Zerumbone, Sesquiterpene gừng nhiệt đới của Zingiber Officinale Roscoe, làm suy giảm quá trình tạo hắc tố do MSH gây ra trong các tế bào B16F10 Phần 1

Trừu tượng:Zerumbone (ZER), một thành phần tích cực của họ Zingiberaceae, đã được chứng minh là có một số hoạt tính sinh học, chẳng hạn như chống viêm, chống dị ứng, chống vi khuẩn và chống ung thư; tuy nhiên, nó chưa được nghiên cứu về đặc tính chống melanogen. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi chứng minh rằng ZER và Zingiber là chất chiết xuất chính thức (ZO) làm giảm đáng kể sự tích tụ hắc tố trong tế bào B16F10 kích thích hormone kích thích tế bào hắc tố (-MSH) của chuột. Hơn nữa, để làm sáng tỏ cơ chế phân tử mà nhờ đó ZER ngăn chặn sự tích tụ hắc tố, chúng tôi đã phân tích biểu hiện của yếu tố phiên mã liên quan đến quá trình tạo hắc tố, yếu tố phiên mã liên quan đến microphthalmia (MITF) và các gen mục tiêu của nó, chẳng hạn như tyrosinase, protein liên quan đến tyrosinase 1 ( TYRP1) và protein liên quan đến tyrosinase 2 (TYRP2), trong các tế bào B16F10 được kích thích bởi -MSH. Ở đây, chúng tôi thấy rằng ZER ức chế sự biểu hiện qua trung gian MITF của các gen tạo hắc tố khi kích thích -MSH. Ngoài ra, các tế bào được xử lý với các nồng độ khác nhau của zerumbone và ZO cho thấy sự tăng phosphoryl hóa kinase 1 và 2 (ERK1/2) được điều hòa tín hiệu ngoại bào, có liên quan đến cơ chế phân hủy của MITF. Ức chế dược lý của ERK1/2 khi sử dụng U0126 đã đủ đảo ngược tác dụng chống tạo hắc tố của ZER, cho thấy rằng việc tăng phosphoryl hóa ERK1/2 là cần thiết cho hoạt động chống tạo hắc tố của nó. Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy chiết xuất ZER và ZO có thể được sử dụng làm hoạt chất trong mỹ phẩm làm trắng da vì tác dụng chống tạo hắc tố của chúng.

Theo các nghiên cứu có liên quan, cistanche là một loại thảo mộc phổ biến được mệnh danh là "thần dược kéo dài tuổi thọ". Thành phần chính của nó làcistanoside, có tác dụng khác nhau nhưchống oxy hóa,chống viêm, và thúc đẩy chức năng miễn dịch. Cơ chế giữahột cáVàLàm trắng danằm trong tác dụng chống oxy hóa của cistancheglycosid. Melanin trong da người được tạo ra bởi quá trình oxy hóa tyrosine được xúc tác bởityrosinaza, và phản ứng oxy hóa cần có sự tham gia của oxy nên các gốc oxy tự do trong cơ thể trở thành nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản sinh melanin. Cistanche chứa cistanoside, một chất chống oxy hóa và có thể làm giảm sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, do đóức chế sản xuất melamin.

