Wnt1 ngoại sinh ngăn ngừa chấn thương thận cấp tính và sự tiến triển tiếp theo của nó thành bệnh thận mãn tính
Mar 12, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Hong1†, Yanni Zhou2†, Dedong Wang3†, Fuping Lyu4, Tianjun Guan3, Youhua Liu1,5và Liangxiang Xiao3*
1Phòng thí nghiệm trọng điểm của nhà nước về nghiên cứu suy nội tạng, Trung tâm nghiên cứu lâm sàng quốc gia về bệnh thận, khoa thận Divisionof, bệnh viện Nanfang, đại học y khoa miền nam, Quảng Châu, Trung Quốc,2Khoa Thận, Bệnh viện Hạ Môn Trực thuộc Đại học Y khoa Bắc Kinh, Hạ Môn, Trung Quốc,3Khoa Thận, Bệnh viện Trung Sơn trực thuộc Đại học Hạ Môn, Hạ Môn, Trung Quốc,4Khoa Nội tiết và Đái tháo đường, Bệnh viện trực thuộc đầu tiên của Đại học Hạ Môn, Hạ Môn, Trung Quốc,5Khoa Bệnh lý, Trường Y Đại học Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Hoa Kỳ
Các nghiên cứu cho thấy rằng chất chủ vận Wnt / -catenin có lợi trong điều trịchấn thương thận cấp tính(AKI); tuy nhiên, nó vẫn còn khó nắm bắt về vai trò của nó trong việc ngăn ngừa AKI và sự tiến triển của nó thành bệnh thận mãn tính (CKD). Trong nghiên cứu này, tín hiệu Wnt / -catenin ở thận hoặc được kích hoạt bởi sự biểu hiện quá mức của Wnt1 ngoại sinh hoặc bị ức chế khi dùng chung với ICG -001, một chất ức chế phân tử nhỏ của tín hiệu -catenin, trước khi bị thiếu máu cục bộ / tổn thương tái tưới máu (IRI) để gây ra AKI và tiếp theoCKD. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước những con chuột được IR bảo vệ chống lại AKI, và cản trở sự tiến triển của AKI thành CKD ở chuột, được chứng minh bằng cả phân tích sinh hóa máu và mô học thận. Ngược lại, điều trị trước ICG -001 trước IR không ảnh hưởng đến tín hiệu Wnt / -catenin ở thận hoặc sự tiến triển của AKI thành CKD. Về mặt cơ học, sự biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước khi IR ngăn chặn sự biểu hiện của protein đơn bào ở chuột AKI và làm giảm phản ứng viêm ở cả chuột AKI và chuột CKD. Ngoài ra, Wnt1 ngoại sinh ức chế quá trình apoptosis của các tế bào ống do điều trị giảm oxy-tái oxy hóa (H / R) trong ống nghiệm gây ra. Để kết luận, nghiên cứu này cung cấp bằng chứng hỗ trợ tác động phòng ngừa của việc kích hoạt Wnt / -catenin đối với AKI liên quan đến IR và sự tiến triển tiếp theo của nó đến CKD.
Từ khóa: chấn thương thận cấp, bệnh thận mãn tính, Wnt1, -catenin, chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu
Việc điều trịchấn thương thận cấp tính(AKI): cistanche
GIỚI THIỆU
Chấn thương thận cấp tính (AKI)là một tình trạng lâm sàng do mất nhanh chức năng thận do các chấn thương khác nhau, chẳng hạn như thuốc, thiếu máu cục bộ, nhiễm trùng huyết và độc tố (Chawla và Kimmel, 2012; Scholz và cộng sự, 2021) .AKI có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh cao và tử vong, gây ra khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn thế giới (Belayev và Palevsky, 2014). Đặc biệt, AKI là một công cụ dự báo độc lập được công nhận rõ ràng về sự phát triển của bệnh thận mãn tính (CKD) hoặc bệnh thận giai đoạn cuối (ESRD), đã đặt gánh nặng kinh tế rất lớn lên hệ thống chăm sóc sức khỏe (Leung và cộng sự, 2013; Belayev và Palevsky, 2014; Kurzhagenet al., 2020). Thật không may, không có loại thuốc hiệu quả nào để ngăn ngừa và điều trị AKI.
