RNA được phân mảnh, cDNA sợi đôi được tạo ra từ RNA bị phân mảnh và chỉ mục chứa các bộ điều hợp được nối vào các đầu. Các cấu trúc cDNA khuếch đại đã được tinh chế bằng cách bổ sung các hạt Làm sạch PCR Axyprep Mag. Cấu trúc cuối cùng của mỗi thư viện tinh khiết được đánh giá bằng cách sử dụng hệ thống điện di tự động Fragment Analyzer, được định lượng bằng máy đo huỳnh quang Qubit bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Qubit HS DSDNA và được pha loãng theo giao thức giải trình tự tiêu chuẩn của Illumina để giải trình tự trên NextSeq 500. Độ dài trình tự là duy nhất đọc ở 75 cơ sở.
3.5. Lập bản đồ và xử lý các lần đọc RNA-Seq
Dữ liệu trình tự đại diện cho sáu điều kiện khác nhau: BTx623 với cách xử lý giả, flg22 hoặc chitin và SC155-14E với cách xử lý giả, flg22 hoặc chitin. Mỗi điều kiện được thể hiện bằng ba lần sao chép sinh học, dẫn đến tổng số 18 mẫu. Đầu tiên, 30 đầu của số lần đọc được "cắt bớt" đối với bộ điều hợp Illumina, đối với các nucleotide không rõ ràng (N's) và (do công nghệ NextSeq) đối với poly-G nhân tạo (được biểu thị bằng G{100}) bằng cách sử dụng cutadapt phiên bản 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, được truy cập vào ngày 21 tháng 8 năm 2019) dành cho các lần đọc có 30 đầu trùng với bộ điều hợp tối thiểu 3 cơ sở với 90 phần trăm nhận dạng. Nếu sau lần cắt này, một lần đọc chứa ít hơn mười cơ sở thì nó sẽ bị loại bỏ (cùng với lần đọc được ghép nối của nó, nếu có). Điểm chất lượng cho dữ liệu RNA seq sau khi cắt xén đã được kiểm tra bằng FASTQC (phiên bản 0.11.9) [63]. Đối với tất cả các vị trí trong lượt đọc, điểm chất lượng trung bình là khoảng 34, cho thấy độ chính xác của cuộc gọi cơ sở cao hơn 99,9 phần trăm . Số lần đọc cho từng mẫu được căn chỉnh theo bộ gen tham chiếu (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) với Tophat 2.1.1. Các tệp căn chỉnh kết quả được cung cấp cho Cufflinks 2.2.1 để tập hợp các bản ghi cho từng mẫu. Phiên bản chú thích được sử dụng trong nghiên cứu này là Sorghum_hai màu_NCBIv3.38.gff3. Các mẫu từ cùng một điều kiện đã được hợp nhất bằng Cuffmerge. Mục đích là để cung cấp một cơ sở thống nhất để tính toán biểu hiện gen và phiên mã trong từng điều kiện.
3.6. Phân tích tin sinh học của dữ liệu RNA-Seq
Dữ liệu RNA seq được phân tích bằng công cụ tin sinh học Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 và Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) với các tham số mặc định. Chúng tôi đã sử dụng cùng một quy trình với các công cụ này như được mô tả trong Trapnell et al. [64]. Để xác nhận thêm kết quả xét nghiệm, chúng tôi đã sử dụng một quy trình khác với HiSat2 (phiên bản 2.1.0), HTSeq (phiên bản 0.12.4) và edgeR (phiên bản 3.26.8) để thực hiện phân tích. HiSat2 là bước phát triển tiếp theo của TopHat2. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng HiSat2 để thực hiện căn chỉnh bằng bộ gen tham chiếu lúa miến. Sau đó, chúng tôi đã sử dụng HTSeq để đếm xem có bao nhiêu lần đọc được ánh xạ tới từng gen. Đối với điều này, chúng tôi cần các tệp bam được tạo từ bước trước và chú thích bộ gen (tệp gif). Lưu ý rằng bộ gen tham chiếu và các tệp chú thích giống như chúng tôi đã sử dụng trong quy trình ban đầu. Cuối cùng, chúng tôi đã sử dụng gói R edgeR để xác định các gen được biểu hiện khác nhau trong từng điều kiện
3.7. Xác định các gen biểu hiện khác nhau
Tập hợp đã hợp nhất được đưa đến Cuffdiff, tính toán các mức biểu thức và kiểm tra ý nghĩa thống kê của những thay đổi quan sát được giữa hai điều kiện. Chúng tôi đã so sánh các điều kiện giữa giả với flg22 và giả với chitin đối với BTx623 và SC155-14E, tương ứng. Các gen biểu hiện khác nhau được trích xuất bằng cách sử dụng 0.001 ngưỡng giá trị p. Biểu đồ núi lửa được tạo bằng cách sử dụng gói R (ggplot2 V3.3.0) để cho thấy tầm quan trọng của sự thay đổi biểu hiện gen trong các điều kiện BTx623 được xử lý bằng flg22 hoặc chitin và SC155-
14E được xử lý bằng flg22 hoặc chitin tương ứng. Các chấm gen có −log10 (giá trị p) bằng hoặc lớn hơn ba được coi là DEG. Trong mỗi biểu đồ, các dấu chấm gen có log2 (thay đổi_lần) lớn hơn 0 là các gen điều hòa tăng, nếu không, chúng là các gen điều hòa giảm.
3.8. Âm mưu PCA
Để kiểm tra mối quan hệ giữa các giá trị biểu hiện gen của ba lần sao chép sinh học của từng dòng lúa miến và từng phương pháp xử lý MAMP, các biểu đồ phân tích thành phần chính (PCA) được tạo bằng các gói R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Mỗi dấu chấm đại diện cho một điều kiện sau khi ánh xạ từ không gian đặc trưng ban đầu (biểu hiện gen) sang hai thành phần chính đầu tiên. Các dấu chấm thuộc cùng một điều kiện có xu hướng tụ lại với nhau
3.9. Bản đồ nhiệt của DEG
1 Phòng Khoa học và Công nghệ Thực vật và Hóa sinh, Trung tâm Khoa học Đời sống CS Bond, Đại học Missouri, Columbia, MO 65211, Hoa Kỳ; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)
2 Khoa Kỹ thuật Điện và Khoa học Máy tính, Trung tâm Khoa học Đời sống CS Bond, Đại học Missouri, Columbia, MO 65211, Hoa Kỳ; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)
3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu
4 Đơn vị Nghiên cứu Khoa học Thực vật, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, Hoa Kỳ
* Correspondence: staceyg@missouri.edu
