Sàng lọc ảo và mô phỏng động lực phân tử Xác minh protein chuyển cholesterol từ các chất ức chế sản phẩm tự nhiên ⅱ

 

2 Kết quả

2.1 Điều tra cấu trúc protein

Hiện tại, có 3 cấu trúc tinh thể của protein CETP trong cơ sở dữ liệu PDB (2OBD, 4EWS, 4F2A). Cấu trúc tinh thể 4EWS được sử dụng trong nghiên cứu này có độ phân giải cao nhất và được kết hợp với chất ức chế mạnh, với hoạt động đạt đến mức nano đơn và độ phân giải 2,59. Vị trí mà protein và chất ức chế phân tử nhỏ liên kết cũng là túi liên kết duy nhất của protein. Bề mặt của túi được hiển thị trong Hình 1A. Có thể thấy rằng có một túi kỵ nước lớn ở vị trí liên kết phân tử nhỏ. Do đó, đối với túi ràng buộc này,
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc đã được thực hiện. Việc tạo ra các điểm lưới nối được dựa trên vị trí bỏ túi nơi đặt chất ức chế phân tử nhỏ. Trung tâm của điểm lưới nối được đặt thành phối tử kết tinh, kích thước của hộp bên ngoài lắp ghép được đặt tương tự như kích thước của phối tử kết tinh, với kích thước 10 × 10 × 10 3 và kích thước của hộp bên trong được đặt thành 10 3, như trong Hình 1B.

 

Cistanche Supllements chất lượng cao

 

 

2.2 Sàng lọc ảo dựa trên việc lắp ghép

Dựa trên các túi trên, nhiều vòng sàng lọc đã được thực hiện trên cơ sở dữ liệu L6000. Quá trình cụ thể được thể hiện trong Hình 2. Sau khi sàng lọc ảo thông lượng cao, sàng lọc ảo chính xác tiêu chuẩn và sàng lọc ảo cực kỳ chính xác, 100 hợp chất đã được giữ lại, trong đó điểm số lắp ghép phân tử cao nhất là −16.991 kcal/mol (1 cal {{8}. Kcal/mol. 100 hợp chất được giữ lại đã được ghi lại bằng MM-GBSA và 49 hợp chất độc đáo cuối cùng đã được lấy. Sau khi phân tích và phân tích hình dạng, và sự trùng nhau về vị trí với các phân tử nhỏ tinh thể ban đầu, 19 hợp chất có mức độ phù hợp nhất được lấy làm các hợp chất ứng cử viên, như trong Bảng 1 và Hình 3.

Hình 1 Sơ đồ sơ đồ của túi liên kết protein CETP (A), Sơ đồ của vị trí liên kết protein CETP (b)

Hình 2 Biểu đồ dòng chảy của sàng lọc ảo và mô phỏng động lực phân tử

 

2.3 Phân tích cụm

Sau khi phân tích phân cụm dựa trên sự giống nhau giữa 19 hợp chất được chọn và các phối tử kết tinh của 4EWS, chúng được chia thành 3 loại sau theo mức độ chồng chéo của các cấu trúc phân tử. Hình 4A cho thấy cụm đầu tiên, chứa 14 phân tử nhỏ, chỉ ra rằng bộ xương của hầu hết các phân tử nhỏ là tương tự nhau; Hình 4B cho thấy cụm thứ hai, chứa 1 phân tử nhỏ và Hình 4C cho thấy cụm thứ ba, chứa 4 phân tử nhỏ. Những cái màu đen trong hình là các phối tử kết tinh, và phần còn lại là các phân tử nhỏ thu được bằng cách sàng lọc ảo.

2.4 Phân tích chế độ ràng buộc

Bằng cách xem xét toàn diện các điểm nối và liên kết năng lượng tự do của 19 hợp chất ứng cử viên, ba hợp chất hàng đầu về năng lượng tự do liên kết cuối cùng đã được chọn để phân tích chế độ ràng buộc, bao gồm cảcistanche glycoside a, Theaflavin, và Salvianolic Acid B Dimethyl Ester. Sơ đồ chế độ liên kết của ba hợp chất này và protein CETP được rút ra bằng phần mềm Pymol. Sự tương tác giữa dư lượng axit amin của ba phối tử và protein CETP mục tiêu đã thúc đẩy sự liên kết của phức hợp protein, làm cho nó tạo thành một phức hợp ổn định hơn.
Trong số đó,Cistancheside atạo thành một liên kết hydro thơm với phe463 của protein đích và tạo thành một liên kết hydro thơm và tương tác xếp chồng π-π với Phe263; Theaflavin tạo thành một liên kết hydro cổ điển với His232 của protein đích, tạo thành một liên kết hydro thơm với Phe263 và tạo thành tương tác cation-π với Phe461; Dimethyl este của Acid Salvianolic B tạo thành các liên kết hydro thơm với His232 và Phe441 của protein đích và tạo thành một tương tác xếp chồng π-π với Phe463. Các tương tác phối tử protein khác bao gồm các tương tác kỵ nước và cầu muối, và kết quả được thể hiện trong Hình 5.