Tín hiệu Wnt / -catenin đóng một vai trò cơ bản trong quá trình sinh đường, cân bằng nội môi mô và sự phát triển của các bệnh khác nhau, bao gồm cả các bệnh về thận (Soni, 2021). -Catenin có hai vai trò vừa đóng vai trò là protein cấu trúc vừa là chất điều hòa phiên mã (MacDonald et al., 2009). -Catenin liên kết màng là một phần của phức hợp liên kết và góp phần vào sự tương tác giữa tế bào với tế bào, trong khi cytosolic -catenin được phosphoryl hóa bởi glycogensynthase kinase -3 (GSK -3) và được nhắm mục tiêu để phân hủy ubiquitinationa và proteasomal. Tuy nhiên, sự phân hủy -catenin như vậy có thể được giải cứu bởi các phối tử Wnt, một họ glycoprotein được tiết ra với các hoạt động sinh học đa dạng. Sự liên kết của Wnt ổn định -catenin, chuyển vị vào nhân và hoạt động như một yếu tố phiên mã để điều hòa gen. Đáng chú ý, tín hiệu Wnt / -catenin được tái phát tương đối ở thận người lớn không bị thương nhưng được kích hoạt lại trong thời kỳ chấn thương thận cấp và mãn tính (Huffstater và cộng sự, 2020). chức năng thận, trong khi kích hoạt Wnt / -catenin kéo dài có thể thúc đẩy quá trình chuyển từ AKI thành CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al., 2020). Do đó, tín hiệu Wnt / -catenin là một từ hai lưỡi trong chấn thương thận và cần được hiểu rõ hơn.
Tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận (IRI) được coi là nguyên nhân chính của AKI. Do đó, mô hình động vật IRI thận đã được sử dụng phổ biến cho nghiên cứu về sự suy giảm AKI và AKI-CKD (Bonventre và Yang, 2011). Cả hai phương pháp tiếp cận dược lý và di truyền đã được sử dụng để làm sáng tỏ thời gian hoạt hóa Wnt / -catenin trong các mô hình IRI của AKI và CKD, tương ứng. Các chất ức chế Lithium và GSK -3 thường được sử dụng để kích hoạt tín hiệu Wnt / -catenin về mặt dược lý trong các mô hình AKI tiền lâm sàng, nhưng cần lưu ý về tác dụng không phụ thuộc -catenin của chúng (Bao và cộng sự, 2014). Sửa đổi tổng thể của GSK {{9 }}, -catenin, hoặc phối tử Wnt (Wnt1 và Wnt9a) đã được sử dụng để làm sáng tỏ vai trò của kích hoạt Wnt / -catenin trong AKI và CKD (Bonventre vàYang, 2011; Bao và cộng sự, 2014; Zhou và cộng sự, 2013, 2018; Liuet al., 2020). Tuy nhiên, các nghiên cứu về vai trò của Wnt / -cateninsignaling trong việc phòng ngừa AKI còn khá hạn chế. Nghiên cứu đại diện nhằm làm sáng tỏ vai trò của tín hiệu Wnt / -catenin trong việc ngăn ngừa AKI và sự tiến triển sau đó của nó thành CKD.
HÌNH 1|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR ngăn cản AKI và kích hoạt -catenin thận ở chuột
(A)Các nhóm điều trị chuột. Chuột được điều trị bằng plasmid pcDNA3 (IRI plus pcDNA3) hoặc PHA-Wnt1 (IRI plus PHA-Wnt1) thông qua tiêm tĩnh mạch đuôi hydrodynamic vào 2 ngày trước khi BIRI. Mức creatinine huyết thanh(B)mức nitơ urê andblood (BUN)(C) đã được đo lường. (D) Hình ảnh vi thể đại diện của hình thái thận ở 1 ngày sau BIRI. Các phần thận được nhuộm Periodic acid-Schiff. Các khu vực đóng hộp được mở rộng. Mũi tên chỉ ống thận. Thanh chia độ, 200 µm.(E, F)Phân tích Western blot của -catenin hoạt động ở chuột thận. * P <0. 0="" 5="" so="" với="" điều="" khiển="" sham="" (n="5)." †="" p=""><0,05 so="" với="" iri="" được="" tiêm="" plasmid="" pcdna3="" (n="">
Cistanche cải thiện chức năng thận
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nghiên cứu động vật
Chuột đực C57BL / 6 nặng khoảng 22–25 g được mua từ Vital River Laboratory Animal Technology (Bắc Kinh, Trung Quốc), và được duy trì trong cơ sở động vật (nhiệt độ: 22 ± 2◦C, độ ẩm: 60 ± 5 phần trăm, 12h tối / vòng sáng ) tại Đại học Y khoa Phương Nam (Quảng Châu, Trung Quốc) với nước và thực phẩm ad libitum. Các nghiên cứu trên động vật đã được Ủy ban Đạo đức và Phúc lợi Động vật tại Southern MedicalUniversity phê duyệt. Tất cả động vật đều được đối xử theo Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm.