Nhấp vào Cách sử dụng Cistanche

Để biết thêm thông tin:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

từ khóa:xương cụt; Roscoe chính thức của Zingiber; sinh hắc tố; MITF; ERK1/2

1. Giới thiệu

Sự hình thành hắc tố, quá trình sản xuất hắc tố bởi các tế bào biểu bì tạo hắc tố, được kích thích bởi hormone kích thích tế bào hắc tố (-MSH) được tiết ra từ các tế bào sừng khi tiếp xúc với bức xạ tia cực tím (UV) [1,2]. Yếu tố tế bào gốc (SCF) là một yếu tố sinh hắc tố khác kiểm soát chặt chẽ sự di chuyển, tăng sinh và biệt hóa tế bào hắc tố để duy trì quá trình hình thành hắc tố ở da sau khi sinh [3]. Yếu tố phiên mã liên quan đến microphthalmia (MITF), là yếu tố phiên mã tạo hắc tố, được kích hoạt thông qua đường truyền tín hiệu cAMP-PKA-CREB (protein liên kết với yếu tố phản ứng a-cAMP adenosine monophosphate-protein kinase) khi kích thích -MSH thông qua thụ thể melanocortin 1 (MC1R) trong màng tế bào chất của tế bào hắc tố biểu bì [4]. Một số hóa chất, chẳng hạn như forskolin và IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), được biết là kích hoạt đường truyền tín hiệu cAMP-PKA-CREB, dẫn đến việc tạo ra hắc tố [5]. Một số nghiên cứu đã tiết lộ rằng việc duy trì sự kích hoạt của kinase 1 và 2 được điều hòa ngoại bào (ERK1/2), có liên quan đến cơ chế phân tử của quá trình phát sinh ung thư, thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa MITF tại Ser73 và sự thoái hóa sau đó của nó thông qua quá trình phân giải protein phụ thuộc vào ubiquitin [6,7 ]. Thật vậy, U0126, một chất ức chế con đường ERK1/2 chọn lọc, đã được báo cáo là làm tăng biểu hiện MITF và hoạt động tyrosinase, dẫn đến sản xuất melanin [6]. MITF ổn định và kích hoạt làm tăng biểu hiện của các gen tạo hắc tố, chẳng hạn như tyrosinase, protein liên quan đến tyrosinase 1 (TYRP1) và protein liên quan đến tyrosinase 2 (TYRP2). Quá trình biến đổi tyrosine thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), là bước đầu tiên của quá trình tạo hắc tố, được xúc tác bởi tyrosinase. Các protein liên quan đến tyrosinase (TRP) xúc tác cho các phản ứng oxy hóa và tautomer hóa tiếp theo [8]. Sau khi tổng hợp melanin, melanin trưởng thành được vận chuyển từ các tế bào biểu bì tạo hắc tố vào tế bào chất của tế bào sừng ở đáy để bảo vệ tế bào khỏi bức xạ UV [2].

Sự gia tăng hắc tố bất thường gây ra nhiều loại rối loạn da, chẳng hạn như ung thư da, sạm da và tàn nhang [4]; do đó, các phân tử nhỏ hoặc các sản phẩm tự nhiên nhắm đến hoạt động xúc tác của tyrosinase hoặc bộ điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu trong quá trình tạo hắc tố, bao gồm ERK1/2, hoặc phiên mã qua trung gian MITF của các gen tạo hắc tố, đã được xác định là các thành phần hoạt tính được khai thác trong mỹ phẩm. ngành công nghiệp. Một số phân tử nhỏ, chẳng hạn như axit kojic, arbutin và niacinamide, được sử dụng rộng rãi làm thành phần mỹ phẩm do hoạt động chống tạo hắc tố của chúng. Tuy nhiên, các báo cáo đã chỉ ra rằng axit kojic gây ra nhiều tác dụng phụ, bao gồm nhiễm độc tế bào, viêm da, ung thư da và ung thư biểu mô tế bào gan do hoạt tính gây độc gen của nó [9]. Mặc dù arbutin được phân lập từ cây dâu tây đã được sử dụng để điều trị rối loạn tăng sắc tố, nhưng gần đây, việc sử dụng nó như một thành phần mỹ phẩm đã bị hạn chế do một số tác dụng phụ của nó [9]. Đã có báo cáo rằng niacinamide có hoạt tính chống tạo hắc tố và hoạt động này được thực hiện bằng cách ức chế chuyển melanosome từ tế bào hắc tố sang tế bào sừng xung quanh [10]. Do đó, nó thường được sử dụng như một hợp chất làm trắng da trong ngành công nghiệp mỹ phẩm. Để khắc phục những hạn chế của các chất làm trắng da có nhiều tác dụng phụ, điều quan trọng là phát triển các thành phần làm trắng da an toàn có nguồn gốc tự nhiên. Ví dụ: -thujaplicin, linderanolide B, 4-butyl resorcinol và plumbagin đã được xác định là hợp chất chống tạo hắc tố do tác dụng ức chế tyrosinase của chúng [4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol và chaetocin thể hiện các đặc tính chống tạo hắc tố bằng cách điều chỉnh các chất trung gian truyền tín hiệu trong con đường tạo hắc tố [11].

Zerumbone (ZER) là một sản phẩm tự nhiên, được phân lập từ các loại tinh dầu dễ bay hơi của thực vật thuộc họ Zingiberaceae, chẳng hạn như Zingiber zerumbet Smith và Zingiber officinal Roscoe [12]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng ZER có nhiều hoạt động sinh học, bao gồm kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống tiểu đường, chống ung thư, chống viêm, chống dị ứng và chống tạo mạch [12]. Thật thú vị, ZER đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương oxy hóa do tia cực tím A (UVA) gây ra trong tế bào sừng của da, nhờ khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng (ROS) thông qua kích hoạt nhân tố-E{{8} }yếu tố liên quan-2 (Nrf2) [1,13]. Điều này cho thấy rằng ZER có thể được sử dụng như một chất phụ gia chức năng trong mỹ phẩm chăm sóc da. Tuy nhiên, cơ chế chi tiết về các đặc tính chống tạo hắc tố của hành động ZER vẫn chưa được nghiên cứu.

