2.6. Biểu thức của Caspase-3 và Caspase-6

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Bấm vào đây để biết Cistanche Tubulosa để chống oxy hóa

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Chuột TgAPP cho thấy sự gia tăng biểu hiện gen caspase{{0}} (Hình 8C1, H1), đáng kể và lớn hơn 30 phần trăm so với hồi hải mã của chuột WT (Hình 8H1; p < 0,05). Đối với biểu hiện caspase-6, không có sự khác biệt nào được ghi nhận giữa chuột biến đổi gen và chuột không chuyển gen (Hình 8C2, H2).

Các phương pháp điều trị bằng quercetin và rutin có thể làm giảm mức mRNA caspase{{0}} ở vùng hải mã một cách có ý nghĩa thống kê (Hình 8H1; p < 0.05), với tỷ lệ ức chế khoảng 17 phần trăm và 27% tương ứng đối với chuột cái và chuột đực. Ở vỏ não, sự khác biệt đáng kể chỉ được quan sát thấy khi điều trị bằng rutin ở nam giới (Hình 8C1; p < 0,05).

Về caspase-6, các phương pháp điều trị bằng quercetin và rutin không gây ra bất kỳ ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê nào đối với vỏ não hoặc vùng hải mã (Hình 8C2, H2), mặc dù sau này, Caspase-6 ở nam giới TgAPP có xu hướng giảm (Hình 8H2).

2.7. Dấu hiệu viêm

Các kết quả thu được về biểu hiện gen của các chất trung gian gây viêm IL-1 , TNF- và IFN- được thể hiện trong Hình 9.

Trong TgAPP, có sự gia tăng đáng kể biểu hiện gen IL{{0}} khoảng 20 phần trăm ở vỏ não và vùng hải mã ở cả hai giới so với chuột WT (Hình 9C1, H1; p < 0,05). Đối với TNF- , mặc dù mức độ mRNA cao hơn được thể hiện trong TgAPP, nhưng chúng không có ý nghĩa thống kê ở chuột WT (Hình 9C2, H2). Về IFN- , biểu hiện của nó ở nam giới tăng khoảng 30 phần trăm, chỉ có ý nghĩa thống kê ở vỏ não (Hình 9C3; p < 0,05).

Phương pháp điều trị bằng quercetin và rutin, ở cả con cái và con đực, đều có thể làm giảm biểu hiện IL{{0}} ở vỏ não và vùng hải mã so với chuột TgAPP kiểm soát (Hình 9C1, H1; p < {{8 } }.05), thu được các giá trị tương tự như giá trị của chuột WT, và đặc biệt thấp hơn ở vùng hải mã của chuột đực (Hình 9H1; p < 0,05).

Hiệu quả tổng thể của cả hai phương pháp xử lý flavonoid đối với biểu hiện IL{{0}} không được ghi nhận với TNF- cũng như với INF- . Do đó, nam giới TgAPP, sau khi điều trị bằng quercetin, đã giảm đáng kể TNF- vùng hồi hải mã (Hình 9H2; p < 0.05) và biểu hiện IFN- ở vỏ não (Hình 9C3; p < 0,05).

2.8. Đánh giá các tế bào thần kinh thoái hóa và dự báo của chúng

Không có dấu hiệu thoái hóa thần kinh đặc trưng nào được quan sát thấy ở độ tuổi thử nghiệm chuột TgAPP biến đổi gen, so với chuột WT, cũng như các phương pháp điều trị bằng quercetin và rutin không cho thấy bất kỳ thay đổi nào trong 4 tuần so với TgAPP (Hình S1, dữ liệu bổ sung).

2.9. Biểu hiện của thụ thể ionotropic glutamate

Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong biểu hiện thụ thể, so sánh các giá trị thu được ở chuột TgAPP đối chứng với giá trị thu được ở chuột WT. Cũng không có tác dụng đáng chú ý nào đối với sự biểu hiện của các thụ thể hướng ion này khi có điều trị bằng quercetin hoặc rutin (Bảng S5, dữ liệu bổ sung).