Sự cảm ứng của AKI và CKD ở chuột đã được mô tả trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (Xiao và cộng sự, 2016; Zhou và cộng sự, 2018). Tổn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu ở thận hai bên (BIRI) đã được sử dụng rộng rãi để gây ra AKI ở chuột, ngược lại làm tăng tỷ lệ tử vong trong quá trình tiến triển của AKI thànhCKD. Do đó, thiếu máu cục bộ / tổn thương thận một bên (UIRI) được sử dụng để nghiên cứu về sự tiến triển của AKI thành CKD. Một cách ngắn gọn, một vết rạch ở bụng giữa chuột được tạo ra trong điều kiện gây mê toàn thân và thận hai bên trái hoặc thận trái được cắt trong 30 phút bằng kẹp vi mạch (mục số 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Vương quốc Anh). Trong quá trình phẫu thuật, nhiệt độ cơ thể được duy trì ở khoảng 37–38◦C bằng cách sử dụng hệ thống sưởi được kiểm soát nhiệt độ.
Để đánh giá tác dụng phòng ngừa của Wnt / -catenin activationon AKI, chuột được tiêm 1 mg / kg hemagglutinin (HA) vectơ biểu hiện Wnt1 được gắn thẻ (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) hoặc vectơ trống (pcDNA3) 2 ngày trước khi BIRI sử dụng hydrodynamic- dựa trên kỹ thuật chuyển gen đã được báo cáo trước đây (Xiao và cộng sự, 2016). Máu và mô thận được thu thập 1 ngày sau khi BIRI thận.
Để đánh giá hiệu quả của việc kích hoạt Wnt / -catenin sớm đối với sự tiến triển của AKI thành CKD, chuột được tiêm tĩnh mạch đuôi thủy động lực hàng ngày của Wnt1 biểu hiện ở mức 1 mg / kg hoặc tiêm ICG trong phúc mạc hàng ngày -001 ({{4 }}, Chembest, Thượng Hải, Trung Quốc) ở mức 5 mg / kg trong 3 ngày trước UIRI. Máu và mô thận được thu thập 11 ngày sau khi UIRI. Trong nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi, 2 ngày tiêm Wnt1 có thể gây ra sự biểu hiện của Wnt1 ở chuột AKI (dữ liệu không hiển thị). Cần lưu ý rằng 3 ngày tiêm Wnt1 được chọn để đảm bảo và kéo dài sự biểu hiện của Wnt1 trong quá trình chuyển AKI thành CKD.
Tổn thương thận cấp tính (AKI) là một tình trạng lâm sàng do mất chức năng thận nhanh chóng
Điều trị và nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào biểu mô hình ống gần ở người (HKC -8) được cung cấp bởi Tiến sĩ L. Racusen tại Đại học Johns Hopkins (Baltimore, MD, Hoa Kỳ). Nuôi cấy tế bào đã được thực hiện như mô tả trước đây (Zhou và cộng sự, 2013). Tế bào HKC -8 được xử lý bằng Wnt1 tái tổ hợp ở người (SRP4754; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Hoa Kỳ) ở 100 ng / mL hoặc ICG -001 (847591-62-2, Chembest, Thượng Hải , Trung Quốc) ở 10 µM trong 4 giờ. Sau đó, các tế bào được ủ trong một trạm làm việc thiếu oxy (X 3- CK, Biospherix) ở 1 phần trăm pO2 trong 48 giờ. Tiếp theo, các tế bào được tái tạo oxy trong 2 giờ trước khi thu thập để thực hiện các phân tích khác nhau.
HÌNH 2|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR làm giảm quá trình chết rụng tế bào ống và kích hoạt NF-κB ở chuột AKI
(A) Hình ảnh hiển vi đại diện cho thấy các tế bào dương tính với TUNEL trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra. Các mũi tên chỉ ra khả năng nhuộm dương tính. Thanh chia độ, 100 µm.(B)Bản trình bày đồ họa cho thấy trường công suất cao cellsper tích cực TUNEL (HPF) trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra.(C–F)Các phân tích Western blot đại diện cho thấy biểu hiện thận của FasL, p53 và Bax ở các nhóm khác nhau như được chỉ định. * P <0. 0="" 5="" so="" với="" điều="" khiển="" sham;="" †="" p=""><0,05 so="" với="" iri="" được="" tiêm="" plasmid="" pcdna="" (n="5" -="">(G) Western blot đại diện của protein p65 và p-p65 trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra.
Thử nghiệm apoptosis
Tế bào được trypsinized, thu thập và rửa bằng PBS.PE Quá trình nhuộm Annexin V được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. Phân tích tế bào được thực hiện bằng máy đo tế bào dòng chảy (BD FACSCanto II, San Jose, CA, Hoa Kỳ) để đo tỷ lệ chết rụng bằng cách phát hiện lượng tế bào PE Annexin V tích cực và 7- AAD âm tính. Mỗi thí nghiệm được thực hiện trong ba lần.
