Các cơ quan thận 3D để dịch từ đầu giường

Liên hệ: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta và cộng sự

trừu tượng

Thận là cơ quan thiết yếu lọc máu, loại bỏ chất thải trong nước tiểu trong khi duy trì cân bằng nội môi chất lỏng và điện giải. Các mô hình nghiên cứu thông thường hiện tại như nuôi cấy tế bào tĩnh và mô hình động vật không đủ để nắm bắt được tình hình phức tạp của con người trong cơ thể sống hoặc thiếu giá trị dịch mã. Tăng tốcquả thậnnghiên cứu, công cụ nghiên cứu mới là bắt buộc. Những phát triển gần đây đã cho phép sự biệt hóa có hướng của các tế bào gốc đa năng được cảm ứng để tạo ra các organoids thận.Quả thậnorganoids giống như thận của con người trong ống nghiệm và có thể được ứng dụng trong y học tái tạo và làm mô hình phát triển, độc tính và bệnh tật. Mặc dù các nghiên cứu hiện tại đã cho thấy nhiều hứa hẹn, những thách thức vẫn còn bao gồm sự chưa trưởng thành, khả năng tái tạo hạn chế, và thiếu hệ thống ống dẫn và mạch máu có thể tưới máu. Đánh giá này cung cấp một cái nhìn tổng quan về hiểu biết hiện tại của chúng ta về sự hình thành thận đã cho phép tạo ra các organoids thận. Tiếp theo, các ứng dụng tiềm năng củaquả thậncác organoids được thảo luận sau đó là các quan điểm trong tương lai. Đánh giá này đề xuất rằng tiến bộ trong nghiên cứu organoid thận sẽ được tạo điều kiện thông qua kiến ​​thức ngày càng tăng của chúng tôi về sự hình thành thận và kết hợp các kỹ thuật đầy hứa hẹn như mô hình nội tạng trên chip.

Từ khóa Thận organoid. Tế bào gốc. Kỹ thuật sinh học.Nephron

Bấm vào đây để biết thêm thông tin về Cistanche cho thận

Giới thiệu

Thận là cơ quan thiết yếu lọc máu để tạo ra chất thải trao đổi chất, bài tiết nước tiểu. Thận có tính dẻo đáng kể trong việc điều chỉnh thành phần của nước tiểu, kết hợp lượng nước vào với bài tiết để duy trì cân bằng nội môi chất hòa tan và cân bằng chất lỏng. Vì thận của động vật có vú là một cơ quan không thể tái tạo, nên sự mất đi các đơn vị chức năng, hoặc nephron, tích tụ theo thời gian ở tất cả các cá thể [1]. Các bệnh toàn thân có tỷ lệ lưu hành cao, cụ thể là tăng huyết áp và đái tháo đường, do thuốc hoặc cấp tính do huyết động học gây raquả thậnvết thương(AKI), và các bệnh nguyên phát về thận, là những nguyên nhân phổ biến gây mất chức năng thận nhanh chóng và là nguyên nhân chính gây ra bệnh thận mãn tính (CKD) [2]. CKD được chia thành các giai đoạn dựa trênquả thận rối loạn chức năng, gây ra sự thay đổi chất tan và mất cân bằng chất lỏng gây ra bệnh tật và tử vong trên diện rộng. Tại Hoa Kỳ, CKD có tỷ lệ hiện mắc được báo cáo là 14% [3], có chi phí điều trị hàng năm là 120 tỷ đô la [4], tác động tiêu cực đến chất lượng cuộc sống [5], và ở các giai đoạn nặng, đỉnh điểm là bệnh thận giai đoạn cuối ( ESRD), đòi hỏi sự cần thiết của liệu pháp thay thế thận (RRT). Các hình thức RRT bao gồm lọc máu và cấy ghép, hình thức trước đây chiếm 7% ngân sách Medicare [6] và hình thức sau bị hạn chế bởi việc cung cấp các cơ quan phù hợp [7]. CKD và ESRD là gánh nặng lớn đối với các nguồn lực và chi phí chăm sóc sức khỏe, cũng như đối với những bệnh nhân mắc các bệnh này [8].

Để giải quyết những gánh nặng này, nghiên cứu cơ bản và chuyển dịch đã được tiến hành trong các lĩnh vựcquả thận sự phát triển, kiểm tra độc tính trên thận, mô hình bệnh tật và thuốc tái tạo thận. Các công cụ nghiên cứu truyền thống bao gồm nuôi cấy tế bào trong ống nghiệm, từ cả các tế bào thận sơ cấp đã được phân lập và các dòng tế bào bất tử được biến nạp bằng virus, và các mô hình động vật in vivo. Mặc dù những mô hình phổ biến này đã được sử dụng để nghiên cứu sinh lý và bệnh lý thận với một số thành công, nhưng chúng có những hạn chế cố hữu có thể góp phần vào việc chuyển dịch kém các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm sang liệu pháp lâm sàng [9]. Các mô hình in vitro phần lớn bị hạn chế trong việc phân tích các loại tế bào đơn lẻ, bỏ qua ảnh hưởng của các tương tác giữa tế bào và môi trường trong các mô không đồng nhất phức tạp, chẳng hạn như thận. Các mô hình động vật, trong khi tích hợp các hệ thống cơ thể, bị hạn chế bởi sự khác biệt giữa các loài, dẫn đến các kết luận không trung thực, tốn kém nhiều thời gian và chi phí [10]. Các phương pháp thử nghiệm mới lạ trong tế bào và mô người là một điều cần thiết để khắc phục những hạn chế của các kỹ thuật nghiên cứu truyền thống [11].

