Hình ảnh rõ ràng và định lượng thận trong 3D

edmund.chen@wecistanche.com

Trong nhiều thập kỷ, các phép đo củaquả thậngiải phẫu vi mô bằng cách sử dụng 2- phần thứ nguyên đã cung cấp cho chúng tôi kiến ​​thức chi tiết về quả thận hình thái trong điều kiện sinh lý và bệnh lý. Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng của các phương pháp làm sạch mô trong những năm gần đây, kết hợp với sự phát triển của các phương thức hình ảnh chiều 3- mới đã cung cấp những hiểu biết mới vềquả thậnCấu trúc và chức năng. Bài viết đánh giá này mô tả một loạt các thông tin chi tiết mới vềquả thậnphát triển và bệnh tật thu được gần đây bằng cách sử dụng các phương pháp tiếp cận phương pháp mới này. Ví dụ, trongquả thậnnhững cách tiếp cận này đã cung cấp những hiểu biết mới về sự hình thành phân nhánh niệu quản, sự tăng sinh và cam kết của tế bào tiền thân nephron, tương tác giữa tế bào đầu niệu quản và tế bào tiền thân nephron, và sự hình thành phân đoạn nephron. Ở chuột trưởng thành toàn bộthận, làm sạch mô kết hợp với kính hiển vi tấm ánh sáng có thể hình ảnh và định lượng tổng số cầu thận, một bước đột phá lớn trong lĩnh vực này. Các cách tiếp cận tương tự đã cung cấp những hiểu biết mới về cấu trúc của mạch máu thận và độ trong, tái tạo mô kẽ ống thận, sự mất và phì đại tế bào podocyte, sự hình thành u nang, sự tiến hóa của các mào tế bào và cấu trúc của hàng rào lọc cầu thận. Nhiều tiến bộ hơn nữa trong sự hiểu biết vềquả thậnsinh học và bệnh học có thể được mong đợi khi các kỹ thuật bù trừ và hình ảnh bổ sung được phát triển và được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng hơn.

Từ khóa:Hình ảnh 3D; cầu thận; phát triển thận; khoa thận học; dọn mô; hình ống; thận

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL FUCTION

Tổng số nephron ở mỗi người bình thườngquả thậndao động từ khoảng 200, 000 đến hơn 2 triệu, 1 trung bình khoảng 1 triệu. Các nephron này cũng như các thành phần khác củaquả thậnbao gồm ống góp, mạch máu, kẽ và sợi thần kinh được sắp xếp với độ chính xác vi mô tinh tế. 2 Mô hình chính xác này làm nền tảng cho bình thườngchức năng thậnvà sức khỏe, có thể bị xáo trộn nghiêm trọng khi cấu trúc mô bị thay đổi do phì đại hoặc co rút cầu thận hoặc ống thận, mất nephron, bất thường bẩm sinh, hiếm mạch và xơ hóa mô kẽ. Một loạt các phương pháp tiếp cận hình ảnh đã góp phần vào sự hiểu biết toàn diện của chúng tôi vềquả thậncắt bỏ vi mô trong quá trình phát triển và ở người lớn khỏe mạnh và bị bệnhquả thận. Phần lớn, sự hiểu biết này đến từ việc phân tích các mặt cắt 2- chiều (2D) cho dù chúng là mặt cắt vật lý hiển vi ánh sáng hay điện tử hay mặt cắt quang đồng tiêu. Việc định lượng vi phân này hầu hết phụ thuộc vào các phân tích lập thể của các phần đã cung cấp các ước tính về số lượng, chiều dài, diện tích bề mặt và thể tích của cầu thận, ống, mạch, kẽ và các thành phần tế bào của chúng. 3,4 Cho đến gần đây, hình ảnh 3D củaquả thậnvi cấu trúc phần lớn bị giới hạn ở kính hiển vi đồng tiêu, cho phép phân cắt quang học và tái tạo 3D ở độ sâu 50 đến 80 m m. Thật không may, đặc tính khúc xạ của các thành phần protein và lipid trong mô làm phân tán ánh sáng và làm giảm đáng kể chất lượng hình ảnh khi độ sâu tăng lên. Trong những năm gần đây, một loạt các phương pháp làm sạch đã được phát triển để loại bỏ hàm lượng lipid và sắc tố của mô và phù hợp với các đặc tính khúc xạ của mô và phương tiện gắn kết để làm cho mô trở nên trong suốt. 5 Các phương pháp làm sạch có mức độ phức tạp từ ủ mô trong các dung dịch khác nhau trong khoảng thời gian hàng giờ đến các quy trình kéo dài liên quan đến thiết bị điện hóa tùy chỉnh. Chúng tôi hướng người đọc đến các đánh giá gần đây 5,6 để có cái nhìn tổng quan chi tiết về các phương pháp hiện tại và các tài liệu được trích dẫn ở đây cho các phương pháp và trường hợp sử dụng cụ thể.