Creatinine và Nitrogen Urê trong máu
Nồng độ creatinin trong huyết thanh và nước tiểu cũng như nồng độ ureanitrogen (BUN) trong máu được đo bằng máy phân tích sinh hóa tự động (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Hoa Kỳ).
Mô học và hóa mô miễn dịch
Các phần thận và phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đã được thực hiện như được mô tả trước đây (Liu và cộng sự, 2020). Các kháng thể ban đầu bao gồm thỏ đa dòng anti – Wnt1 (ab15251; Abcam, Inc.), thỏ đa dòng kháng - - catenin (ab15180; Abcam, Inc .), và kháng fibronectin đa dòng ở thỏ (F3648; Sigma-Aldrich).
Phân tích Western Blot
Phân tích Western blot đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (Zhou và cộng sự, 2019). Các kháng thể chính bao gồm kháng thể kháng fibronectin đa dòng thỏ (F3648; Sigma-Aldrich), kháng thể catenin kháng - - chuột đơn dòng (610154; BD TransductionLaboratories), kháng thể đơn dòng kháng - - SMA của chuột (A2547; Sigma-Aldrich), thỏ đa dòng chống Wnt1 (ab15251; Abcam), kháng tubulin chống - - chuột (T9026; Sigma-Aldrich), kháng thể chống PAI {15}} của chuột (AF3828; Hệ thống R&D), kháng -catenin hoạt động (# 05 –665; EMD Millipore), phối tử chống Fas (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, United States), p53 (# 2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( # 8242S; CST), p-p65 (# 3033S; CST), PCNA (# 2586S; CST).
Tách chiết RNA và phân tích qPCR
Sự phân lập RNA tổng số và qPCR được thực hiện như đã mô tả trước đó. Mức độ mRNA của các gen khác nhau được bình thường hóa với -actin. Trình tự mồi của các gen được liệt kê trong Bảng 1.
HÌNH 3|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR ngăn cản sự tiến triển của AKI thành CKD ở chuột
(A)Các nhóm điều trị chuột. Chuột được tiêm vào tĩnh mạch đuôi thủy động lực học 1 mg / kg pcDNA3 (IRI cộng với pcDNA3) hoặc PHA-Wnt1 (IRI cộng với PHA-Wnt1) plasmid hoặc tiêm vào màng bụng 5 mg / kg ICG -001 vào 3 ngày trước UIRI . Máu và mô được thu thập 11 ngày sau khi UIRI. Mức creatinine huyết thanh(B) và mức nitơ urê trong máu (BUN)(C) đã được đo lường.(D) Hình ảnh vi mô đại diện của hình thái thận ở 11 ngày sau UIRI. Các phần thận được nhuộm định kỳ axit-Schiff. Các khu vực đóng hộp được mở rộng. Mũi tên chỉ ống thận. Thanh tỷ lệ, 1 0 0 µm. * P <0,05; **="" p=""><0,01. n="">
Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm Sigma Stat (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, Hoa Kỳ). So sánh giữa các nhóm được thực hiện bằng ANOVA một chiều, sau đó là bài kiểm tra Student – Newman – Keuls. P <0. 05="" được="" coi="" là="" quan="">
CISTANCHE HERB LỢI ÍCH KIDNEY
KẾT QUẢ
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước IR Ngăn ngừa Tổn thương Thận Cấp tính và Kích hoạt Thận -Catenin ở Chuột
Để xác định vai trò của kích hoạt Wnt / -catenin trong AKIprevention, chuột được sử dụng vectơ biểu hiện HA-taggedWnt1 (PHA-Wnt1) hoặc vectơ trống (pcDNA3) thông qua tiêm tĩnh mạch đuôi thủy động lực học vào 2 ngày trước khi BIRI(Hình 1A). Mức độ huyết thanh của creatinine và BUN, hai dấu hiệu sinh học của chấn thương thận, đã tăng lên đáng kể ở chuột 1 ngày sau khi BIRI, cho thấy sự tồn tại của AKI (Hình 1B, C). quan sát trong chuột AKI(Hình 1D). Đáng chú ý, những thay đổi này trong dấu ấn sinh học tổn thương thận huyết thanh và tổn thương hình thái ở chuột AKI bị suy giảm rõ rệt bởi Wnt1 ngoại sinh. Các phân tích khối phương Tây tiết lộ rằng Wnt1 ngoại sinh thúc đẩy -catenin biểu hiện ở thận ở chuột AKI(Hình 1E, F). Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy rằng việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh sẽ kích hoạt -catenin thận và ngăn ngừa AKI ở chuột.