Vì sự cần thiết là mẹ của sự đổi mới, những tiến bộ trong các giao thức sử dụng tế bào gốc đa năng của con người (hPSC) đã tạo ra các mô phức tạp ba chiều, đa bào và cơ quan cụ thể, được gọi là các organoids. Các chất hữu cơ ở gan, phổi, tim, ruột và thận cho phép thử nghiệm trên các mô người trong ống nghiệm [12]. Về lý thuyết, các mô bao gồm toàn bộ soma của con người có thể được tái tạo ở quy mô lớn, nhờ các hPSC xác định các đặc điểm của tính đa năng và tự đổi mới. Hai loại hPSC là tế bào gốc phôi người (ESCs) và tế bào gốc đa năng do con người tạo ra (iPSCs). Năm 1998, Thomson và cộng sự. lần đầu tiên mô tả sự tạo dòng ESC có nguồn gốc từ phôi nang người. Để tránh những tranh cãi liên quan đến nguồn gốc phôi thai của ESCs, năm 2006, Takahashi et al. đã mô tả một phương pháp mang tính cách mạng để tạo ra tính đa năng trong các tế bào soma đã biệt hóa ở giai đoạn cuối. Được gọi là iPSCs, những tế bào này được hình thành bởi sự kích hoạt phiên mã của các yếu tố Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 và c-Myc) [13]. Ngoài việc tránh các vấn đề đạo đức, iPSCs còn cho phép các phương pháp tiếp cận y học được cá nhân hóa. iPSCs đại diện cho một nguồn cung cấp không giới hạn của các tế bào là tế bào sinh dưỡng cho tế bào sinh dưỡng của cha mẹ chúng [13]. Các iPSC dành riêng cho bệnh nhân với các đột biến xảy ra tự nhiên có thể được sử dụng để tạo ra các mô hình bệnh có liên quan về mặt lâm sàng trong mô người, đặc biệt trong điều kiện không tồn tại mô hình động vật. Trong các mô hình bệnh di truyền, các đối chứng đã được sửa chữa bộ gen có thể thiết lập mối liên hệ trực tiếp giữa kiểu gen và kiểu hình [14]. Phương pháp tiếp cận y học tái tạo miễn dịch có thể sử dụng số lượng lớn mô cơ quan cụ thể được tạo ra từ iPSCs của bệnh nhân, phủ nhận nhu cầu ức chế miễn dịch và bỏ qua sự thiếu hụt các cơ quan chuyển đổi thực vật [15]. Tận dụng tiện ích phiên dịch của hPSC, đặc biệt là iPSC, có thể cách mạng hóa các lĩnh vực phát triển thuốc và cấy ghép nội tạng, dẫn đến những kết quả đáng kể đối với sức khỏe và bệnh tật của con người.

Khả năng tái tạo lại tất cả các tế bào của cơ thể của hPSC đặt ra một thách thức lớn, cụ thể là làm thế nào để kiểm soát sự biệt hóa đối với các loại tế bào và mô cụ thể mà bạn quan tâm. Sự phát sinh cơ quan của động vật có vú đóng vai trò là nguyên mẫu cho sự biệt hóa có định hướng, sự cảm ứng tuần tự hiệu quả của các loại tế bào trung gian xảy ra trong quá trình phát triển cơ quan [16]. Ngược lại, tái lập trình trực tiếp liên quan đến việc cảm ứng các yếu tố phiên mã đặc trưng cho loại tế bào, bỏ qua các loại tế bào trung gian trong quá trình chuyển đổi tế bào xôma thành một quần thể mục tiêu xác định. Mặc dù được hưởng lợi từ một phương pháp luận đơn giản hơn, việc tái lập trình trực tiếp thường dẫn đến chuyển đổi không hoàn toàn sang tế bào đích do cấu hình methyl hóa DNA và biểu sinh của tế bào gốc [17]. Ngay cả khi việc lập trình lại trực tiếp xảy ra với sự chuyển đổi hoàn toàn, kết quả có thể là một quần thể tế bào đồng nhất [18]. Liên quan đến thận, hơn một chục loại tế bào khác nhau đóng góp vào cấu trúc và chức năng của nephron in vivo. Việc tái tạo nephron sẽ đòi hỏi phải lập trình lại trực tiếp đến tổ tiên chung của tất cả các loại tế bào góp phần, cụ thể là tế bào tiền thân nephron, tế bào tiền thân nội mô và tế bào tiền thân mô đệm [19]. Phương pháp tiếp cận tái diễn để phát triển mô tương tự như thận bản địa là biệt hóa có hướng, một phương pháp được đánh giá dựa trên kiến ​​thức sâu sắc về sự phát triển của thận. Trong bài tổng quan này, chúng tôi nhấn mạnh vai trò thiết yếu của sinh học phát triển thận trong việc tạo ra các organoids có nguồn gốc từ hPSC, nhận xét ngắn gọn về các ứng dụng của công nghệ organoid thận và thảo luận về các hướng tương lai nhằm giải quyết những hạn chế và thách thức hiện nay đối với dịch lâm sàng.

Phát triển thận

Sự phát triển của thận đóng vai trò là tiêu chuẩn vàng cho sự biệt hóa có định hướng, để tạo ra mô in vitro gần giống nhất với mô tương tự in vivo. Nhiều thập kỷ nghiên cứu sự phát triển trên các mô hình động vật có vú cho thấy rằng các con đường Wnt, FGF, axit retinoic, và TGF- / BMP chi phối sự hình thành, cấu trúc mô và sự cảm ứng của các cơ quan nguyên thủy [12]. Những con đường này rất quan trọng đối với sự phát triển lặp đi lặp lại của các mô trên 3 lớp mầm, bao gồm cả thận có nguồn gốc từ trung bì. Lớp trung bì, được kẹp giữa lớp nội bì và ngoại bì, được tạo hình bởi sự điều hòa của hPSCs (tế bào biểu mô trước) thông qua vệt nguyên thủy, một cấu trúc thoáng qua xác định trục trước-sau và trung-bên của phôi đang phát triển [12]. Trục trước-sau của trung bì được xác định bởi thời gian tiến hóa qua vệt nguyên thủy với sự tiếp xúc theo thời gian với tín hiệu Wnt, khi các hPSC không xâm nhập qua vệt nguyên thủy di chuyển về phía trước để ban đầu góp phần vào cấu trúc phía trước, lấp đầy phía sau [1]. Trục trung gian-bên của trung bì được xác định bởi một gradient BMP theo chiều dọc trong vệt nguyên thủy, khi các hPSC trải qua quá trình điều hòa dạ dày thông qua vệt nguyên thủy ở mặt (hoạt động BMP thấp) trở thành trung bì cạnh, thông qua vệt giữa nguyên thủy (hoạt động BMP trung bình) trở thành trung bì trung gian (IM), và qua vệt nguyên thủy đuôi (hoạt tính BMP cao) trở thành trung bì tấm bên [20, 21]. Trong sơ đồ nguyên thủy, thời lượng tín hiệu Wnt và mức độ tín hiệu BMP là những yếu tố quyết định chính đến sự tạo hình trong toàn bộ lớp mầm trung bì.