2,5 mô phỏng động lực phân tử

2.5.1 Tính toán giá trị RMSD

 

Như trong Hình 6A, sau khi mô phỏngHệ thống A-CETP của CistanchesideVới 1 0 NS, phạm vi dao động RMSD ổn định dưới ± 0. 1nm và trạng thái cân bằng của RMSD chỉ ra rằng cường độ liên kết của hệ thống là tốt. Sau 25 ns mô phỏng, sự dao động của hệ thống Theaflavin-CETP bắt đầu chậm lại đáng kể và phạm vi dao động cũng ổn định dưới ± 0. 1nm, đạt đến trạng thái cân bằng; Giá trị RMSD của hệ thống axit tannic b dimethyl este-CETP dao động ít hơn sau 1 0 ns mô phỏng, với RMSD trung bình là 0. 2-0. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tính toán giá trị RMSD của phối tử.
Như có thể thấy từ hình, Theaflavin-CETP ở trạng thái ổn định ở giai đoạn ban đầu của mô phỏng, trong khiCistanche A-CETPvà axit tannic B dimethyl ester-CETP nhanh chóng ổn định sau một thời gian biến động nhanh chóng. Sự khác biệt này có thể được gây ra bởi các cấu hình phân tử khác nhau và sự khác biệt trong các lực tương tác trong khoang liên kết. Cả ba thường ở trạng thái cân bằng.

 

2.5.2 Tính toán giá trị RMSF dựa trên hệ thống phức tạp của các phân tử thuốc khác nhau và CETP

Protein, nghiên cứu này đã tính toán giá trị RMSF của dư lượng axit amin protein của mỗi nhóm. Như có thể thấy trong Hình 6B, các giá trị RMSF của dư lượng chính của ba hợp chất phân tử nhỏ tác động lên CETP ở mức tương đối thấp, với giá trị trung bình khoảng 0. protein.

 

2.5.3 Tính toán giá trị SASA

Như có thể thấy trong Hình 6C, SASA của hai phức hợp của Cistanche A-CETP và Theaflavin-CETP trong giai đoạn đầu của mô phỏng xung quanh 0-15 ns giảm nhanh, điều này cho thấy sự liên kết nhanh chóng của phối tử. Sự giảm SASA có thể được suy ra rằng phối tử liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của protein và có thể đi kèm với những thay đổi về hình dạng trong túi liên kết hoặc thậm chí thay đổi hình dạng trong protein. Khi mô phỏng tiếp tục, do chuyển động cuộn phổ biến của các nguyên tử của protein và phối tử, SASA đã tăng lên một mức độ nhất định trong giai đoạn giữa của mô phỏng, và người ta suy đoán rằng sự liên kết giữa hai người yếu ở giai đoạn này. Điều này có thể là do sự suy giảm ổn định giai đoạn gây ra bởi sự xáo trộn về hình dạng protein. Sau đó, SASA bước vào giai đoạn thứ ba và giảm nhanh chóng cho đến khi kết thúc mô phỏng. SASA của phức hợp của nhóm Salvianolic Acid B dimethyl Ester-CETP giảm trong toàn bộ quá trình và bước vào trạng thái ổn định sau khoảng 40 ns.

 

2.5.4 Phân tích cấu trúc thứ cấp Phân tích

Như được hiển thị trong Hình 7, tỷ lệ nội dung -Helix của protein trong ba nhóm phức hợp là ổn định nhất và không có sự gia tăng hoặc giảm rõ ràng nào được quan sát. Trong cistancheside A -CETP, có thể quan sát rõ ràng rằng nội dung -sheet giảm và cuộn dây tăng trong giai đoạn 0-25 ns, và sự gia tăng và giảm thay đổi được khôi phục sau 25 ns. Trong Theaflavin -CETP, có thể thấy rằng những thay đổi rõ ràng hơn chủ yếu xuất hiện trong quá trình chuyển đổi lẫn nhau của -turn và cuộn dây. Trong axit tannic b dimethyl este -CETP, thay đổi chính là giảm -sheet và tăng cuộn dây. Sự thay đổi hàm lượng cấu trúc thứ cấp protein chủ yếu bị ảnh hưởng bởi loại axit amin gần vị trí liên kết. Do các vị trí cụ thể khác nhau của các phân tử phối tử trong các phức hợp khác nhau và các loại và điểm mạnh khác nhau của lực tương tác, sự phù hợp protein của mỗi nhóm cũng khác nhau. Nói chung, nội dung của cấu trúc thứ cấp protein trong mỗi nhóm có những thay đổi rõ ràng, liên quan chặt chẽ đến sự ràng buộc chặt chẽ của phối tử.