Trong nghiên cứu hiện tại, tác dụng ức chế của chiết xuất ZER và Zingiber officinal (ZO) đối với sự hình thành hắc tố do kích thích bằng -MSH, và các cơ chế cơ bản của chúng đã được nghiên cứu. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng ZER ngăn chặn đáng kể quá trình tạo hắc tố do -MSH gây ra bằng cách điều chỉnh tăng quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 và ức chế sự biểu hiện qua trung gian MITF của các gen tạo hắc tố.

2. Kết quả

2.1. Zerumbone (ZER) Ức chế quá trình tạo hắc tố do MSH gây ra trong các tế bào u ác tính của chuột B16F10

Để nghiên cứu tác dụng chống tạo hắc tố của zerumbone (ZER), ban đầu chúng tôi đã đánh giá khả năng gây độc tế bào của nó trong cả tế bào B16F10 và HaCaT. Cấu trúc hóa học của ZER được thể hiện trong Hình 1A. Người ta quan sát thấy rằng ZER ở nồng độ trên 20 µM thể hiện tác dụng gây độc tế bào mạnh, trong khi đó, ở nồng độ dưới 20 µM, ZER không thể hiện khả năng gây độc tế bào ở cả hai dòng tế bào (Hình 1B). Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng ức chế của ZER đối với sự tích tụ và bài tiết melanin do tế bào hắc tố kích thích (-MSH) trong các tế bào B16F10. ZER đã được chứng minh là ngăn chặn mạnh mẽ sự tích tụ melanin nội bào do -MSH gây ra và sự bài tiết của nó vào môi trường nuôi cấy (Hình 1C, D). Hơn nữa, chúng tôi phát hiện ra rằng ZER làm suy giảm quá trình tạo hắc tố hiệu quả hơn so với arbutin 1 mM hoặc axit kojic 0,2 mM, thành phần hoạt tính nổi tiếng của mỹ phẩm làm trắng da (Hình 1D). Để làm sáng tỏ liệu ZER có đủ để ngăn chặn sự hình thành hắc tố trong tế bào người hay không, chúng tôi đã sử dụng các tế bào u ác tính G361 sản xuất melanin. Như được hiển thị trong Hình 1E, ZER làm giảm đáng kể hàm lượng melanin trong và ngoài tế bào do yếu tố tế bào gốc (SCF) gây ra. Những kết quả này xác nhận hoạt động chống tạo hắc tố của ZER trong chuột tạo hắc tố B16F10 và tế bào G361 của con người.

2.2. Zerumbone ức chế biểu hiện gen của yếu tố phiên mã tạo hắc tố, MITF và các gen mục tiêu của nó trong các tế bào u ác tính ở người G361 

Tín hiệu endothelin-1 và SCF đã được báo cáo là đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tạo hắc tố ở tế bào hắc tố ở người và một số loại phụ của khối u ác tính [3,14–16]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện ra rằng ZER ngăn chặn quá trình tạo hắc tố khi các kích thích tạo hắc tố, -MSH và SCF, ở chuột B16F10 và tế bào u hắc tố G361 ở người (Hình 1).

Do đó, chúng tôi đã đo lường sự thay đổi về mức độ biểu hiện của các gen và protein liên quan đến quá trình tạo hắc tố khi kích thích SCF trong các tế bào u ác tính ở người G361. Chúng tôi thấy rằng ZER làm suy giảm biểu hiện protein tyrosinase và MITF do SCF gây ra lần lượt là 2–4 h và 24–48 h sau khi kích thích SCF (Hình 2A). Ngoài ra, sự biểu hiện gen của các gen liên quan đến quá trình tạo hắc tố, chẳng hạn như MITF, tyrosinase và protein liên quan đến tyrosinase 1 (TYRP1) đã bị ức chế trong các tế bào G361 được xử lý bằng ZER (Hình 2B, C). Những kết quả này cho thấy thời gian cao nhất để biểu hiện các gen liên quan đến quá trình tạo hắc tố khi kích thích SCF; cảm ứng mRNA MITF tối đa đã được quan sát thấy trong vòng 1–2 giờ, và mức độ tyrosinase và TYRP1 của mRNA đã được quan sát thấy đạt mức tối đa 24–48 giờ sau khi kích thích SCF.