Trong quá trình phát triển thận của động vật có vú, có 3 giai đoạn thận, sơ cấp, trung bì và metanephros, tất cả đều bắt nguồn từ trung bì. Các nghiên cứu trên chuột cho thấy metanephros, tồn tại như thận trưởng thành, bắt nguồn từ sự cảm ứng qua lại của hai mô có nguồn gốc IM, metanephric mesenchyme (MM) và niệu quản (UB) [22]. MM bao gồm các tế bào tiền thân nephron (NPC) xen kẽ với các tế bào mô đệm, trong khi UB hình thành như một phần còn sót lại tràn ra từ ống Wolffian, một cấu trúc thoái hóa dẫn lưu các trung mô nguyên thủy đến cloaca [23]. Các NPC tập trung của trung mô nắp của MM trải qua quá trình phát sinh hình thái tiến triển từ các thể hình dấu phẩy đến hình chữ S, phân biệt từng đoạn thành các cấu trúc biểu mô liền kề bao gồm nephron, cụ thể là tế bào nang, ống lượn gần, quai Henle, ống lượn xa và ống nối [ 24–27]. Các ống nối của các nephron riêng lẻ hội tụ trong một hệ thống thu nhánh có nguồn gốc từ UB, sau sự cảm ứng qua lại giữa hai mô [28]. Tín hiệu Wnt có nguồn gốc UB xúc tác quá trình chuyển tiếp từ trung mô đến biểu mô (MET) của các NPC thành biểu mô nephron [29], trong khi tín hiệu GDNF có nguồn gốc từ MM thông qua phức hợp Ret / GFRA1 chi phối sự hình thành phân nhánh [30] (Hình 1).

Hình 1 Sự phát triển của thận người từ thận nguyên thủy đến thận trưởng thành. [1] Vạch nguyên thủy (PS) tạo ra trung bì và sau đó đến trung bì trung gian (IM) mà từ đó IM sau (PIM) và IM trước (aIM) có thể được phân biệt trong thời kỳ đầu của quá trình điều hòa dạ dày. [2] Metanephric mesenchyme (MM) bao gồm tế bào tiền thân nephron (NPC) và tế bào mô đệm được hình thành từ PIM trong khi aIM hình thành ống Wolffian từ đó chồi niệu quản (UB) phát triển. UB bắt đầu phân nhánh với các NPC, tế bào tiền thân mô đệm (SPC) và tế bào tiền thân nội mô (EPC). Ở giai đoạn này, hệ mạch không thâm nhập vào quần thể NPC. [3] Tiếp theo, các NPC phát triển các túi thận tạo thành cơ thể hình dấu phẩy, sau đó là cơ thể hình chữ s. Cuối cùng, cấu trúc này kết nối với UB và trở thành một nephron trưởng thành. Máu được lọc trong cầu thận (màu xám) di chuyển siêu lọc đến ống góp (màu vàng) qua ống lượn gần (màu cam), một quai Henle (màu xanh lam) và ống lượn xa (màu xanh lá cây). Các điểm đánh dấu tương ứng với mỗi cấu trúc được đưa ra.

Một bước đột phá lớn trong hiểu biết của chúng tôi về sự phát triển của thận xảy ra vào năm 2014 khi Taguchi et al. bất ngờ phát hiện ra rằng tiền thân T plus MM khác biệt về mặt phát triển với tiền thân Osr1 cộng UB [31], bằng cách sử dụng kỹ thuật truy tìm dòng dõi, lưu ý rằng công trình trước đây đề xuất tổ tiên chung trong Osr1 cộng với IM mà không cần phân tích thêm [22]. Trong nghiên cứu nói trên, chuột Osr 1- GFP đã được sử dụng để xác định rằng Osr1 được biểu hiện tại các thời điểm khác nhau và các vị trí khác nhau trong vùng thận của IM. Bằng cách phân tích mô học và phân loại / sắp xếp lại OSR 1- GFP cộng với các tế bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau, các tác giả đã có thể chứng minh rằng IM phía trước góp phần vào trung bì, ống trung tâm (ống Wolffian) và chồi niệu quản (ra Ống Wolffian), trong khi IM phía sau chứa Six2 cộng với Sall1 cộng với NPC của MM có khả năng biệt hóa thành các tế bào biểu mô của nephron. Việc xác định rằng MM có nguồn gốc từ IM phía sau và UB từ IM phía trước, cùng với biểu hiện dấu hiệu đặc trưng, ​​cung cấp một lộ trình cho sự cảm ứng cụ thể của các dòng dõi cụ thể về thận và đã cho phép các giao thức phân biệt có hướng để tạo ra nephron có nguồn gốc từ MM một cách hiệu quả. biểu mô mà không bị nhiễm các dẫn xuất IM khác. Quan trọng hơn, các nghiên cứu lịch sử đã giả định sự phát triển thận của chuột phản ánh quá trình hình thành thận của con người. So sánh sự phát triển thận của người và chuột, các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ cả đặc điểm hội tụ và phân kỳ, bao gồm sự hình thành thùy, tổ chức ngách tiền thân và sự biểu hiện của các dấu hiệu xác định loại tế bào giả định [32]. Trong các nghiên cứu như vậy, dữ liệu về thận của con người đã được thu thập từ mô phôi sau khi sinh, cho phép hiểu rõ hơn so với thử nghiệm. Sự ra đời của các organoids có nguồn gốc từ hPSC cho phép các giả thuyết có thể kiểm chứng được về sự phát triển thận của con người, trong số các ứng dụng tịnh tiến.

Các organoids 3D thận

Những phát triển gần đây đã cho phép hình thành các organoids thận từ tế bào gốc đa năng do con người tạo ra (hiPCS) thông qua sự biệt hóa có định hướng [33], tạo ra một nền tảng phiên dịch mới để phát triển thuốc và các kỹ thuật y học tái tạo. Organoids là các cơ quan nhỏ trong ống nghiệm tự tổ chức từ các tế bào (gốc) trong môi trường vi mô 3D. Chúng thể hiện sự tương đồng cao với các đối tác in vivo về hình thái mô, số lượng tế bào, tăng sinh và biệt hóa [34].