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước khi IR làm giảm Tế bào Hình ống
Để tìm hiểu xem liệu quy định của quá trình apoptosis có phải là cơ chế tạo ra tác dụng bảo vệ của Wnt1 ngoại sinh đối với AKI hay không, phương pháp nhuộm TUNEL đã được thực hiện để xác định quá trình apoptosis trong mô thận của chuột AKI. So với chuột Sham, IRI đã tăng đáng kể tỷ lệ apoptosis cũng như các protein liên quan đến quá trình apoptosis ở mức độ, chẳng hạn như FasL, p53 và Bax, inkidneys của chuột(Hình 2A – F). Những thay đổi như vậy ở chuột AKI có thận được giảm rõ rệt bởi Wnt1 ngoại sinh in vivo expressionof trước IR. Yếu tố hạt nhân-kappa B (NF κB), đặc biệt là dạng heterodimer p65 / p50 của nó, đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng viêm ở thận của chuộtAKI. Phân tích Western blot cho thấy cả dạng phosphoryl hóa p65 andits (p-p65) đều làm tăng rõ rệt màu mực của chuột sau IRI, trong khi những thay đổi như vậy đã được ngăn chặn bởi Wnt1 ngoại sinh(Hình 2G). Những phát hiện này cho thấy rằng sự biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh beforeIR ngăn chặn quá trình chết rụng và ức chế các ống mực kích hoạt NF-κB của chuột AKI.
HÌNH 4|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước khi IR điều chỉnh giảm Wnt1 nội sinh và -catenin trong thận của chuột sau khi tiến triển AKI-CKD
(A)Hình ảnh vi mô đại diện cho thấy biểu hiện protein Wnt và -catenin trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra. Thanh chia độ, 50 µm.(B–E)Các phân tích đại diện của phương Tây về mức độ protein Wnt1, -catenin và -catenin hoạt động trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra.(F) mRNA biểu hiện TGF- trong các nhóm khác nhau như đã chỉ ra. * p <0. 0="" 5;="" **="" p=""><0,01. n="">
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước IR Ngăn chặn sự tiến triển của Tổn thương thận cấp tính đến Thận mãn tính
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra xem việc kích hoạt Wnt / -catenin trước IR có thể ngăn chặn sự tiến triển của AKI thành CKD hay không. Asshown trongHình 3A, chuột được tiêm vào tĩnh mạch hydrodynamictail plasmid biểu hiện Wnt1 (PHA-Wnt1) hoặc tiêm ICG -001 trong màng bụng vào 3 ngày trước khi UIRI. Cả hai mức creatinine và BUN huyết thanh đều tăng ở chuột vào 11 ngày sau khi UIRI(Hình 3B, C). Ngoài ra, nhuộm Masson trichrome cho thấy sự lắng đọng collagen ở thượng thận và tổn thương xơ ở chuột 11 ngày sau khi UIRI(Hình 3D). Những quan sát này cho thấy sự tiến triển của AKI thành CKD ở chuột sau UIRI. Đáng chú ý, những thay đổi quan sát được về dấu ấn sinh học chấn thương thận trong huyết thanh và xơ hóa thận ở chuột CKD hầu như được ngăn chặn hoàn toàn bằng cách điều trị trước với Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001. Do đó, biểu hiện in vivo của Wnt1 nội sinh trước IR ngăn cản sự tiến triển củaAKI thành CKD ở chuột.
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước khi IR giảm điều chỉnh Nội sinhWnt1 và -Catenin trong thận
Chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn về tác động của tín hiệu Wnt1 nội sinh Wnt / -catenin ngoại sinh trong thận của chuột mắc bệnh thận mạn. Mức protein của chúng đã bị giảm đáng kể khi xử lý trước Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001. Các phân tích của Western blot đã xác nhận tác dụng ức chế của Wnt1 ngoại sinh, nhưng không phải ICG -001, biểu hiện một bên của Wnt1, -catenin và -cateninin thận hoạt động của chuột CKD (Hình 4B – E). Các con đường truyền tín hiệu Wnt / -cateninand TGF- nhiễu xuyên âm trong xơ hóa thận. Biểu hiện mRNA của TGF- được gây ra ở thận của chuộtCKD và cảm ứng như vậy bị giảm đi bởi Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001 (Hình 4F). Do đó, việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh ức chế sự chuyển hóa tín hiệu Wnt / -cateninsignaling nội sinh ở chuột bị suy thận.