2.3. Zerumbone ngăn chặn biểu hiện gen và enzyme tạo hắc tố trong tế bào B16F10 của chuột

Để nghiên cứu cơ chế phân tử mà ZER ngăn chặn quá trình tạo hắc tố, chúng tôi đã đo biểu hiện gen của yếu tố phiên mã tạo hắc tố, MITF và các gen mục tiêu của nó, chẳng hạn như protein liên quan đến tyrosinase 1 (TYRP1), tyrosinase và protein liên quan đến tyrosinase 2 (TYRP2) trong trường hợp không có hoặc có mặt của ZER. Vì thời gian cao điểm để biểu hiện các gen liên quan đến quá trình tạo hắc tố khi kích thích SCF và -MSH được biết đến với các tế bào u ác tính G361 ở người (Hình 2) và tế bào u ác tính B16F10 của chuột [4], nên chúng tôi đã đo thêm biểu hiện của MITF, tyrosinase, TYRP1 và TYRP2 trong các tế bào khối u ác tính B16F10 của chuột được xử lý ZER sau 2 giờ hoặc 48 giờ ủ với -MSH. Hình 3A cho thấy ZER đủ để làm giảm biểu hiện MITF, TYRP1, TYRP2 và tyrosinase do -MSH gây ra trong các tế bào B16F10. Tương tự, mức độ biểu hiện protein MITF, tyrosinase và TYRP2 đã giảm khi điều trị bằng ZER. Sự phosphoryl hóa CREB qua trung gian protein kinase A (PKA) là một con đường truyền tín hiệu chính làm tăng MITF ở cấp độ phiên mã khi kích thích -MSH [4]. Do đó, ở đây, chúng tôi đã phân tích xem việc giảm quá trình phosphoryl hóa CREB bằng ZER có thể làm trung gian cho việc ngăn chặn MITF hay không. Chúng tôi thấy rằng quá trình phosphoryl hóa CREB do -MSH gây ra không bị ảnh hưởng bởi điều trị ZER, cho thấy rằng ZER ngăn chặn biểu hiện MITF do -MSH gây ra độc lập với trục đường truyền tín hiệu PKA-CREB (Hình 3B). Bởi vì tyrosinase là một loại enzyme giới hạn tỷ lệ, điều chỉnh quá trình tổng hợp melanin [2,4,11], chúng tôi đã phân tích thêm nồng độ protein tyrosinase nội bào và hoạt động enzyme của nó khi điều trị bằng arbutin, axit kojic và ZER. Hình 3C cho thấy ZER làm giảm đủ mức protein tyrosinase do -MSH gây ra trong các tế bào B16F10. Ngoài ra, Hình 3D cho thấy rằng 10 µM ZER ngăn chặn quá trình oxy hóa L-DOPA hiệu quả hơn so với các chất ức chế tyrosinase, arbutin và axit kojic, cho thấy rằng quá trình oxy hóa L-DOPA thành dopaquinone thông qua hoạt động enzym của tyrosinase bị ức chế trong các tế bào được xử lý bằng ZER . Những kết quả này chứng minh rằng ZER làm suy giảm quá trình tạo hắc tố qua trung gian -MSH bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện gen của MITF, một yếu tố phiên mã liên quan đến quá trình tạo hắc tố và các gen mục tiêu của nó.