Sau khi xác định nguồn gốc khác biệt của MM và UB trong quá trình phát triển thận của động vật có vú và làm việc lùi lại theo cách tiếp cận từng bước để xác định các giai đoạn trung gian và biểu hiện dấu hiệu đặc trưng của chúng, Taguchi et al. đã thiết lập các giao thức phân biệt có định hướng cho MM trên cả PSC của chuột và người [31]. Cụ thể, các thể phôi được hình thành từ OCT3 / 4 cộng với SOX2 cộng với hPSC chịu sự truyền tín hiệu Wnt và BMP4 mở rộng để tạo ra T cộng với CDX2 cộng với trung bì non, được định sẵn để đóng góp vào các tế bào của trung bì non sau. Trục giữa-bên của trung bì hướng tới WT1 cộng với HOXD11 cộng với OSR1 cộng với IM sau bằng cách điều trị đồng thời với BMP4, Activin và axit retinoic. Tiếp theo, Wnt và FGF9 thấp được sử dụng để hỗ trợ sự phát triển của OSR1 cộng với SIX2 cộng với SALL1 cộng với WT1 cộng với NPC, với hiệu suất cảm ứng được báo cáo là ~ 62 phần trăm. Trong khi các NPC được tạo ra từ cả PSC của chuột và người, việc nuôi cấy ghép với tủy sống phôi chuột là cần thiết để phân biệt thêm chúng thành các ống lượn gần, ống lượn xa và các cụm tế bào podocyte.

Sử dụng cả hESC và hiPSC trong nuôi cấy đơn lớp, Morizane et al. đã mô tả một giao thức phân biệt có hướng dẫn tạo ra SIX2 cộng với SALL1 cộng với WT1 cộng với NPC với hiệu suất lên đến 90 phần trăm vào các ngày phân biệt 8-9. Tóm lại, tín hiệu Wnt mở rộng gây ra một vệt nguyên thủy muộn phụ thuộc vào activin để hình thành PIM, phân biệt thành các NPC để phản ứng với FGF9. Các NPC sau đó được tổng hợp trong nuôi cấy huyền phù ba chiều bằng cách ly tâm, chịu xung CHIR99021 (CHIR) thoáng qua để mô phỏng tín hiệu Wnt có nguồn gốc UB để xúc tác MET trong NPC và tiếp tục chịu sự điều chỉnh của FGF9 để mở rộng và duy trì tính gốc của Ngách NPC [35]. Sau xung CHIR, MM chuyển sang PAX8 cộng với LHX1 cộng với tập hợp phúc mạc, tiếp tục biệt hóa thành LAM1 cộng với túi thận vào ngày biệt hóa 14. Trong biệt hóa ngẫu nhiên (tức là không có yếu tố nào khác), các túi thận tự mô hình hóa thành dạng nephron cấu trúc bao gồm biểu mô liền kề mang nhiều điểm đánh dấu cho từng tế bào podocyte (NPHS1 cộng với PODXL cộng), ống lượn gần (LTL cộng), quai Henle (CDH1 cộng với UMOD cộng), ống lượn xa (CDH1 cộng với UMOD−) và các ống nối ( CDH1 cộng với AQP2 cộng) [36].

Freedman và cộng sự. đã sử dụng một cách tiếp cận khác để tạo ra một quy trình đơn giản hóa để thu được các chất hữu cơ từ thận. Ở đây, các tác giả đã sử dụng phương pháp Matrigel sandwich để cung cấp vi môi trường 3D cho hPSCs để tạo thành các khối cầu bao quanh các khoang rỗng giống như màng ối [37]. Thông qua quá trình biệt hóa có định hướng, những khối cầu này được kích thích để trở thành các organoit của thận với quy trình hai bước. Các khối cầu hình thành được xử lý bằng CHIR trong 1,5 ngày, sau đó tiếp xúc với môi trường bổ sung B 27-. Vào ngày thứ 10, các organoids hình ống phức tạp, trong mờ được hình thành sau quá trình chuyển đổi từ trung mô sang biểu mô. Takato và cộng sự. đã xác định được các đặc điểm phát triển của cả ống góp và tiền thân của trung bì thận [38]. Ở đây, các tác giả đã sử dụng thông tin này để tạo ra cả trung bì metanephric (vs mesonephric) và biểu mô niệu đạo trong 4 ngày tiếp xúc với CHIR sau đó là 3 ngày tiếp xúc với FGF9. Sau đó, các tập hợp này được nuôi cấy trong 20 ngày, cho phép các chất hữu cơ hình thành tương ứng với thận của quý đầu tiên. Các tác giả đã khẳng định sự hiện diện của ống góp bởi sự hiện diện của các điểm đánh dấu GATA3 và ECAD. Tuy nhiên, điều này sau đó được đánh giá là không đáng tin cậy vì các ống thu và xa có nguồn gốc từ MM cũng có thể biểu hiện các dấu hiệu này [39, 40] (Hình 2).

Hình 2 Các giao thức biệt hóa được định hướng để tạo ra các organoit nguồn gốc từ tế bào gốc đa năng của con người. Sự giống nhau và khác nhau giữa bốn giao thức để tạo ra các organoids thận của con người đã được hình dung. Mỗi giao thức được trực quan hóa bao gồm thang thời gian tính theo ngày, giai đoạn phát triển của organoid và các yếu tố bổ sung để thúc đẩy sự khác biệt có hướng và sự trưởng thành của các organoids. Các giao thức của Taguchi et al. và Takasato et al. dẫn đến các chất hữu cơ trên màng Transwell. Morizane và cộng sự. đã cho phép tạo ra các organoids thận trong 96- đĩa giếng và Freedman và cộng sự. trong cách tiếp cận bánh sandwich Matrigel