HÌNH 5|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước khi IR điều chỉnh giảm các gen mục tiêu Wnt / -catenin ở chuột sau khi tiến triển AKI-CKD
(A, B) mRNA biểu hiện của PAI -1 và MMP -7 trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra.(C–E)Đại diện Western blot phân tích mức protein PAI -1 và Klotho.(F)mRNA biểu hiện của Klotho. * P <{{0}}. 05;="" **="" p=""><0,01. n="">
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước khi IR điều chỉnh giảm các gen mục tiêu của RenalWnt / -Catenin ở chuột
So với chuột Sham, sự biểu hiện mRNA của PAI -1 và MMP -7, hai mục tiêu hạ nguồn trực tiếp của Wnt / -cateninsignaling, được điều chỉnh tăng đáng kể trong thận của chuột tại 11 ngày sau UIRI(Hình 5A, B). Việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh, nhưng không phải ICG -001, đã ức chế sự biểu hiện mRNA của PAI -1 và MMP -7 ở chuột CKD. Western blot phân tích cho thấy rằng mức protein PAI -1 đã tăng lên ở những con chuột mắc bệnh thận mạn tính, nơi đã bị loại bỏ bằng cách xử lý trước Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001(Hình 5C, D). Klotho là chất đối kháng Wnt không tự sinh bằng cách liên kết và cô lập các phối tửWnt. So với chuột Sham, cả hai mức protein mRNA và Klotho đều giảm trong thận của chuột ở thời điểm 11 ngày sau khi UIR(Hình 5E, F). Việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh, nhưng không phải ICG -001, phục hồi gần như hoàn toàn biểu hiện protein và mRNA của Klotho trong thận của chuột CKD. Những phát hiện này cho thấy thêm tác dụng ức chế của Wnt1 nội sinh trên các ống dẫn truyền tín hiệu Wnt / -catenin nội sinh của chuột bị CKD.
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinh Trước khi IR làm giảm xơ hóa thận ở chuột sau khi bị thương thận cấp tính-mãn tính Tiến triển của bệnh thận
Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của kích hoạt Wnt / -catenin trước khi IR lên các gen nền thận và tổn thương xơ ở chuột CKD. thận của chuột ở 11 ngày sau khi UIR(Hình 6A – D).Những thay đổi như vậy đã được giảm bớt bằng cách xử lý trước Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001. Phân tích Western blot cho thấy rằng mức protein của FN và -SMA đã làm tăng đáng kể màu mực của chuột CKD, và những thay đổi như vậy đã bị loại bỏ bằng cách xử lý trước Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001(Hình 6E – G). Tác động của Wnt1 và ICG -001 ngoại sinh lên biểu hiện FNprotein ở chuột CKD đã được xác nhận bằng phương pháp nhuộm thận với kháng thể FN(Hình 6H). Những phát hiện này cho thấy rằng việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh sẽ ngăn cản quá trình tạo sợi thận ở chuột CKD do IR gây ra.
HÌNH 6|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR làm giảm xơ hóa thận ở chuột sau khi tiến triển AKI-CKD
(A–D)mRNA biểu hiện của fibronectin, collagen I, collagen III và -SMA.(E–G)Đại diện Western blot phân tích mức độ protein fibronectin và -SMA-SMA.(H)Nhuộm miễn dịch các phần mực fibronectin. * P <{{0}}. 0="" 5;="" **="" p=""><0,01; †="" p=""><0,05. n="5." thanh="" chia="" độ,="" 50="">
In vivo Biểu hiện Wnt1 Ngoại sinhTrước khi IR làm giảm viêm thận Sau chấn thương thận cấp tính-Thận mãn tính
So với chuột Sham, biểu hiện mRNA của các gen viêm, chẳng hạn như IL -1, IL -6 và TNF-, được điều chỉnh tăng lên đáng kể trong thận của chuột vào 11 ngày sau UIR(Hình 7A – C). Những thay đổi như vậy gần như được chuyển hóa hoàn toàn bằng cách xử lý trước Wnt1 ngoại sinh, chứ không phải ICG -001. Phân tích Western blot cho thấy rằng mức độ protein của cả P65 và dạng phosphoryl hóa của nó (p-p65) đều tăng rõ rệt mức độ tiêu hóa của chuột ở 11 ngày tuổi. sau UIRI, cho biết tín hiệu NF-κB kích hoạt ở chuột CKD(Hình 7D – F). Đáng chú ý, việc điều trị trước Wnt1 ngoại sinh, nhưng không phải ICG -001, đã làm giảm đáng kể nồng độ protein p65 và p-p65 trong thận của chuột CKD.