Các cấu trúc dưới tế bào và toàn bộ quần thể tế bào có thể được phân giải trong toàn bộ các cơ quan hoặc các phần dày. Các tính năng hình ảnh chính xác bên trong mô đã được làm sạch yêu cầu kính hiển vi chuyên dụng và xử lý hình ảnh để thu thập và tái tạo lại dữ liệu thể tích từ các mẫu có kích thước từ hàng trăm micromét đến cm. Kính hiển vi đồng thời quét điểm và quay đĩa đã được sử dụng hiệu quả để hình ảnh các đặc điểm bên trongquả thậnmô nhưng bị giảm độ phân giải theo trục Z và giảm dần cường độ huỳnh quang ở độ sâu do một trục chiếu sáng và hình ảnh. Các kỹ thuật kính hiển vi tấm ánh sáng đặc biệt phù hợp với các mô đã xóa hình ảnh vì chúng cho phép thu thập nhanh các khối lượng 3D lớn và có thể bao gồm chiếu sáng và hình ảnh đa giác. Chụp cắt lớp chiếu quang học là một cách tiếp cận khác kết hợp hình ảnh đa giác và tái tạo kỹ thuật số để tạo ra dữ liệu trong đó các trục X, Y và Z của mỗi voxel có cùng độ phân giải. Bất kể cách tiếp cận cụ thể nào, việc làm sạch mô và hình ảnh toàn bộ gắn kết cung cấp một cơ hội mới để khám phá môi trường vi mô tế bào chưa được tích điện và cấu trúc mô bậc cao. Trong bài đánh giá này, chúng tôi nêu bật một số thông tin chi tiết mới vềquả thậnphát triển, người lớnquả thậncấu trúc và bệnh lý là kết quả của quá trình làm sạch mô, sau đó là phân tích định lượng 3D.

Những hiểu biết mới về sự phát triển của thậnNhiều thập kỷ nghiên cứu hồ sơ biểu hiện gen và nghiên cứu loại trừ đã dẫn đến sự hiểu biết chi tiết về các loại tế bào, mạng lưới điều hòa gen và các con đường tín hiệu kiểm soát động vật có vúquả thậnsự phát triển. Kiến thức này cung cấp thông tin chẩn đoán bệnh bẩm sinh và cho phép sản xuấtquả thậncác loại tế bào từ tế bào gốc đa năng. 7 Tuy nhiên, kích thước, độ mờ và độ phức tạp của việc phát triểnquả thậnđã đưa ra một rào cản đáng kể đối với việc đo lường chính xác sự phát sinh hình thái của cơ quan này và sự phân bố 3D của các tế bào và protein bên trong nó. Ứng dụng của việc làm sạch mô và hình ảnh đa tỷ lệ trongquả thậnđã cho phép hình dung và phân tích định lượng sự hình thành phân nhánh niệu quản, quần thể tế bào tiền thân, và sự sản sinh nephron trong các cơ quan nguyên vẹn (Hình 1). 8 Các phương pháp tiếp cận này tạo nền tảng cho một năng lực mới để xác định kiểu hình chính xác và mở ra các con đường để phân tích các trình điều khiển tế bào và phân tử củaquả thậnphát triển và bệnh bẩm sinh.