Sau khi bốn quy trình phân biệt theo hướng trên được xuất bản vào năm 2015, nhiều nhóm đã thực hiện theo một cách tiếp cận tương tự để chuyển đổi tuần tự các hPSC thành vệt nguyên thủy muộn, PIM, MM, tổng hợp phúc mạc, túi thận và cuối cùng là các organoids ở thận [41–44]. Wu và cộng sự. đã thực hiện một phiên mã đơn bào như một phân tích so sánh giữa các giao thức Morizane và Takasato, chống lại nhau và chống lại thận của thai nhi (16 tuần tuổi) và thận của người trưởng thành (62- tuổi với người bình thườngquả thậnhàm số). Khi được đánh giá trong điều kiện tĩnh ở ngày biệt hóa 26, cả hai giao thức đều tạo ra mô chưa trưởng thành, mỗi giao thức biểu hiện ~ 20 phần trăm ống lượn gần trưởng thành và các yếu tố phiên mã podocyte [41]. Tuy nhiên, Tran et al. sử dụng phương pháp phiên mã đơn bào trên các organoids thận được phát triển bằng cách sử dụng giao thức Morizane để hỗ trợ việc áp dụng các podocytes có nguồn gốc từ organoid để tạo mô hình bệnh và phục hồi chức năng lọc. Tế bào podocynoids chia sẻ cấu hình phiên mã tiến bộ, tương tự cao với thận của bào thai người và hệ thống mạch chủ được tuyển chọn khi cấy ghép để thúc đẩy sự trưởng thành hơn nữa [42]. Garreta và cộng sự. phát hiện ra rằng cấu hình phiên mã của các organoids thận đã được mở rộng sang cấu trúc phiên mã của thận bào thai người ở tam cá nguyệt thứ hai vào ngày thứ 16 của quá trình biệt hóa bằng cách sử dụng hydrogel mềm để kéo dài thời gian của vi môi trường 3D để tạo điều kiện cho tương tác giữa tế bào và chất nền tế bào [44] . Theo một quy trình phân biệt tương tự, Low et al. đã thực hiện giải trình tự RNA đơn bào (RNAseq) để xác định một tập hợp con các tế bào tiền thân nephron là nguồn tiềm năng của hệ mạch thận, điều này khác với các nghiên cứu trong quá trình phát triển trên chuột chứng minh nguồn là FLK1 cộng với các tế bào tiền thân nội mô, khác với NPC của MM [45] và một phần có nguồn gốc từ tế bào tiền thân mô đệm FOXD1 [46]. Tuy nhiên, những phát hiện quan trọng khác bao gồm tín hiệu Wnt chi phối quá trình tuần hoàn mạch máu và tỷ lệ các đoạn nephron gần và xa, sự trưởng thành chức năng của các organoids sau khi cấy ghép và mô hình hóa bệnh thận đa nang lặn tự động (ARPKD) bằng cách sử dụng iPSCs lấy từ bệnh nhân [43].

Công dụng dịch mã của các organoids thận

Nhìn chung, các mô hình nghiên cứu hiện tại để nghiên cứu bệnh tật hoặc các hợp chất thường chỉ giới hạn trong các nghiên cứu tế bào và mô hình động vật. Các mô hình ô rất dễ sử dụng và có thể được áp dụng với số lượng cao. Tuy nhiên, chúng thường bao gồm các dòng đơn bào và không thể nắm bắt được sự phức tạp của thận in vivo của con người như vi môi trường 3D và nhiều tế bào hiện có. Do đó, các mô hình tế bào không thể bắt chước hình thái mô 3D in vivo và vi môi trường không đồng nhất và phức tạp. Để giải thích cho môi trường in vivo phức tạp, các mô hình động vật như chuột là một mô hình nghiên cứu thông thường. Tuy nhiên, các mô hình này có thể chuyển đổi kém phù hợp với điều kiện của con người [47, 48]. Ngoài ra, những lo ngại về đạo đức về việc sử dụng động vật cho mục đích nghiên cứu ngày càng gia tăng [49, 50]

Do đó, cần phải có các mô hình mới có thể bắt chước đặc biệt tình huống in vivo của con người một cách chính xác hơn [51].

Organoids có tiềm năng khắc phục những hạn chế này do khả năng độc nhất của chúng để bắt chước tình trạng in vivo của con người. Và bởi vì các chất hữu cơ có nguồn gốc từ hiPSC, chúng cũng có thể được sử dụng cho y học cá nhân hóa. Ví dụ, một số (kết hợp của) các hợp chất có thể được thử nghiệm với các chất hữu cơ có nguồn gốc từ tế bào của một người cụ thể để kiểm tra độc tính hoặc hiệu quả. Ngoài ra, có thể áp dụng quy mô lớn hơn. Ví dụ, các organoids có thể được sử dụng làm mô hình tiền lâm sàng để xác định các đặc tính của một số hợp chất nhất định. Ngoài ra, các mô hình bệnh tật đáng tin cậy ở người có thể được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng để đẩy nhanh việc phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh đặc biệt hiếm gặp mà bệnh nhân khan hiếm.

Mặc dù cần có nhiều tiến bộ hơn nữa để tạo ra những quả thận hoạt động đầy đủ trong ống nghiệm, các nghiên cứu cho đến nay cho thấy nhiều hứa hẹn. Một số nghiên cứu đã chỉ ra các ứng dụng của các chất hữu cơ trong thận như ngày nay. Những tiến bộ này trong các organoids thận cho phép ứng dụng (trong tương lai) cho y học tái tạo và như các mô hình phát triển, độc tính và bệnh tật. Trong số các ứng dụng dịch mã này, các organoids cũng được coi là phương pháp tiềm năng để ứng dụng y học tái tạo để tạo ra thận sinh học nhằm đưa ra các liệu pháp thay thế lọc máu và ghép thận (Hình 3). Vì nhiều bài đánh giá đã báo cáo về các ứng dụng dịch mã của các organoids trong thận đã được công bố [1, 52–59], bài tổng quan này tập trung vào thế hệ tương lai của mô thận có nguồn gốc tế bào gốc có mô học tương tự như thận người bản địa để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình dịch mã trong nghiên cứu organoid thận. hướng tới tác động đến chăm sóc lâm sàng.