HÌNH 7|Biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR làm giảm tình trạng viêm thận ở chuột sau khi tiến triển AKI-CKD
(A–C) mRNA biểu hiện IL -1, IL -6 và TNF- trong thận của chuột. (D–F)Đại diện Western blot phân tích mức protein p65 và p-p65. * P <0. 0="" 5;="" **="" p=""><0,01. n="5" -="">
Wnt1 ngoại sinh Bảo vệ các tế bào hình ống
Để xác định rõ hơn vai trò của Wnt1 trong AKI, chúng tôi đã thiết lập mô hình tế bào hình ống của HKC -8 của AKI bằng cách sử dụng phương pháp điều trị giảm oxy tái tạo oxy (H / R). Phương pháp đo tế bào dòng chảy đã được sử dụng để phát hiện quá trình apoptosis và tiết lộ sự gia tăng của tỷ lệ apoptosis trong các tế bào HCK 8 sau khi điều trị H / R(Hình 8A, B). Wnt1 ngoại sinh làm giảm đáng kể quá trình chết rụng ở tế bào HCK -8 sau khi điều trị H / R. Phân tích Western blot cho thấy rằng điều trị H / R làm tăng đáng kể mức độ của các protein liên quan đến quá trình chết, chẳng hạn như FasL, p54, Bax và Parp {{4} } trong ô HCK -8(Hình 8C – G). Khả năng tiêu diệt giảm do Wnt1 ngoại sinh. Những cơ sở dữ liệu này mà Wnt1 ngoại sinh bảo vệ chống lại sự nhiễm khuẩn do H / R gây ra trong các tế bào hình ống.
HÌNH 8|Wnt1 ngoại sinh bảo vệ các tế bào ống chống lại quá trình chết rụng gây ra bởi tổn thương thiếu oxy-tái oxy hóa (H / R) trong ống nghiệm
(A)Đại diện FACS phân tích cho thấy rằng Wnt1 ức chế quá trình chết rụng tế bào do thiếu oxy / tái oxy hóa (H / R) gây ra. Tế bào HKC -8 đã được biểu hiện trước với Wnt1 ngoại sinh, sau đó được ủ trong các điều kiện vô nhân đạo trong 48 giờ và sau đó tái ôxy hóa trong 2 giờ.(B) Hình ảnhtrình bày cho thấy tỷ lệ phần trăm tế bào apoptotic trong các nhóm khác nhau như được chỉ ra. Các tế bào Annexin V dương tính với nhãn ThePE được đếm bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. * P <0. 0="" 5="" so="" với="" điều="" khiển;="" †="" p=""><0,05 so="" với="" h="" r="" (n="">(C) Các phân tích khối phương Tây đại diện cho thấy sự biểu hiện protein của FasL, p53, Bax và Parp -1 trong các ô HKC -8.(D–G)Bản trình bày đồ họa cho thấy mức độ phong phú tương đối của FasL, p53, Bax vàParp -1 trong các ô HKC -8. * P <0. 0="" 5="" so="" với="" điều="" khiển;="" †="" p=""><0,05 so="" với="" h="" r="" (n="">
THẢO LUẬN
Mặc dù AKI đang gia tăng tỷ lệ mắc bệnh và là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến tiến triển thành CKD, nhưng không có liệu pháp hiệu quả nào để phòng ngừa và điều trị AKI. Một số tình huống, chẳng hạn như phẫu thuật tim, lắng đọng trong ống thận và sử dụng thuốc gây độc cho thận, có thể dẫn đến sự phát triển của AKI (Mas-Font và cộng sự, 2017). Điều này nhấn mạnh sự cần thiết của các biện pháp phòng ngừa AKI.
Mặc dù nhiều nghiên cứu ủng hộ tác dụng có lợi của việc kích hoạt Wnt / -catenin trong cơ chế bệnh sinh của AKI, nhưng vẫn còn nhiều điều tiếng về tác dụng phòng ngừa của Wnt / -catenin agonistson AKI. Một phát hiện mới trong nghiên cứu này là sự biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh trước IR có thể bảo vệ chuột chống lại AKI và ngăn chặn sự tiến triển của AKI thành CKD. Sự biểu hiện trên cơ thể sống của Wnt1 ngoại sinh ở 2 ngày trước khiIR hai bên thận có thể kích hoạt -catenin ở thận, dẫn đến giảm apoptosis và viêm ở chuột AKI (1 ngày sau IR). Ngoài ra, biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh ở 3 ngày trước khi IR đơn phương ở thận bị ức chế Wnt / -cateninsignaling nội sinh và ngăn chặn sự phát triển của xơ hóa thận ở chuộtCKD (11 ngày sau IR). Ngược lại, biểu hiện in vivo của Wnt1 ngoại sinh ở 5 ngày sau khi IR ở thận được chứng minh là gây ra sự hoạt hóa -catenin và đẩy nhanh quá trình AKI đến tiến triển CKD (Xiao et al., 2016). Những nghiên cứu này cho thấy rằng thời gian của các chất chủ vận Wnt / -catenin là một yếu tố quan trọng khi chúng được sử dụng để phòng ngừa và điều trị AKI.