3. Thảo luận

Mục đích của nghiên cứu hiện tại của chúng tôi là đánh giá tác động của hai flavonoid, quercetin và rutin, ở giai đoạn đầu tiên của quá trình sinh bệnh AD, bất kể ảnh hưởng của chúng đối với sự thoái hóa thần kinh và/hoặc chức năng nhận thức. Vỏ não và hồi hải mã là những vùng não được phân tích, vì chúng là những cấu trúc não bị ảnh hưởng nhiều nhất trong AD. Cần lưu ý rằng quercetin và rutin được sử dụng thông qua chế độ ăn kiêng có công thức chứa một trong hai flavonoid, để bắt chước, trong mô hình động vật AD, chế độ ăn uống lành mạnh của con người, có chứa một thành phần hoạt tính.

Cụ thể, các APPswe gen chuyển trong chuột C57B6 có tác động đáng kể đến tỷ lệ GSH/GSSG, mức MDA, khả năng của enzyme chống oxy hóa, biểu hiện APP, hoạt động BACE1 và biểu hiện caspase-3 và IL-1. Trong khi các đột biến APP ở người thường dẫn đến AD điển hình, chúng chủ yếu liên quan đến bệnh lý amyloid duy nhất ở chuột chuyển gen APP và không có sự thoái hóa thần kinh đáng chú ý [14,15], vì không có dấu hiệu đặc trưng nào được quan sát thấy ở chuột chuyển gen TgAPP của chúng tôi, trái ngược với chuột WT (Dữ liệu bổ sung, Hình S1). Việc nhuộm ngược với 40 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) của tế bào thần kinh hồi hải mã cho phép chúng tôi quan sát hình thái hạt nhân, vì hợp chất này là thuốc nhuộm huỳnh quang cho axit nucleic. Chúng tôi không quan sát thấy các hạt nhân bị phân mảnh hoặc hình thùy, điển hình là apoptotic; chúng tôi cũng không quan sát thấy bất kỳ sự khác biệt đáng chú ý nào khi so sánh các phần mô học hồi hải mã của dòng biến đổi gen kiểm soát TgAPP liên quan đến các phần WT; chúng tôi cũng không quan sát thấy bất kỳ sự khác biệt nào giữa các phương pháp điều trị bằng quercetin và rutin liên quan đến chuột TgAPP đối chứng.

Trong bảng phân tích các đặc tính sinh hóa của AD, chúng tôi tập trung chủ yếu vào việc xác định tỷ lệ GSH/GSSG đối với một trong hai chế độ ăn flavonoid, vì sự suy giảm nồng độ GSH là một trong những dấu hiệu sinh hóa ban đầu quan trọng nhất trong AD [16,17 ] và đã được quan sát thấy trong quá trình sinh bệnh học và tiến triển của bệnh. Đo nồng độ GSH trong não [18] và gần đây hơn là nồng độ GSH trong máu [19] hứa hẹn là dấu hiệu chẩn đoán cho giai đoạn đầu của AD. Hơn nữa, những nỗ lực cũng đã được thực hiện để bổ sung các kho dự trữ GSH nội sinh hoặc tiền chất của chúng [20–22]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự suy giảm khả năng khử tế bào (GSH/GSSG) đã được quan sát thấy ở chuột TgAPP liên quan đến động vật WT, ở cả nam và nữ, và ở cả hai vùng não. Ở vỏ não và hồi hải mã của cả chuột WT và TgAPP, tỷ lệ GSH/GSSG ở con đực thấp hơn ở con cái. Chế độ ăn quercetin và rutin làm tăng đáng kể tỷ lệ GSH/GSSG so với chuột TgAPP không được điều trị, và sự gia tăng này rõ rệt hơn ở vùng hải mã. Những thay đổi về mức độ GSH và GSSG và tỷ lệ GSH/GSSG khi điều trị bằng quercetin hoặc rutin ở nam giới, liên quan đến việc tăng khả năng oxy hóa khử, nổi bật hơn ở nữ giới. Kết quả từ các quyết định của chúng tôi có thể tiết lộ một cơ sở quan trọng làm cơ sở cho sự khác biệt liên quan đến giới tính ở chuột Tg2576 về tính nhạy cảm đối với tổn thương oxy hóa của các đại phân tử trên một mặt, vì hệ thống glutathione là chất khử linh hoạt trong nhiều chức năng sinh học và tác động ngăn ngừa Mặt khác, chế độ ăn kiêng flavonoid trong việc khôi phục tình trạng sinh lý của nó. Như chúng ta sẽ thấy trong suốt cuộc thảo luận này, chúng tôi đã đặt mức tăng tỷ lệ GSH/GSSG làm trục chính có thể giải thích tập hợp các hiệu ứng được quan sát thấy ở chuột TgAPP.