Những thách thức hiện tại và viễn cảnh tương lai

Thận là cơ quan có tính mạch máu cao, nhận chung 20% ​​lưu lượng tim, lọc tới 180 l máu mỗi ngày [60]. Mười chín km mao mạch cầu thận, với diện tích bề mặt ~ 6000 cm2, góp phần tạo nên hàng rào lọc cầu thận (GFB) [61]. Thành phần của GFB là các mao mạch cầu thận nóng chảy, màng đáy cầu thận tích điện âm và các tế bào podocytes thể hiện các màng ngăn giữa các quá trình chân [61]. Cấu trúc của GFB thực hiện chức năng của nó, lọc máu dựa trên kích thước và điện tích của các chất hòa tan. Nước tiểu nguyên thủy được hình thành từ quá trình lọc ở cầu thận đi vào các ống thận, nơi nó được xử lý theo cơ chế hấp thụ và bài tiết. Trong số lên đến 180 l dịch lọc, ~ 99 phần trăm được hấp thụ với chỉ 1–2 l dành cho bài tiết nước tiểu trong điều kiện bình thường. Do sự tái hấp thu thể tích đáng kể trong các mao mạch phúc mạc, không có gì ngạc nhiên khi nhiều nephron thoát ra các ống góp chung hội tụ tại bể thận để tạo thành các niệu quản đơn độc. Cấu trúc tổng thể, từ sự giãn nở mạch máu nephron gần đến sự thông thương lan rộng của giường mao mạch biểu mô-phúc mạc ống đến sự dẫn lưu nephron ở đoạn xa, đóng một vai trò quan trọng trong chức năng thận. Thận duy trì một chức năng tương đối cần thiết ngay cả khi công suất giảm xuống còn 20 phần trăm, với nhiều bệnh nhân trong số này không có triệu chứng. Tuy nhiên, việc giảm xuống dưới 15 phần trăm thường dẫn đến nhu cầu về RRT [62, 63]. Các NPC có khả năng tái sinh đã mất trong con người trước khi sinh ra, và do đó, các nephron không thể tái tạo mới. Hiện nay, không có phương pháp điều trị nào để bổ sung chức năng thận đã mất, vì vậy nhu cầu ứng dụng thuốc phục hồi là rất cao. Hơn nữa, cần có GFB để lập mô hình các bệnh ảnh hưởng đến quá trình lọc, vận chuyển chức năng của ống thận cần thiết cho nhiều loại xét nghiệm độc tính và mô hình bệnh, và sự kết hợp của nephron có nguồn gốc từ MM với các ống góp có nguồn gốc UB cần thiết để mô hình hóa hầu hết các dị tật bẩm sinh của thận. và đường tiết niệu (CAKUT) [64]. Sự phát triển của hệ thống mạch thận có tổ chức và hệ thống thu phân nhánh sẽ thể hiện những bước nhảy vọt về mặt dịch mã trong công nghệ organoid thận.

Thận hóa mạch máu organoid

Quá trình mạch máu của thận liên quan đến hai quá trình riêng biệt: tạo mạch và tạo mạch [65]. Trong quá trình hình thành mạch, quá trình lắp ráp mạch máu xảy ra de novo, trong khi quá trình hình thành mạch liên quan đến sự phân nhánh hoặc kéo dài của các mạch đã có từ trước. Tác động qua lại giữa hai quá trình này trong quá trình hình thành thận vẫn chưa được biết rõ, nhưng các vi mạch thận sinh mạch có thể đi trước sự phát triển của động mạch thận tạo mạch [65]. Ở chuột, MM không có mạch máu trong quá trình xâm nhập chồi niệu đạo nhưng phát triển một mạng lưới mao mạch phong phú vào ngày hôm sau cùng với sự hình thành sau đó của các cầu thận mạch máu. Điều này được thực hiện bởi các tế bào nội mô xâm nhập vào khe hở mạch máu để tạo thành các cầu thận giai đoạn vòng mao mạch đơn [66–68]. Trong khi đó, FLK1 sinh mạch cộng với các tế bào tiền thân nội mô nằm xen kẽ trong MM góp phần tạo nên mạng lưới mao mạch cầu thận phong phú [69]. Tương tự như các phương pháp tiếp cận biệt hóa có hướng để hình thành MM ex vivo, quá trình tuần hoàn mạch máu của mô thận có nguồn gốc từ hPSC nên tuân theo nguồn gốc phôi thai của nó để phát triển mạng lưới mạch máu thận phân cấp, có khuôn mẫu.

Các chất hữu cơ 3D thận được phát triển từ các giao thức ban đầu cho MM có nguồn gốc từ PIM được phát hiện có chứa các tế bào mạch máu; tuy nhiên, phần lớn các cầu thận vẫn ở trạng thái vô mạch, và sự phong phú tổng thể của các mạch máu kém khi so sánh với mô thận bản địa [70]. Điều quan trọng là, các cụm mạch máu sinh mạch này bắt chước sự hình thành vi mạch sớm trong quá trình phát triểnquả thậnkhăn giấy, xảy ra trước khi xâm lấn động mạch thận tạo mạch [65]. Trong công trình nghiên cứu của họ, Taguchi et al. đã cấy ghép MM chuột cảm ứng của họ vào chuột, với hệ mạch có nguồn gốc từ vật chủ tạo mạch dẫn đến tăng mao mạch cầu thận. WT1 cộng với các cụm podocyte cùng khu trú với các mạch PECAM1 plus, được phát hiện có chứa các tế bào hồng cầu chủ trên hình ảnh [31]. Việc cấy ghép các tế bào hữu cơ ở thận tương tự như vậy đã được lặp lại, chứng tỏ hệ mạch bên trong các cầu thận của các chất hữu cơ liên tục xuất phát từ vật chủ và sự hình thành màng đáy cầu thận sớm bao gồm các tế bào nội mô được nung chảy và quá trình chân podocyte [71]. Một mức độ lọc nhỏ của cầu thận đã được khẳng định khi cấy ghép dưới da các chất hữu cơ của thận, dựa trên sự phát hiện nội bào trong các ống chứa dextrans huỳnh quang được quản lý hệ thống được thực hiện để biểu thị sự hấp thu từ dịch lọc cầu thận [72]; tuy nhiên, không thể loại trừ sự hấp thu ở đỉnh do thiếu các mối nối chặt chẽ xuyên suốt từ nang Bowman đến ống lượn gần hoặc sự hấp thu cơ bản qua cơ chế thực bào của ống không thể bị loại trừ [73]. Gần đây, van den Berg et al đã xây dựng dựa trên công trình nghiên cứu của họ, trong đó các organoids thận được cấy ghép dưới nang thận trở thành mạch máu của vật chủ và chứng minh sự trưởng thành của cầu thận và ống [71]. đã phát triển một hệ thống in vivo thanh lịch sử dụng hình ảnh đa photon có độ phân giải cao để chứng minh sàng lọc cầu thận chọn lọc kích thước [74]. Đáng chú ý là, các cầu thận mạch máu được hình thành từ mô tế bào giữa các loài không khắc phục được các hạn chế liên quan đến sự phụ thuộc liên tục vào hệ thống động vật, bao gồm sự khác biệt về phát triển và sinh lý giữa các loài, một mất mát đáng kể đối với các phương pháp tiếp cận thuốc cá nhân hóa, thông lượng thấp và chi phí cao.