Hình ảnh và phân tích hình thái phân nhánh trong 3D.Sự hình thành cây niệu quản là một đặc điểm xác định củaquả thậnphát triển và đã được nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng di truyền chuột và làm phẳngquả thậncác nền văn hóa cấy ghép. Tuy nhiên, việc hiểu được cách thức các gen riêng lẻ góp phần vào sự phát triển, hình thức và khuôn mẫu của cấu trúc ống biểu mô phân nhánh này trong cơ thể sống đòi hỏi khả năng hình ảnh và phân tích mạng lưới phức tạp này trên một loạt các kích thước mẫu. Ngắn và cộng sự. 8 đã giải quyết những vấn đề này bằng cách sử dụng miễn dịch huỳnh quang toàn bộ ngàm, làm sạch dựa trên dung môi (benzyl alcohol benzyl benzoate) và chụp ảnh toàn bộ các cơ quan bằng chụp cắt lớp chiếu quang học. Sử dụng phương pháp này để chụp ảnh chụp nhanh 3D từ sớm đến giữaquả thậnphát triển, nhóm đã phát triển phần mềm phân tích tùy chỉnh để thu được chi tiết chưa từng có về cây niệu quản bao gồm số đầu nhọn, góc và chiều dài nhánh, thể tích nhánh và số thế hệ phân nhánh từ cây niệu quản còn nguyên vẹn (Hình 1c và d). 8 Ban đầu được sử dụng để mô tả và xác định các khía cạnh mới của sự phân nhánh ở thận, 9,10 những nỗ lực liên tục tìm cách xác định các nguyên tắc và cơ chế điều chỉnh chính chi phối sự phân nhánh in vivo. 1

Liên kết động lực học tiền nhân với hình thái cơ quan bằng hình ảnh đa cấp.Tương tác phân tử giữa tế bào đầu niệu quản và tế bào tiền thân nephron đóng một vai trò quan trọng trong việc thiết lập sự bổ sung của nephron tạo điều kiện chochức năng thậntrong cuộc sống trưởng thành. Các progenit nephron không được tạo ra các yếu tố thúc đẩyquả thậnsự phát triển thông qua sự phân nhánh của niệu quản trong khi các dấu hiệu hạn chế về mặt không gian trong đầu niệu quản đều duy trì trạng thái tiền thân nephron và tạo ra một tập hợp con của các tiền nhân này để biệt hóa thành nephron sơ khai. Những tương tác này thúc đẩy một chu kỳ phân nhánh và cảm ứng nephron chấm dứt xung quanh quá trình sinh, khi các tiền nhân nephron còn lại phân biệt. Trước khi có các phương pháp làm sạch mô, sự hiểu biết của chúng tôi về động lực củaquả thậnsự phát sinh hình thái và sự phong phú tương đối của các quần thể tế bào tiền thân theo thời gian bị hạn chế nghiêm trọng. Điều này đã thay đổi với sự phát triển của các phương pháp tiếp cận hình ảnh đa tỷ lệ sử dụng các giao thức miễn dịch huỳnh quang mở rộng, làm sạch mô và các phương pháp tiếp cận hình ảnh để định lượngquả thậnphát triển ở cấp độ tế bào (đồng tiêu) và toàn bộ cơ quan (chụp cắt lớp chiếu quang học, tấm ánh sáng). 9,10 Rõ ràng là tỷ lệ củaquả thậntốc độ tăng trưởng thay đổi đáng kể với tốc độ phân nhánh và tăng sinh nhanh ban đầu giảm dần trong các giai đoạn tương quan với việc giảm số lượng tế bào tiền thân trong niche nephrogenic. 10 Hình ảnh đồng tiêu ba chiều của toàn bộ bào thai người đã được xóathận(tuần 11) hoặc các mẫu từquả thậnvỏ não (tuần 11–23) khẳng định rằng sự giảm kích thước ngách này được bảo tồn giữa các loài. 12 Phân tích so sánh sâu hơn về ngách sinh nephrogenic của người và chuột trong mô đã được làm sạch đã dẫn đến một mô hình tuyển dụng dựa trên thời gian mới về sự hình thành nephron, trong đó các tế bào tiền thân được thêm dần vào một nephron ban đầu và áp dụng nhận dạng phân đoạn theo thứ tự mà chúng đến . 13 Trong một nghiên cứu khác tập trung vào cam kết tiền thân của nephron, một phương pháp làm sạch mô dựa trên hydrogel (Hình ảnh cứng rắn được trao đổi Acryl-amide-hybrid hóa cứng được Clear Lipid thụ động / Nhuộm miễn dịch / Lai tại chỗ tương thích Mô-hYdrogel [CLARITY] 14) đã được sử dụng cho khả năng giữ lại huỳnh quang của một phóng viên tdTomato nội sinh. Phân tích ghi nhãn tdTomato trong mô đã được làm sạch cho thấy rằng các tế bào trong nephron cam kết ban đầu có thể trở lại trạng thái nguyên sinh, nơi mà các kết quả trước đó đề xuất cam kết là đơn hướng. 15 Do đó, việc dọn sạch mô đã nâng cao hiểu biết của chúng ta về các quá trình phát triển năng động trên các quy mô và loài.