 

3 Thảo luận

Lipid máu là một thuật ngữ chung cho chất béo và lipid trung tính trong huyết tương. Sự cân bằng củaChuyển hóa lipid máulà rất quan trọng để duy trì các hoạt động sống của các tế bào và sinh vật; Chuyển hóa lipid máu bất thường có liên quan chặt chẽ đến sự xuất hiện của các bệnh tim mạch và mạch máu não, các bệnh thoái hóa thần kinh và khối u [12-13]. Việc công nhận và điều trị rối loạn lipid máu trong y học cổ truyền Trung Quốc đã được ghi nhận trong một thời gian dài. Y học cổ truyền Trung Quốc có những lợi thế của tài nguyên phong phú, cấu trúc đa dạng, ít phản ứng bất lợi và giá thấp. Nó có tác dụng tốt trong việc điều chỉnh các bất thường lipid và đã được công nhận rộng rãi trong các ứng dụng nghiên cứu cơ bản và lâm sàng trong và ngoài nước [14-16].
Sàng lọc các phân tử nhỏ của các thành phần y học thảo dược Trung Quốc có thể được sử dụng cho quy định vàĐiều trị rối loạn lipid máuTừ một cơ sở dữ liệu monome y học Trung Quốc thông lượng cao có ý nghĩa thực tế. Công nghệ sàng lọc ảo và công nghệ mô phỏng động lực phân tử là một trong những công nghệ và phương tiện quan trọng nhất trong nghiên cứu y học hiện tại của Trung Quốc, và có thể sàng lọc các phân tử thuốc trên quy mô lớn [17]. CETP là một enzyme điều hòa quan trọng liên quan đến chuyển hóa lipid và quá trình RCT trong lưu thông máu. Nghiên cứu này tập trung vào chức năng và vai trò của protein CETP. Thông qua nghiên cứu sàng lọc ảo, 19 phối tử ứng cử viên có ái lực với protein CETP đã thu được. Sự đa dạng xương sống của các phối tử ứng cử viên đã được xác minh bằng phân tích cụm và 3 phân tử nhỏ phối tử hàng đầu đã được chọn để phân tích chế độ ràng buộc. Sự tương tác kỵ nước, xếp chồng π-π và cầu muối giữa phối tử và thụ thể đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì ái lực mạnh mẽ của phối tử protein. Nghiên cứu này cũng khám phá sự ổn định của 3 phức hợp phối tử protein ứng cử viên thông qua mô phỏng MD. Kết quả cho thấy các biểu đồ RMSD, RMSF và SASA của 3 phức hợp phối tử protein hàng đầu có xu hướng ổn định sau khi dao động và biên độ dao động là nhỏ. Những thay đổi rõ ràng trong hàm lượng cấu trúc thứ cấp của protein cũng cho thấy sự liên kết chặt chẽ của phối tử protein. Do đó, chúng được coi là ứng cử viên tiềm năng cho các chất ức chế phân tử nhỏ có ái lực cao với protein CETP.

 

 

Cistanche A là một hợp chất phenylethanol glycoside, chủ yếu được tìm thấy trong các loại thuốc truyền thống của Trung Quốc như cistanche và Rehmannia. Phần khối lượng của nó trong cistanche là {{0}}.

Shimoda và cộng sự [19] báo cáo rằng chiết xuất cistanche có thể ảnh hưởng đến biểu hiện mRNA của vận chuyển cholesterol và các phân tử liên quan đến chuyển hóa ở chuột tăng cholesterol máu do chế độ ăn kiêng và cho thấy hoạt động hạ thấp cholesterol. Theaflavin là các thành phần duy nhất được hình thành trong quá trình lên men của trà đen và nội dung của chúng trong trà đen là 0. 3% -1. 5% chất rắn [20]. Một nghiên cứu ngẫu nhiên có kiểm soát cho thấy chiết xuất trà giàu Theaflavin là một chất bổ sung hiệu quả cho chế độ ăn chất béo bão hòa thấp và có thể làm giảm mức LDLC ở người lớn bị tăng cholesterol máu với khả năng chịu đựng tốt [21]. Salvianolic Acid B Dimethyl Ester là một thành phần hòa tan trong chất béo được chiết xuất từ ​​Salvia Miltiorrhiza và là một dẫn xuất dimethyl ester của Acid Salvianolic B. Hàm lượng của hai loại trong salvia miltiorrhiza là khoảng 20: 1, vì vậy axit salvianolic b dimethyl. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Acid Salvianolic B Dimethyl Ester có chất chống oxy hóa tương tự, quét gốc tự do và các hoạt động dược lý chống nhịp tim như Acid Salvianolic B [22-23]. Do đó, các hợp chất phân tử nhỏ tự nhiên cistanche sa mạc A, Theaflavin và Salvianolic Acid B dimethyl ester được sàng lọc bằng cách sàng lọc ảo và mô phỏng động lực phân tử trong nghiên cứu này không chỉ có thể được sử dụng để phát hiện ra các chất ức chế protein truyền thống Các hợp chất, tóm tắt và phân tích các loại thuốc truyền thống Trung Quốc này, và kết hợp chúng với quan điểm toàn diện và lý thuyết khác biệt hội chứng của y học cổ truyền Trung Quốc để xây dựng các đơn thuốc y học cổ truyền Trung Quốc. Ngoài ra, các chất ức chế protein CETP khác như isofuspastoside, diosmin và vecinin -2 thu được thông qua sàng lọc ảo trong nghiên cứu này, cũng như các loại thuốc truyền thống của Trung Quốc có nguồn gốc, chẳng hạn như Forsythia