Quá trình thông mạch organoid ở thận đã đạt được trong ống nghiệm, với kết quả tương tự như được báo cáo trong các thí nghiệm cấy ghép. Bằng cách kết hợp công nghệ thận organoid và thận trên chip để tổng hợp lại vi môi trường chất lỏng in vivo, Homan và Gupta et al. nhận thấy rằng ứng suất cắt chất lỏng áp dụng cho các organoids thận nhúng trên chip đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành mạng lưới mạch máu lưu thông được phát triển từ sự mở rộng và biệt hóa của các tế bào tiền thân nội mô đồng cảm ứng. Ngoài ra, các tác giả đã chứng minh sự gia tăng phân cực và sự trưởng thành của tế bào biểu mô ống và tế bào podocytes, biểu hiện các quá trình chân tiếp giáp với các mao mạch cầu thận để hình thành GBM nguyên thủy [70, 75]. Mặc dù các organoit trong thận được sử dụng siêu vi lượng, trái ngược với việc chảy giới hạn trong mạch máu, việc áp dụng ứng suất trượt chất lỏng trên toàn bộ các organoit mô phỏng dòng chảy kẽ được tạo ra từ sự dịch chuyển của dịch khoang trong quá trình tái hấp thu ~ 99% dịch lọc cầu thận. Nói cách khác, ~ 99% thể tích trong lumen ống được truyền qua kẽ và được các mao mạch phúc mạc tái hấp thu trong cơ thể. Trong khi hệ thống mạch máu lưu thông đã được chứng minh bằng cách sử dụng đầu dò huỳnh quang, quá trình lọc cầu thận không được hỗ trợ bởi việc phát hiện huỳnh quang trong lòng ống do sử dụng các hạt có đường kính 500 nm, trong khi lưu ý đường kính trung bình của các đám cháy trong mao mạch cầu thận là ~ 70 nm [ 76]. Đáng chú ý, tất cả các mạch máu trong hệ thống đều có nguồn gốc từ các organoids của thận mà không có sự xâm nhập của mạch.

Các phương pháp để vượt qua những thách thức hiện nay bao gồm kết hợp mạng lưới mạch máu tạo mạch in vitro với các chất hữu cơ tạo mạch máu cho thận để cho phép GBM trưởng thành với chức năng lọc cầu thận. Có vô số lý do chính đáng khiến quá trình lọc cầu thận chưa xảy ra trong phương pháp tiếp cận organoid trên chip thận, bao gồm thiếu thử nghiệm dọc, áp suất thủy tĩnh hạn chế truyền trong mao mạch cầu thận, biểu mô nephron chưa trưởng thành và khả năng tuần hoàn thiết yếu. các yếu tố tạo điều kiện cho thận phôi thai phát triển. Mạng lưới mạch máu tạo mạch có thể tưới máu trực tiếp trong ống nghiệm đã được mô tả trước đây, chúng có khả năng nâng đỡ mô dày hoặc xâm lấn các cấu trúc tế bào nhúng trên chip [77, 78]. Hệ mạch như vậy có thể nối liền mạch với các vi mạch có nguồn gốc từ organoid để hạn chế tưới máu đến khoang mạch, tạo điều kiện cho việc truyền áp lực thủy tĩnh đáng kể đến các mao mạch cầu thận. Các hạn chế khác có thể được giải quyết bằng cách sử dụng các nghiên cứu dọc, tưới máu bằng huyết thanh phôi và sử dụng các organoids ngày biệt hóa tối ưu (ảnh hưởng đến sự trưởng thành) trong các thiết bị như vậy. Nếu mạng mạch tạo mạch được cấu tạo bởi các tế bào của con người, thì những hạn chế liên quan đến sự khác biệt giữa các loài sẽ bị loại bỏ. Tương tự, việc sử dụng các mạch máu có nguồn gốc hPSC, như đã được mô tả [79], sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các phương pháp tiếp cận y học cá nhân hóa cho cả chiến lược phát triển thuốc và y học tái tạo.

Hình thành chồi niệu quản

Việc sản xuất siêu lọc cầu thận ex vivo sẽ đại diện cho một khám phá mang tính bước ngoặt để tạo điều kiện thuận lợi cho các ứng dụng dịch mã của mô thận có nguồn gốc tế bào gốc, tuy nhiên cần có một hệ thống thu thập để dẫn lưu tiếp theo. Một mạng lưới ống góp phân nhánh phân đôi hội tụ đầu ra của ~ 1 triệu nephron thận đến một niệu quản duy nhất [60]. Các ống góp không chỉ vận chuyển dịch lọc mà còn tham gia vào quá trình tái hấp thu nước và cân bằng điện giải thông qua các chất vận chuyển và kênh khác nhau trong các loại tế bào biểu mô ống khác nhau của nó. Các ống góp là sản phẩm của quá trình hình thành phân nhánh của chồi niệu quản được điều khiển bởi các tín hiệu phân tử khác nhau có thể được khai thác trong ống nghiệm để bắt chước quá trình này, bao gồm các đường truyền tín hiệu FGF, GDNF / RET và Wnt [68].

Các nghiên cứu về sự phát triển của thận bằng cách sử dụng MM và UB của chuột bị cắt vi mô cung cấp cái nhìn sâu sắc về sự hình thành sớm của những gì sẽ cấu thành thận của người trưởng thành. MM không được tạo ra, tách khỏi cấu trúc biểu mô của UB, ngăn cản sự trưởng thành của một trong hai mô. Tuy nhiên, việc nuôi cấy ghép MM và UB ex vivo có thể tái tạo lại thận chuột, cho thấy rằng những quần thể tiền thân thận này sở hữu một chương trình tự trị đủ để thúc đẩy quá trình hình thành cơ quan của thận [80]. Từ quan điểm phát triển, phương pháp tối ưu để phát triển mô thận chức năng từ hPSCs trong ống nghiệm có thể bao gồm việc tạo ra MM và UB riêng biệt với hiệu quả cao và đồng nuôi của hai quần thể khác biệt.