Kiểu hình chính xác. Những tiến bộ trong việc làm sạch mô và phân tích định lượng đã cho phép một năng lực mới để định kiểu chính xác. Những thay đổi mạnh mẽ về mặt thống kê trong phân nhánh và số lượng nephron đã được xác định trong các mô hình chuột có kiểu hình tinh tế như Ret þ /? và Six2 þ /? chuột (Hình 2), trước đây được phân loại là "bình thường". 10,16 Hình ảnh tiêu điểm có độ phân giải cao của Wnt11 đã xóa? /?thậnđã xác định được một kiểu hình tế bào mới trong đó các tiền sinh tố nephron có vẻ vô tổ chức do không có khả năng hình thành các gắn kết tế bào ổn định với đầu niệu quản và biệt hóa sớm. 17 Các phương pháp này cũng đã được sử dụng để định lượng mức độ ảnh hưởng của các chất điều hòa mới của trạng thái tế bào tiền thân nephron như DNA methyltransferase 1, microRNA Lin28 và Let7, và TSC1.quả thậnsự phát triển và số nephron. 18–20 Kiểu hình chính xác có khả năng trở thành một công cụ quan trọng trong nỗ lực của chúng tôi để hiểu tác động cộng gộp của các yếu tố di truyền và môi trường góp phần vào số lượng nephron thấp và khuynh hướng mắc bệnh mãn tínhbệnh thận.

Mô hình toán học củaquả thậnsự phát sinh hình thái. Dữ liệu được tạo ra từ việc phát triển đã xóaquả thậnđang thúc đẩy một làn sóng mô hình toán học dựa trên hình ảnh cố gắng phân biệt cách hình thức vĩ mô và chức năng của mô phát sinh từ các tương tác phân tử giữa các quần thể tế bào tiền thân. 11,21–23 Ứng dụng sâu hơn của hình ảnh toàn bộ cơ quan trong mô đã xóa sẽ rất quan trọng để hiểu các trình điều khiển phân tử và tế bào của mô hình mô 3D và có thể giữ chìa khóa để cải thiện cấu trúc và độ chính xác của các mô hình tế bào gốc củaquả thận.

Hình thái 3D và bệnh lý của thận người lớnHình thái phức tạp của người lớnquả thậnhạn chế việc sử dụng các công cụ hình thái 2D vì chúng có thể truyền đạt nhận thức không đầy đủ hoặc sai lệch về cấu trúc 3D. Ở đây, chúng tôi thảo luận về một số tiến bộ quan trọng về phương pháp luận trong những năm gần đây cho phép phân tích 3D mạnh mẽ các cấu trúc ở người lớnquả thận, từ nguyên vẹnthậnđến các thành phần của hàng rào lọc cầu thận (Hình 3). 2

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI

Số lượng và kích thước Nephron.Con ngườiquả thậncho thấy mức độ cao của sự thay đổi trong và giữa các đối tượng về số lượng và khối lượng nephron, đã được mô tả trong các nghiên cứu khám nghiệm tử thi từ các đối tượng mà không công khaibệnh thận1,30,31 và có liên quan đến rối loạn phát triển. Trong nhiều thập kỷ, công cụ tiêu chuẩn vàng để định lượng số lượng nephron trong các mẫu thí nghiệm và trên người là phương pháp phân đoạn / bệnh nhân, một phương pháp lập thể dựa trên thiết kế. 3,4 Mặc dù cách tiếp cận này là chính xác và chính xác, nhưng nó cũng thực hành, tốn thời gian và đòi hỏi sự đào tạo đáng kể. Vì lý do này, các phương pháp tiếp cận thay thế đã được đề xuất để đưa ra các phương pháp hiệu quả có thể cung cấp các điểm cuối chất lượng cao: 32 ví dụ, kết hợp các phương pháp làm sạch quang học, bao gồm kỵ nước (trước đây được gọi là dựa trên dung môi), ưa nước hoặc dựa trên hydrogel, với nâng cao kính hiển vi ánh sáng (ví dụ: đồng tiêu, đa photon, hoặc tấm sáng).