Gần đây, người ta đã đề xuất rằng tỷ lệ GSH/GSSG, thay vì chỉ hoạt động như một bộ đệm oxi hóa khử, thay vào đó sẽ hoạt động như một cơ chế điều hòa chính, cho phép các protein đạt được cấu trúc và chức năng tự nhiên của chúng bằng cách kiểm soát chặt chẽ sự cân bằng thiol-disulfide của tế bào. proteome. Nói tóm lại, hệ thống glutathione phát sinh là điều cần thiết để bảo tồn một hệ protein khỏe mạnh, cho thấy rằng sự phá vỡ cân bằng nội môi oxi hóa khử glutathione (nghĩa là về mặt di truyền hoặc dược lý) làm tăng tổng hợp protein do rối loạn hiệu quả của quá trình tự thực [23]. Do đó, các chiến lược nhằm duy trì cân bằng nội môi oxi hóa khử glutathione có thể có tiềm năng điều trị các bệnh liên quan đến tổng hợp protein, chẳng hạn như AD. Liên quan chặt chẽ đến việc bảo tồn hệ protein là bộ máy thoái hóa đáng tin cậy ubiquitin, có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của AD. Proteasome làm suy giảm một cách chọn lọc nhiều chất nền rất quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi tế bào thần kinh, bao gồm cả quá trình dị hóa các protein bị oxy hóa và tổng hợp. BACE1 trải qua quá trình phổ biến và người ta đã chứng minh rằng việc ngăn chặn con đường đáng tin cậy của ubiquitin sẽ ức chế sự thoái biến của BACE1 và do đó dẫn đến tăng sản xuất hoạt tính enzym BACE1, sản phẩm phân tách C99 nhiều hơn và tăng ở cả A 1-40 và A { {8}} trong các tế bào thần kinh và không phải tế bào thần kinh [10]. Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã phát hiện ra rằng cả flavonoid, quercetin và rutin đều ảnh hưởng đến các con đường truyền tín hiệu và mạng lưới phân tử khác nhau liên quan đến sự điều biến chức năng proteasome trong các tế bào u nguyên bào thần kinh [9]. Ngoài ra, người ta đã chứng minh rằng các tế bào thần kinh được bổ sung glutathione khử (GSH) đã phục hồi hoạt động đáng tin cậy và giảm sự hình thành tập hợp [11] do chức năng đáng tin cậy được điều chỉnh theo trạng thái oxy hóa khử [24]. Do đó, sự gia tăng tỷ lệ GSH/GSSG mà động vật trải qua khi có chế độ ăn quercetin hoặc rutin phù hợp với sự điều biến proteasome bởi quercetin và rutin, đã được chứng minh ex vivo trước đây.

Như đã đề cập trước đây, sự mất cân bằng oxy hóa khử dẫn đến các protein bị biến đổi oxy hóa cao có xu hướng tích lũy và tạo ra các tập hợp dẫn đến suy giảm proteasome [25]. Do đó, do vai trò quan trọng của stress oxy hóa trong cơ chế bệnh sinh của AD, các dấu ấn sinh học của stress oxy hóa, bao gồm peroxid hóa lipid (mức MDA) và các enzyme chống oxy hóa, đã được đánh giá ở vỏ não và hồi hải mã ở chuột TgAPP và WT. SOD, CAT, GR và GPx là các enzym chống oxy hóa quan trọng nhất có tác dụng chống lại các gốc oxy tự do và điều hòa quá trình chuyển hóa các gốc tự do trong cơ thể và đóng vai trò trong hệ thống thu hồi gốc tự do, bảo vệ các tế bào trong cơ thể khỏi quá trình oxy hóa lipid. . Trong nghiên cứu của chúng tôi, do hậu quả của sự biểu hiện quá mức của APP, sự suy giảm chung về hoạt động của enzyme chống oxy hóa đã được quan sát thấy ở chuột TgAPP so với chuột WT, có ý nghĩa thống kê đối với CAT. Phù hợp với mức GSH giảm, quá trình peroxy hóa lipid tăng đáng kể ở chuột TgAPP. Mặc dù nguồn gốc của stress oxy hóa ở AD ở người rất phức tạp và đa yếu tố, bệnh lý amyloid phát triển ở chuột dường như đủ để bắt đầu quá trình bệnh lý dẫn đến tăng stress oxy hóa trong não [26]. Động vật được điều trị bằng rutin đã trải qua sự gia tăng hoạt động CAT ở vỏ não và hoạt động GR ở vùng hải mã, ở cả con đực và con cái. Chỉ những động vật được điều trị bằng rutin mới trải qua những thay đổi trong biểu hiện gen của CAT và GR ở vỏ não và vùng hải mã ở cả con đực và con cái và GPx ở vùng hải mã của chuột cái. Trong bối cảnh này, một số hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến nhiễu xuyên âm giữa quy định proteasome và oxi hóa khử. Chính xác hơn, quercetin là một chất kích hoạt Nrf2 đã biết [27] thể hiện các đặc tính chống oxy hóa thông qua việc kích thích chức năng proteasome, thúc đẩy tăng khả năng chống lại stress oxy hóa và tăng tuổi thọ cho tế bào [28].