Các giao thức phân biệt được mô tả trước đây chủ yếu tạo ra MM, được định sẵn để trở thành cấu trúc nephron. Sự biệt hóa theo hướng đối với các tế bào tiền thân ống góp của UB được công bố lần đầu tiên vào năm 2013, trước khi Taguchi xác định nguồn gốc IM khác nhau của MM và UB. Xia và cộng sự. đã chuyển đổi hPSC thành mô cam kết trung bì bằng cách sử dụng FGF2 và BMP4 trong 2 ngày, sau đó tạo ra tế bào tiền thân UB bằng cách sử dụng kết hợp activin, BMP2 và axit retinoic trong 2 ngày bổ sung theo quy trình biệt hóa hai bước [81, 82]. Các tế bào tiền thân UB có nguồn gốc hPSC tự lắp ráp thành mô chimeric giữa các loài khi kết hợp với phôi chuột MM. Vào năm 2017, bằng cách phân tích cấu hình biểu hiện gen trong quá trình phát triển chồi niệu quản ở phôi chuột, Taguchi et al. đã thiết lập một giao thức để đưa cả mô MM và UB vào các chất hữu cơ của thận bằng cách sử dụng các ESC của chuột (mESC) [83]. Giao thức này được dự đoán dựa trên phân loại FACS CXCR4 cộng với KIT cộng với thiết bị đo ống dẫn Wolffian. Việc nuôi cấy các tế bào tiền thân ống Wolffian với MM có nguồn gốc từ mESC đòi hỏi sự hiện diện của các tế bào tiền thân mô đệm để tạo thành các tổ chức cơ quan được tập hợp lại trải qua quá trình phát sinh cơ quan bậc cao hơn để hình thành các nephron được kết nối với nhau bởi một biểu mô niệu quản phân nhỏ. Cuối cùng, các phát hiện không được lặp lại ở MM và UB có nguồn gốc hPSC do sự ngừng phân nhánh UB sớm, mà các tác giả tin rằng có thể do thiếu nhóm tiền thân mô đệm [83]. Việc thiết lập sự biệt hóa có hướng đối với các tiền thân mô đệm thận ở người và tăng khả năng tiếp cận các mô thận sơ cấp của bào thai người có thể phân biệt được nguyên nhân của sự phát sinh hình thái phân nhánh không hoàn toàn đã được báo cáo. Tuy nhiên, có thể có những hạn chế trong hiệu quả cảm ứng của loại tế bào cần thiết, cụ thể là tế bào đầu Ret cộng với UB tăng sinh, chịu trách nhiệm phân nhánh và hình thành liên kết cấu trúc với các ống nối của nephron xa [84].

Có một số ít các giao thức phân biệt có hướng của hPSC đối với UB và các dẫn xuất của nó, với các giao thức đã được công bố cho thấy những hạn chế. Cần có các giao thức cải tiến để cho phép bổ sung mạng lưới ống góp để trải dài toàn bộ các organoids thận chứa nephron. Tương tự với việc tối đa hóa hiệu quả cảm ứng cho các NPC dựa trên biểu thức SIX2, tối đa hóa hiệu quả cảm ứng cho các tế bào đầu UB dựa trên biểu thức Ret là một trong những chiến lược như vậy. Để đạt được mục đích này, cần có sự hiểu biết về sự phát triển của thận. Đáng chú ý, UB hình thành như một ống dẫn Wolffian (hay còn gọi là ống trung bì), được tạo ra từ sự di chuyển theo đuôi của các tế bào IM phía trước xuống xoang niệu sinh dục đến cloaca, lưu ý rằng các tế bào này trải qua MET trên đường đi. Nguồn gốc mạch lạc của UB đặt ra một thách thức đối với việc thiết lập một giao thức phân biệt có định hướng mạnh mẽ. Tuy nhiên, các tế bào trung mô biểu hiện lại có trong aIM có khả năng đóng góp vào UB [84], do đó giao thức bước 3- có thể chuyển đổi hPSC thành vệt nguyên thủy ban đầu (bước 1), sau đó là aIM (bước 2) , sau đó Ret cộng với các ô đầu UB (bước 3). Đáng chú ý, kho lưu trữ di động của tập đoàn NIH's ReBuilding a Kidney (RBK) bao gồm một dòng báo cáo Ret

Sự kết luận

Thận là một cơ quan đặc biệt có chức năng điều hòa cân bằng nội môi nước và điện giải của cơ thể. Sự mất kiểm soát của các quá trình này có thể dẫn đến các biến chứng sức khỏe nghiêm trọng với gánh nặng kinh tế và xã hội cao. Thông qua hiểu biết của chúng tôi về quá trình hình thành thận ở người trong cơ thể sống, chúng tôi đã làm sáng tỏ việc tái tạo quy trình này trong ống nghiệm. Những tiến bộ hiện tại đã cho phép tạo ra các organoids có nguồn gốc từ hiPSC. Các organoids thận này giống với thận của con người và cung cấp thêm các lợi thế so với các mô hình nghiên cứu thông thường. Ứng dụng của các chất hữu cơ trong thận bao gồm y học tái tạo và các mô hình phát triển, độc tính và bệnh tật. Mặc dù có những tiến bộ trong những năm gần đây, các organoids thận đòi hỏi các giao thức cải tiến và các sửa đổi theo hướng trưởng thành mô, hệ thống mạch máu lưu thông và tích hợp hệ thống thu thập. Tiếp theo, các hệ thống này cần phải phù hợp để cung cấp giá trị bổ sung cho các mô hình nghiên cứu tế bào và động vật thông thường hoặc thậm chí thay thế chúng. Cải thiện các giao thức tạo organoid thông qua kiến ​​thức ngày càng tăng của chúng tôi về sự phát triển thận, kết hợp với việc áp dụng công nghệ nội tạng trên chip, có thể tạo điều kiện và đẩy nhanh quá trình dịch các organoit 3D trong thận sang sử dụng lâm sàng.

Từ: 'Các organoids 3D cho thận để dịch từ đầu giường' củaNavin Gupta và cộng sự

--- J Mol Med (2021) 99: 477–487