2.4. Tác dụng chống tạo hắc tố của Zerumbone thông qua quá trình Phosphoryl hóa ERK1/2

Kích hoạt protein kinase B (AKT) và kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK1/2) bởi các yếu tố tăng trưởng hoặc kích thích tạo hắc tố được biết là có tác dụng ngăn chặn quá trình tạo hắc tố thông qua việc giảm biểu hiện MITF và các gen mục tiêu của nó [11]. Phosphoryl hóa MITF tại Ser73 và Ser409 để đáp ứng với đường truyền tín hiệu ERK1/2 thúc đẩy sự xuống cấp phụ thuộc vào proteasome của nó [17,18]. Do đó, chúng tôi đã điều tra xem ZER có điều chỉnh quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 ở chuột B16F10 và tế bào u ác tính ở người G361 hay không. Tăng phosphoryl hóa ERK1/2 (p-ERK1/2) nhưng không phải là tổng số ERK1/2 (T-ERK1/2) đã được quan sát thấy khi điều trị ZER theo cách phụ thuộc vào thời gian và liều lượng (Hình 4A, B). Điều thú vị là, quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 được quan sát thấy là tăng nhanh trong vòng 10–30 phút và 1–2 giờ sau điều trị ZER ở chuột B16F10 và các tế bào u ác tính G361 ở người (Hình 4A). Tuy nhiên, quá trình phosphoryl hóa AKT và MEK không được quan sát thấy khi xử lý ZER, cho thấy rằng quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 do ZER gây ra có thể ức chế MITF (Hình 4B). Bởi vì quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa và thoái hóa proteasomal của MITF [17,18], nên chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu chất ức chế proteasome có ngăn cản việc giảm MITF bởi ZER hay không. Việc loại bỏ MITF bằng ZER đã không được quan sát thấy khi có MG132, xác nhận rằng ZER làm giảm biểu hiện MITF thông qua sự xuống cấp proteasomal (Hình 4). Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra xem ZER phosphoryl hóa MITF tại Ser73 hay không, đây là dư lượng mục tiêu của ERK1/2. Để phát hiện MITF bị phosphoryl hóa, các tế bào được tiếp xúc với -MSH và MG132. Ở đây, chúng tôi thấy rằng MITF phosphoryl hóa (Ser73) đã được ZER tăng lên đáng kể khi có -MSH và MG132 (Hình 4D). U0126, một chất ức chế chọn lọc protein kinase (MAPK) được kích hoạt bằng mitogen [19], đã hủy bỏ quá trình phosphoryl hóa MITF do ZER gây ra (Hình 4D). Ngoài ra, tổng mức protein MITF trong toàn bộ dung dịch ly giải tế bào (WCL) không bị thay đổi bởi ZER và U0126 khi có MG132 (Hình 4D). Những kết quả này chỉ ra rằng quá trình phosphoryl hóa MITF (Ser73) qua trung gian ERK1/2-và suy thoái proteasomal là một cơ chế quan trọng trong việc ngăn chặn MITF qua trung gian ZER. Ngoài ra, Hình 4E cho thấy U0126 đã khôi phục đáng kể mức protein MITF đã giảm trong các tế bào được xử lý bằng ZER. Một cách nhất quán, hàm lượng melanin nội bào giảm do ZER đã được U0126 khôi phục đến khoảng 40 phần trăm (Hình 4F), cho thấy rằng việc kích hoạt ERK1/2 là cần thiết cho tác dụng chống tạo hắc tố của ZER.

2.5. Tác dụng chống tạo hắc tố của chiết xuất Zingiber Offificinale (ZO)

ZER là một hóa chất thực vật có nguồn gốc từ một số loài thực vật thuộc họ Zingiberaceae, chẳng hạn như Zingiber zerumbet và Zingiber officinal [12]. Do đó, ban đầu chúng tôi đã đo khả năng tồn tại của tế bào khi không có hoặc không có chiết xuất ZO trong các tế bào B16F10 và HaCaT. Hình 5A cho thấy khả năng tồn tại của tế bào không bị thay đổi khi xử lý chiết xuất ZO. Chúng tôi đã phân tích thêm tác dụng chống tạo hắc tố của chiết xuất Zingiber officinal (ZO). Vì sự biểu hiện của MITF và các gen sinh hắc tố đích của nó đã bị giảm bởi ZER thông qua con đường truyền tín hiệu ERK1/2 được kích hoạt (Hình 2 và 3), nên chúng tôi đã kiểm tra xem chiết xuất ZO có ức chế MITF do MSH gây ra và biểu hiện protein sinh hắc tố đích của nó trong các tế bào B16F10 hay không. Tương tự như tác dụng chống tạo hắc tố của ZER, MITF, tyrosinase và TYRP2 do -MSH gây ra đã giảm đáng kể do chiết xuất ZO theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 5B). Thật thú vị, quá trình phosphoryl hóa ERK1/2 cũng tăng lên trong các tế bào được xử lý bằng chiết xuất ZO (Hình 5B). Biểu hiện của MITF và các gen mục tiêu của nó, chẳng hạn như tyrosinase, TYRP1 và TYRP2, đã giảm đáng kể khi xử lý chiết xuất 5 µg/µL ZO (Hình 5C). Hơn nữa, cả hàm lượng melanin ngoại bào và nội bào đều giảm đáng kể xuống còn khoảng 40 phần trăm sau khi xử lý chiết xuất 5 µg/µL ZO (Hình 5D). Ngoài ra, hoạt động tyrosinase giảm đã được quan sát thấy trong các tế bào được xử lý bằng chiết xuất ZO (Hình 5E). Những kết quả này cho thấy chiết xuất Zingiber officinal (ZO) ngăn chặn quá trình tạo hắc tố bằng cách làm giảm biểu hiện gen tạo hắc tố qua trung gian MITF.

Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501