Theo hiểu biết của chúng tôi, báo cáo đầu tiên kết hợp giữa quang học bù trừ và kính hiển vi tấm ánh sáng để phân tích số lượng và kích thước nephron đã được xuất bản bởi Klingberg và cộng sự. 24 trong một bài báo mang tính bước ngoặt có nhiều tiến bộ quan trọng. Đầu tiên, báo cáo này đã giới thiệu ethyl cinnamate, một dung môi không nguy hiểm có thể thay thế các hóa chất độc hại như benzyl alcohol – benzyl benzoate, cho đến lúc đó vẫn thường xuyên được sử dụng trong các quy trình làm sạch kỵ nước. Thứ hai, các nhà điều tra thực hiện đếm nephron ở chuột còn nguyên vẹnthận tôin một mô hình tích cực và tiến bộ của trung gian miễn dịchbệnh thận, xác định mất nephron trong quá trình bệnh. Ngoài ra, các bước quan trọng đối với tự động hóa máy tính hóa các thuật toán phân đoạn hình ảnh đã được giới thiệu, cung cấp một con đường để cải thiện hiệu quả đáng kể. Gần đây, Østergaard et al. . Hơn nữa, nghiên cứu này cho thấy việc ghi nhãn chức năng trang nhã của tubuli gần thông qua tiêm albumin in vivo để hình dung điểm nối của cầu thận và một quy trình đơn giản cho mô bệnh học tương quan trong cùng một mẫu đã được làm sạch quang học. Báo cáo này cho thấy tính linh hoạt của các giao thức này, những giao thức này đang trở thành các đường ống dẫn nhiều lớp cho việc lập hồ sơ mô toàn diện.

Tăng cường mạch máu và nội tạng của thận.Theo dõi dấu vết của mạch máu hoặc sợi thần kinh phân nhánh ở người lớnquả thậnhầu như không thể xảy ra trong mô học thông thường 2D vì kích thước của cơ quan và sự phức tạp của sự phân bố cấu trúc đòi hỏi sự phân chia nối tiếp rộng rãi và chuyên nghiệp. Gần đây, Huang et al. 33 đã báo cáo một chất nhuộm huỳnh quang hồng ngoại gần cation (MHI 148- PEI) để ghi nhãn đặc biệt cho các mạch máu, có thể được kết hợp với một quy trình thanh toán bù trừ nhanh và được sửa đổi dựa trên ethyl cinnamate để rút ngắn thời gian xử lý mô. Cách tiếp cận này mở ra con đường mới cho nghiên cứu mạch máu trongquả thận,đặc biệt là khi yêu cầu hình ảnh độ phân giải cao ở chế độ 3D. Tương tự, Hasegawa et al. 26 đã sử dụng Cocktail rõ ràng không có cấu trúc của não / cơ thể và phân tích tính toán (CUBIC) cùng với hệ thống kính hiển vi ánh sáng được xây dựng tùy chỉnh để xác định sự phân bố của nội tâm giao cảm trong thận chuột còn nguyên vẹn. Các dây thần kinh giao cảm chủ yếu phân bố xung quanh các động mạch. Sau 10 ngày bị thiếu máu cục bộ hoặc chấn thương tái tưới máu, mật độ nội chất giao cảm đã giảm đáng kể, tương quan với việc giảm nồng độ norepinephrine trongmô thận. Những thay đổi này một phần vẫn tồn tại 28 ngày sau chấn thương ban đầu, cho thấy rằng những thay đổi giao cảm liên tục có thể được tìm thấy trong quá trình tiến triển của bệnh mãn tínhbệnh thận.

Tu sửa phần ống dẫn.Hệ thống ống thận đặc biệt khó phân tích dưới dạng 3D. Hình thái phức tạp và phức tạp đặt ra nhiều thách thức đối với các phương pháp thông thường dựa trên phân cắt nối tiếp và kính hiển vi ánh sáng tiêu chuẩn. Tuy nhiên, quá trình bù trừ quang học cho phép phân tích các tubuli nguyên vẹn và vi môi trường xung quanh của chúng. Saritas và cộng sự. . Các nhà nghiên cứu đã định lượng sự tăng sản ống và phát hiện sự gia tăng các tế bào tăng sinh trong tubulointerstitium. Nghiên cứu này sử dụng tính linh hoạt của cả bù trừ quang học và