Biểu hiện cụ thể của mô của BACE1 rất quan trọng đối với quá trình xử lý APP thông thường và biểu hiện rối loạn điều hòa của nó có thể đóng một vai trò trong sinh bệnh học AD. BACE1 chủ yếu được biểu hiện ở các tế bào thần kinh hồi hải mã, vỏ não và lớp hạt tiểu não [10]. Cần lưu ý rằng các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng chuột biến đổi gen APP đột biến của Thụy Điển đã làm tăng đáng kể nồng độ A trong não ở trạng thái ổn định [29], cho thấy BACE1 đóng vai trò thiết yếu trong con đường tạo amyloidogen trong sinh bệnh học AD và là mục tiêu điều trị tốt. để điều trị AD. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã quan sát thấy hoạt động BACE1 giảm đáng kể khi điều trị bằng quercetin và rutin, điều này có thể góp phần làm giảm sự lắng đọng A ở chuột. Chúng tôi lập luận rằng không chỉ hoạt động như các chất ức chế BACE1 của enzyme, quercetin và rutin có thể làm giảm hoạt động của BACE1 liên quan đến sự gia tăng tỷ lệ GSH/GSSG, dựa trên giả thuyết tăng cường phục hồi hoạt động đáng tin cậy. Theo nghĩa này, người ta biết rằng việc nhắm mục tiêu các chất ức chế BACE1 đến vị trí phân tách của APPswe (đột biến Thụy Điển) xảy ra trước khi nó đến màng sinh chất, trong khi APPwt (loại Wild) được xử lý trong một endosome ban đầu có nguồn gốc từ tế bào bề mặt. Do đó, BACE1 tách APPwt đôi khi được liên kết với chất ức chế BACE1 trên bề mặt tế bào trước khi xử lý APP, tuy nhiên, enzyme xử lý APPswe thì không [30]. Chính vì lý do này mà việc nội địa hóa bất thường quá trình xử lý APPswe có thể làm giảm đáng kể hiệu lực của quercetin và rutin dưới dạng chất ức chế BACE1. Do đó, chúng tôi có xu hướng ủng hộ rằng hoạt động BACE giảm trong mô hình in vivo này không phải do sự ức chế enzyme mà là do sự gia tăng tỷ lệ GSH/GSSG. Trong mọi trường hợp, hoạt động BACE1 giảm có thể được hiểu là một nỗ lực giả định nhằm giảm sản xuất -amyloid ở chuột TgAPP. Đối với tác dụng đáng chú ý nhất của quercetin và rutin ở vùng hải mã đối với sự suy giảm hoạt động của BACE1, điều đáng chú ý là vỏ não có mật độ tế bào thần kinh cao hơn đáng kể so với vùng hải mã [31] và sự suy giảm chọn lọc của proteasome trong kiểu hình bệnh lý của AD làm cho vỏ não dễ bị tổn thương và bị ảnh hưởng hơn vùng hải mã [32].