Các nghiên cứu cho thấy rằng sự kích hoạt bền vững của tín hiệu Wnt / -cateninsignaling có thể thúc đẩy sự tiến triển của AKI thành CKD. ICG 001 ức chế chọn lọc tín hiệu protein liên kết Wnt / -catenin / CREB (CBP) và hiện đang trong quá trình thử nghiệm lâm sàng cho các bệnh nhân khác nhau. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc sử dụng ICG -011 vào 5 ngày sau khi IR phục hồi chức năng thận và ngăn chặn sự chuyển AKI thành CKD, bằng chứng là giảm xơ hóa thận (Xiao và cộng sự, 2016). Ngoài ra, việc sử dụng ICG -001 bắt đầu 3 ngày sau khi tắc nghẽn niệu quản một bên (UUO) có thể làm giảm các tổn thương xơ thận trong các mô hình CKDmice của UUO (Hao và cộng sự, 2011). Tuy nhiên, nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng điều trị trước ICG -001 tại 3 ngày trước IR không ảnh hưởng đến tín hiệu Wnt / -catenin ở thận hoặc sự tiến triển của AKI thànhCKD. Điều này không có gì đáng ngạc nhiên vì tín hiệu Wnt / -catenin được biểu hiện ở mức rất thấp trong thận của người lớn không bị thương (Tanet al., 2014). Tuy nhiên, phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng thời gian và thời gian sử dụng ICG -001 là rất quan trọng để xác định kết quả điều trị.
Các cơ chế cơ bản tác dụng bảo vệ của Wnt / -catenin có thể liên quan đến việc điều chỉnh quá trình tự chết và con đường sống sót. Sự cắt bỏ di truyền của ống -catenin thúc đẩy quá trình tự chết ở ống sau khi điều trị bằng IRI hoặc axit folic, trong khi sự hoạt hóa của Wnt / -catenin ngăn chặn các protein pro-apoptotic (Wang et al. , 2009; Zhou và cộng sự, 2012). Trong nghiên cứu này, Wnt1 ngoại sinh ức chế rõ rệt quá trình chết rụng tế bào ống ở cả hai mô hình IRImouse của AKI và mô hình tế bào cảm ứng H / R của AKI. Nghiên cứu này cũng chứng minh tác dụng ức chế của Wnt1 ngoại sinh đối với sự hoạt hóa NF-κB trong AKI và CKD, cho thấy sự ức chế phản ứng viêm. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng việc giảm viêm có phải là tác dụng phụ đối với bảo vệ hay các cơ chế bảo vệ chủ đề do Wnt1 ngoại sinh làm trung gian vẫn còn được xác định. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ cơ chế chính xác để bảo vệ qua trung gian Wnt 1- ngoại sinh chống lại AKI và ngăn ngừa sự tiến triển của AKI thành CKD.
Sử dụng bộ điều biến Wnt / -catenin để ngăn ngừa và điều trị AKI và CKD
PHẦN KẾT LUẬN
Tóm lại, nghiên cứu này cung cấp bằng chứng hỗ trợ tác dụng phòng ngừa của việc kích hoạt Wnt / -catenin đối với AKI và CKD liên quan đến IR, mặc dù cần phải làm thêm để làm sáng tỏ các cơ chế chính xác mà Wnt1 ngoại sinh bảo vệ chống lại AKI vàCKD. Với vai trò kép của tín hiệu Wnt / -catenin trong AKI và CKD, nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của thời gian khi sử dụng bộ điều biến Wnt / -catenin trong việc phòng ngừa và điều trị AKI. Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng các phương pháp tiếp cận dược lý và di truyền hơn cũng như thời gian và độ bão hòa điều trị tối ưu được đảm bảo để điều tra tác dụng của thuốc Wnt / -cateninagonists trong việc phòng ngừa và điều trị AKI.
TỪ: Wnt1 ngoại sinh ngăn ngừa chấn thương thận cấp tính và sự tiến triển tiếp theo của nó thành bệnh thận mãn tính, Xue Hong1†, Yanni Zhou2†, Dedong Wang3†, Fuping Lyu4, Tianjun Guan3, Youhua Liu1,5và Liangxiang Xiao3 *
Đổi diện. Physiol., Ngày 08 tháng 11 năm 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816