Hình 3|Hình thái ba chiều (3D) ở thận người lớn. (a) Đếm nephron trong toàn bộ thận bằng cách sử dụng mã CD31 của các tế bào nội mô. Bảng điều khiển hiển thị bản tái tạo 3D (bên trái), phần quang học ở chế độ xem hai chiều (2D) (ở giữa) và các khu vực đặc biệt hiển thị các cầu thận đơn khi so sánh giữa kính hiển vi tấm nhẹ (LSFM) và tiêu điểm và 2- kính hiển vi photon (2P). Được điều chỉnh với sự cho phép của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, từ Tạp chí Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, Đánh giá hoàn toàn tự động về Tổng số cầu thận và kích thước ống mao mạch ở thận hư bằng phương pháp soi kính hiển vi, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al ., tập 28, tập 2, 2 0 17; sự cho phép được truyền đạt thông qua Trung tâm Giải phóng Bản quyền, Inc. 24 (b) Định kích thước cầu thận có đăng ký không gian — mã hóa màu thể hiện kích thước cầu thận, trong đó màu đỏ là vật thể lớn nhất và màu hồng là vật thể nhỏ nhất. Được điều chỉnh với sự cho phép của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, từ Kidney36 0, Phân tích hình ảnh tự động về sự phì đại cầu thận trên mô hình chuột về bệnh thận do tiểu đường, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., Tập 6, số 6 , Năm 2020; sự cho phép được truyền đạt thông qua Trung tâm thanh toán bản quyền, Inc. Phỏng theo Kidney International, tập 96, số 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Phân tích ba chiều toàn diện (CUBIC-thận) hình dung các dây thần kinh giao cảm thận bất thường sau chấn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu, trang 129–138, Bản quyền ª 2019, với sự cho phép của Hiệp hội Thận học Quốc tế. 26 (d) Phép đo hình thái tế bào bạch cầu trong các cầu thận riêng lẻ bằng cách sử dụng nhãn miễn dịch cho điểm đánh dấu p57 (màu xanh lá cây) và điểm đánh dấu DNA 4 0, 6- diamidino -2- phenylindole (DAPI). Các bảng hiển thị (trái) tái tạo 3D và (phải) các bề mặt được kết xuất. Được điều chỉnh với sự cho phép của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, từ Tạp chí Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, Xác nhận Phương pháp Ba chiều để Đếm và Định kích thước các tế bào nang ở Toàn bộ Cầu thận, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., tập 27, số 10, 2016; sự cho phép được truyền đạt thông qua Trung tâm xóa bản quyền, Inc. 27 (e) Động lực học tế bào bằng cách sử dụng truy tìm dòng dõi, hiển thị tế bào podocytes (ngoài cùng bên trái), tế bào biểu mô thành (PEC) tạo thành các nếp gấp tế bào ở chế độ 3D (giữa bên trái), chế độ xem 2D của PEC xâm nhập cầu thận bên có tổn thương mạch máu (giữa bên phải), và hình ảnh 2D của đầu ra ống (ngoài cùng bên phải). Phỏng theo Kidney International, tập 96, ấn bản 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Phân tích 3D tiểu thuyết bằng cách sử dụng tài liệu xóa mô quang học về sự tiến triển của bệnh viêm cầu thận tiến triển nhanh ở chó, trang 505–516, Copyright ª 2019, International Hiệp hội Thận học, theo giấy phép CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Hình dung màng chắn khe ở độ phóng đại tăng dần từ trái sang phải. Phỏng theo Kidney International, tập 99, số 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Một giao thức làm sạch và sưng nhanh chóng và đơn giản để tạo hình ảnh 3D tại chỗ của thận trên các quy mô, trang 1010–1020 , Bản quyền ª 2021, Hiệp hội Thận học Quốc tế, theo giấy phép CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Để tối ưu hóa việc xem hình ảnh này, vui lòng xem phiên bản trực tuyến của bài viết này tạiwww.kidney-international.org.