Sau khi xác định ảnh hưởng của các phương pháp điều trị đối với hoạt động của enzyme BACE1, chúng tôi quan tâm đến việc đánh giá biểu hiện của nó. Thật kỳ lạ, không có sự khác biệt đáng kể nào trong biểu hiện BACE1 được tìm thấy giữa chuột TgAPP so với chuột WT và không có thay đổi đáng chú ý nào được ghi nhận khi điều trị bằng quercetin hoặc rutin. Do đó, có vẻ như sự gia tăng hoạt động của enzyme BACE1 không liên quan đến sự gia tăng biểu hiện. Trong bối cảnh này, điều đáng chú ý là Apelt et al. [14] đã tìm thấy sự gia tăng hoạt động BACE1 ở vỏ não ở chuột Tg2576 trong độ tuổi từ 9 đến 13 tháng trong khi mức độ biểu hiện của protein BACE1 và mRNA không thay đổi theo độ tuổi. Hơn nữa, bằng chứng đã được tìm thấy hỗ trợ rằng amyloid dạng sợi A 1–42., chứ không phải amyloid hòa tan A 1–42, có thể điều chỉnh tăng biểu hiện protein BACE1, và do đó, những thay đổi nhỏ về tỷ lệ của các dạng đồng phân amyloid có thể điều chỉnh sự phù hợp của tập hợp amyloid và tổn thương tế bào [ 33]. Do đó, việc không có sự thay đổi trong biểu hiện BACE1 khi tăng hoạt động của nó mà chúng tôi nhận thấy có thể giải thích cho sự phổ biến của amyloid hòa tan A 1–42 so với amyloid dạng sợi A 1–42 trong mô hình chuột TgAPP của chúng tôi.

Sau khi xác định biểu hiện gen của các enzyme liên quan đến quá trình xử lý APP, chúng tôi đã đánh giá tác dụng của quercetin và rutin đối với enzyme -secretase liên quan đến quá trình xử lý APP không amyloidogen. Chúng tôi tập trung vào ADAM10 vì đây là dạng đồng phân cấu thành quan trọng nhất về mặt sinh lý của -secretase. ADAM10 chống lại việc tạo ra các mảng oligomeric A gây độc thần kinh thông qua việc tách APP trong miền A để tạo ra các mảnh sAPP và đầu C (-CTF) [34,35]. Mặc dù những thay đổi trong biểu hiện ADAM10 được tìm thấy trong nghiên cứu của chúng tôi không có ý nghĩa thống kê, nhưng biểu hiện ADAM10 giảm nhẹ đã được quan sát thấy ở chuột TgAPP so với chuột WT. Chủ yếu, điều trị bằng rutin cho thấy xu hướng tăng biểu hiện gen ADAM10 ở cả hai vùng não được nghiên cứu. Postina và cộng sự. [36] cho thấy rằng sự điều chỉnh tăng của ADAM10 kiểu hoang dã ở vùng hải mã của mô hình chuột AD qua trung gian bài tiết sAPP, dẫn đến ức chế tạo mảng A. Tác dụng của quercetin đã được nghiên cứu trên mô hình chuột AD do nhôm clorua gây ra cho thấy sự tăng cường đáng kể của -secretase (ADAM10 và ADAM17) ở vùng hải mã so với những con không được điều trị. Điều này chỉ ra rằng quercetin có khả năng làm tăng con đường không tạo amyloidogen thông qua việc kích hoạt các gen -secretase [37]. Dữ liệu tiền lâm sàng củng cố giả thuyết rằng việc tăng cường mức độ sAPP của não là một chiến lược tiềm năng để cải thiện các triệu chứng liên quan đến AD và làm giảm sự thiếu hụt khớp thần kinh. ADAM10 và BACE1 cạnh tranh để phân tách APP, do đó, hoạt động ADAM10 tăng cường có thể ức chế việc tạo amyloid gây độc thần kinh. Hơn nữa, sAPP có thể ngăn chặn việc kích hoạt con đường truyền tín hiệu JNK gây căng thẳng, dẫn đến kích hoạt hoạt động phosphoryl hóa do NF-κB gây ra, dẫn đến sự xuống cấp đáng tin cậy [38]. Do đó, sự hình thành và tích tụ của các tập hợp protein liên quan đến bệnh giảm đáng kể và hoạt động proteasome của tế bào được tăng cường, do đó cung cấp bằng chứng về chức năng của sAPP trong việc điều hòa quá trình tạo protein [39]. Hơn nữa, người ta đã chứng minh rằng sAPP điều chỉnh đặc biệt quá trình tổng hợp thụ thể glutamate AMPA và việc buôn bán của nó [40]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã khám phá xem liệu sự gia tăng nhẹ của biểu hiện ADAM10 khi điều trị bằng rutin có ảnh hưởng đến việc truyền synap glutamatergic hay không. Như được trình bày trong phần dữ liệu bổ sung, không có tác động đáng kể nào đối với biểu hiện của thụ thể hướng ion này được quan sát thấy khi chế độ ăn kiêng quercetin và rutin, có lẽ do sự gia tăng yếu trong biểu hiện ADAM10, không đủ để điều chỉnh lại thụ thể AMPA (Dữ liệu bổ sung , Hình S2 và Bảng S5).

Cần cân nhắc rằng các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra nhiều loại cơ chất ADAM10 [41], và do đó, các tác dụng không mong muốn thu được bằng cách nhắm mục tiêu10-không đặc hiệu ADAM có thể được tìm thấy trong sự tăng sinh ung thư, sự kết dính của tế bào, sự thúc đẩy của tiền tế bào T/tế bào NK và tình trạng viêm, v.v. [42]. Để tránh hạn chế này, nghiên cứu của chúng tôi đề xuất một chiến lược nhằm thúc đẩy việc phát hành sAPP một cách sinh lý hơn. Cách tiếp cận này có thể dựa trên việc sử dụng lâu dài một thành phần hoạt chất (quercetin hoặc rutin), được tiêu thụ thông qua chế độ ăn uống lành mạnh của con người. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu xem liệu sự gia tăng ADAM10 có phụ thuộc vào liều flavonoid hay không và liệu các tác dụng có lợi tiềm ẩn có lớn hơn các tác dụng phụ giả định hay không.

Đối với sự biểu hiện của APPswe, mặc dù việc chèn gen chuyển APP của con người vào bộ gen của chuột đảm bảo rằng APPswe được biểu hiện quá mức từ khi sinh ra, nhưng đã có báo cáo rằng mức độ mRNA của APP và protein hồi hải mã cho thấy sự dao động đáng kể trong quá trình phát triển của động vật, đạt mức tối đa khi chuột là không có triệu chứng (1-tháng tuổi) và giảm dần khi có đầy đủ triệu chứng [43]. Bất chấp vấn đề này, biểu hiện APP cả ở vỏ não và vùng hải mã cao hơn đáng kể so với biểu hiện của chuột WT trong nghiên cứu của chúng tôi. Điều trị thêm bằng quercetin hoặc rutin có thể làm giảm đáng kể biểu hiện như vậy đối với cả chuột đực và chuột cái, ở cả hai vùng não. Những phát hiện này phù hợp với những báo cáo của Augustin et al. [44] người đã nghiên cứu chiết xuất tiêu chuẩn của Ginkgo biloba (Egb761), giàu flavonol như quercetin, ở chuột cái TgAPP 4-tháng tuổi, nhận thấy mức độ protein và mRNA APP giảm. Xem xét rằng việc điều chỉnh lại quá trình dịch mã APP ở chuột Tg2576 xảy ra ở giai đoạn khởi phát và có triệu chứng ban đầu [45], có khả năng là việc phục hồi quá trình dịch mã APP bằng quercetin hoặc rutin có thể đã diễn ra ở chuột TgAPP của chúng tôi và, có khả năng, trong một giai đoạn sớm. giai đoạn có triệu chứng, dẫn đến giảm mức độ APP, hoạt động BACE1 ở vỏ não và vùng hồi hải mã cũng như hoạt động kích hoạt -3 caspase.