kính hiển vi ánh sáng để thực hiện phân tích hình ống trong thận còn nguyên vẹn bằng cách sử dụng phương pháp nhúng hydrogel và kính hiển vi tấm sáng, cũng như định lượng tế bào đơn trong các lát thận bằng phương pháp xóa kỵ nước và kính hiển vi đồng tiêu, vì mỗi sự kết hợp phù hợp hơn với câu hỏi nghiên cứu cụ thể. Tahaei et al. 35 người đã mô tả tính lưỡng hình giới tính trong chiều dài của ống lượn xa, có thể xác định khả năng thích ứng với căng thẳng sinh lý của nó, và Schuh et al. 36 người đã tiết lộ sự khác biệt theo trục trong việc hấp thu phối tử ống lượn gần và chức năng nội bào tử, làm nổi bật rằng đoạn S1 rất chuyên biệt để tái hấp thu protein thông qua quá trình nội bào qua trung gian thụ thể. Trong một nghiên cứu gần đây, Blanc et al. 2 đã phân tích một mô hình hình thành u nang, cho thấy rằng các u nang chỉ phát triển trong các đoạn nephron cụ thể, xác định hình dạng của chúng và nằm tiếp giáp với các ống không có giãn nở bình thường. Nhìn chung, bây giờ chúng ta có nhiều ví dụ về ứng dụng trực tiếp của bù trừ quang học để phân tích một cách có hệ thống khoang tubulointerstitial.

Mất và phì đại podocyte.Cầu thận cung cấp một ví dụ duy nhất để phân tích các đơn vị chức năng nguyên vẹn trong một cơ quan. Đặc biệt, việc nghiên cứu sự suy giảm tế bào trứng đã được hưởng lợi trực tiếp từ những tiến bộ công nghệ này vì các phương pháp luận dựa trên thiết kế tiêu chuẩn vàng đòi hỏi sự đầu tư đáng kể về thời gian và nguồn lực. 37 Công cụ đầu tiên để phân tích hình thái tế bào podocyte 3D của các cầu thận chuột còn nguyên vẹn kết hợp ghi nhãn miễn dịch củaquả thậncác lát cắt bằng cách sử dụng một quy trình đã sửa đổi bao gồm chất cản quang miễn dịch gián tiếp, xóa quang học kỵ nước và kính hiển vi tiêu điểm, tạo điều kiện thuận lợi cho việc định lượng tổng số podocyte trong toàn bộ cầu thận riêng lẻ với thể tích đã biết. Chúng tôi tin rằng cách tiếp cận này là lý tưởng để nghiên cứu các quá trình ảnh hưởng đến một tập hợp con cụ thể của cấu trúc (ví dụ: mất tế bào podocyte dẫn đến xơ cứng cầu thận khu trú và phân đoạn). 27 Kỹ thuật tương tự sau đó đã được áp dụng để mô tả vai trò của phì đại tế bào podocyte như một phản ứng bù đắp sau khi mất tế bào podocyte, một cơ chế được thực hiện qua đường truyền tín hiệu rapamycin mục tiêu ở động vật có vú. 38 Trong khi 2 nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích tế bào podocyte cầu thận, đường ống này dựa trên nhãn miễn dịch thông thường có thể được sử dụng để mô tả các thay đổi hình thái của bất kỳ loại tế bào nào ở độ phân giải không gian cao.

Sự tiến hóa của crescents tế bào.Một công cụ quan trọng khác cần được tích hợp thành công vào hộp công cụ cho 3Dquả thậnhình thái là sự truy tìm dòng dõi di truyền. Hầu hết các phương pháp bù trừ quang học có xu hướng tạo ra một mức độ dập tắt huỳnh quang nhất định (thay đổi từ nhẹ đến nặng). 6 Gần đây, chúng tôi đã trình bày một giao thức kết hợp truy tìm dòng dõi, xóa quang học và kính hiển vi đa photon để phân tích toàn diện sự mất tế bào podocyte và kích hoạt tế bào biểu mô thành. 28 Trong nghiên cứu này, mất tế bào podocyte được xác định là một đặc điểm của bệnh viêm thận lưỡi liềm thực nghiệm bằng cách sử dụng nhãn trao đổi chất của tế bào podocytes với protein huỳnh quang màu xanh lá cây tăng cường. Sự tiến hóa của các nốt khuyết tế bào được hình dung và định lượng dựa trên sự tăng sinh và di chuyển của các tế bào biểu mô thành, chúng cũng được đánh dấu bằng protein huỳnh quang màu xanh lá cây tăng cường và được theo dõi trong suốt quá trình của một mô hình thí nghiệm về bệnh viêm thận hình lưỡi liềm. Phân tích các cầu thận còn nguyên vẹn cho phép xác định sự mất tế bào tiêu điểm và hình thành tổn thương, tiến triển thành tắc ống bởi các tế bào biểu mô thành, dẫn đến hình thành các tiểu cầu thận. Nghiên cứu này mở đường cho các nghiên cứu trong tương lai về các tương tác biểu mô-miễn dịch phức tạp bên trongthận.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN PHÂN TÍCH KIDNEY / RENAL

Hàng rào lọc cầu thận.Một công cụ chẩn đoán quan trọng để đánh giá thường quy các bệnh cầu thận là phân tích siêu cấu trúc của sinh thiết thận bằng kính hiển vi điện tử. Một giải pháp thay thế cho kính hiển vi điện tử có thể được tìm thấy trong lĩnh vực kính hiển vi mở rộng, theo định nghĩa là nhằm mục đích tăng độ phân giải quang học bằng cách tăng kích thước mô. Trong những năm qua, Unnersjo-Jess et al. 39,40 đã cung cấp nhiều giao thức để hình dung các cấu trúc kích thước nano trongquả thận.Gần đây, các nhà điều tra này đã báo cáo một quy trình nhanh chóng và đơn giản để hình dung 3Dquả thậnhình thái học, kết hợp các khái niệm bù trừ quang học và mở rộng mô để phân giải cấu trúc kích thước nano bằng cách sử dụng kính hiển vi đồng tiêu thông thường. 29 Giao thức này được áp dụng để hình dung và định lượng nhiều đặc điểm bệnh lý ở chuột và ngườiquả thậnsinh thiết bao gồm quá trình giãn nở ở chân, sự thay đổi của màng đáy cầu thận, chiều dài cơ hoành, lắng đọng IgG và các đặc điểm bệnh lý cổ điển (ví dụ: bệnh xơ cứng cầu thận, xơ hóa mô kẽ và teo ống thận). Tóm lại, phương pháp này cho phép hình dung và định lượng bệnh lý thận đa cấp độ bằng một phương pháp đơn giản và các công cụ phân tích hình ảnh dễ tiếp cận. Khả năng mở rộng và áp dụng của phương pháp này trong thực hành lâm sàng có thể sẽ được xác định bởi sự cần thiết của thiết bị hiển vi ánh sáng tiên tiến và sự phát triển của các công cụ phân tích hình ảnh tự động.

Sự kết luận

Phổ hiện tại của các phương pháp làm sạch mô bao gồm các kỹ thuật đơn giản có thể được thực hiện trong hầu hết các phòng thí nghiệm để cải thiện hình ảnh 3D trên các kính hiển vi thông dụng. Khi các cơ hội được tạo ra bởi các phương pháp tiếp cận mới này trở nên rõ ràng, chúng tôi dự đoán sự tiếp nhận rộng rãi hơn của các hệ thống kính hiển vi chuyên dụng để hình ảnh hiệu quả các mô được làm sạch ở độ phân giải cao và phát triển các quy trình nghiên cứu và lâm sàng phù hợp để giải quyết các câu hỏi cụ thể. Lĩnh vực khoa học thần kinh đã đóng vai trò như một nền tảng thử nghiệm cho các ứng dụng và phương pháp hình ảnh mô đã rõ ràng. Phân tích hình ảnh tự động, các phương pháp tiếp cận mới để nghiên cứu kết nối tế bào và các dự án tập bản đồ biểu hiện gen và protein trên toàn mô đã được phát triển trong bối cảnh này. Có khả năng là các phương pháp tiếp cận tương tự sẽ mang lại những hiểu biết mới về giải phẫu tế bào và sự phụ thuộc lẫn nhau của các quần thể tế bào ở người đang phát triển và trưởng thànhquả thận.

Những hạn chế thực tế đối với những tiến bộ này bao gồm chi phí phần cứng chụp ảnh và những khó khăn trong việc xử lý, lưu trữ và phân tích các tập dữ liệu lớn. Các hạn chế khác nảy sinh do sự thiếu khả năng tái tạo của quá trình nhuộm với các mô bị ảnh hưởng khác nhau bởi các điều kiện cố định và ghi nhãn kháng thể. Do đó, cần có các phân tích 3D mới được đánh giá nghiêm túc và so sánh với các phương pháp đã được thiết lập. Mặc dù có những tiến bộ ấn tượng trong việc đánh giáquả thậnphát triển và trưởng thànhquả thậncấu trúc và bệnh tật được nêu bật trong bài đánh giá này, chúng tôi tin rằng điều tốt nhất của việc dọn sạch mô và hình ảnh 3D vẫn chưa ra đời và có khả năng là một lĩnh vực phát triển thú vị choquả thậnnghiên cứu trong nhiều thập kỷ tới.