Hơn nữa, ở nơi khác đã có báo cáo rằng ở chuột Tg2576 (trong trường hợp không bị mất tế bào thần kinh) có sự gia tăng kích hoạt caspase-3 ở vùng hải mã [46], như được tìm thấy trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bắt đầu suy giảm trí nhớ , cùng với việc giảm các gai đuôi gai trước khi lắng đọng amyloid ngoại bào [46]. Có bằng chứng ủng hộ vai trò không theo chương trình đối với caspase trong hệ thần kinh mà không làm chết tế bào thần kinh [47] và hoạt động của caspase-3 đã được định vị ở gai đuôi gai nơi nó có thể làm tăng mức calcineurin. Đổi lại, quá trình khử phospho của tiểu đơn vị GlamR1 của các thụ thể giống AMPA, được kích hoạt bởi calcineurin được cho là dẫn đến rối loạn chức năng sau khớp thần kinh. Các giá trị biểu hiện caspase-3 của chúng tôi, do hậu quả của quá trình chuyển gen, phù hợp với giá trị mà các nhà nghiên cứu khác thu được, những người đã báo cáo sự gia tăng biểu hiện caspase-3 ở cấp độ gai đuôi gai ở vùng hải mã của chuột TgAPP [48]. Vì APP chứa ba vị trí phân cắt riêng biệt cho caspase-3 trong chuỗi axit amin của nó, hai trong số đó nằm ở cấp độ của miền ngoại bào và một ở phần đầu C nội bào của đuôi APP [49], quá trình thủy phân của APP bằng caspase-3 có thể làm thay đổi quá trình phân giải protein của APP theo hướng có lợi cho con đường tạo amyloidogen [50], dẫn đến việc giải phóng peptide có nguồn gốc từ đầu C gây độc tế bào gồm 31 axit amin có chiều dài (C31), cho ví dụ [51]. Điều này cho thấy rằng, vì caspase-3 có thể làm trung gian cho quá trình khuếch đại giải phóng đoạn độc hại từ APP, nên việc giảm biểu hiện caspase-3 bằng quercetin hoặc rutin có thể cho phép loại bỏ protein tổng hợp. Ngoài ra, như đã đề cập trước đó, chúng tôi đã khám phá ảnh hưởng của cả việc tăng và giảm biểu hiện caspase-3 trong quá trình truyền synap glutamatergic, dựa trên khả năng của caspase được kích hoạt bằng calcineurin-3 để khử phospho hóa tiểu đơn vị GlamR1 của các thụ thể AMPA ở cấp độ sau synap. Những sửa đổi phân tử này làm thay đổi quá trình truyền synap glutamatergic và tính dẻo của tế bào thần kinh ở cấp độ gai đuôi gai ở vùng hải mã [48]. Về mặt lý thuyết, sự ức chế dược lý đối với hoạt động caspase-3 ở chuột TgAPP có thể cứu các kiểu hình giống AD khỏi cơ chế gây ra lỗi khớp thần kinh. Tuy nhiên, mặc dù biểu hiện caspase-3 ở chuột TgAPP của chúng tôi đã tăng lên, nhưng chúng tôi không nhận thấy sự khác biệt đáng kể nào trong biểu hiện thụ thể AMPA so với biểu hiện ở chuột WT, như đã đề cập trước đó. Có thể là những thay đổi trong biểu thức caspase-3 không đủ nổi bật để tạo ra những sửa đổi đáng kể trong biểu thức thụ thể AMPA (Dữ liệu bổ sung, Hình S2 và Bảng S5).

Đối với các giá trị của biểu thức caspase-6, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy giữa chuột TgAPP và WT. Kích hoạt caspase-6 đã được xác định là một chất trung gian quan trọng gây căng thẳng thần kinh giúp tách các protein tế bào quan trọng (Tau và -tubulin), do đó phá vỡ quá trình thoái hóa ubiquitin–proteasome của các protein bị gấp sai và một số mật độ sau synap điều hòa actin protein [52]. Biểu hiện không thay đổi của caspase-6 trong nghiên cứu của chúng tôi đồng ý với việc không có dấu hiệu thoái hóa thần kinh đặc trưng ở độ tuổi mà những con chuột chuyển gen này được đánh giá, so với chuột WT (Dữ liệu bổ sung, Hình S1).

Sự gia tăng đáng kể các chất trung gian gây viêm thần kinh đã được quan sát thấy ở bệnh nhân AD, chủ yếu xung quanh các mảng lão hóa [53–55]. Tế bào hình sao là nhà cung cấp GSH chính cho microglia và tế bào thần kinh. Trong quá trình viêm mãn tính và stress oxy hóa, tế bào hình sao giải phóng các chất trung gian gây viêm độc hại và các gốc tự do, đẩy nhanh quá trình kích hoạt microglia và thoái hóa thần kinh [56]. Điều đáng chú ý là việc giảm glutathione nội bào có liên quan đến việc kích hoạt các con đường gây viêm, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, trong tế bào thần kinh đệm và tế bào hình sao của con người [57]. Về vấn đề này, chúng tôi đã quyết định định lượng các mức IL-1 , IFN- và TNF- trong mô hình động vật của mình và xác định tác dụng của quercetin và rutin đối với chúng. Như đã biết, tình trạng viêm thúc đẩy quá trình xử lý khiếm khuyết của A peptide và APP, thúc đẩy sự tổng hợp A peptide và đến lượt nó làm thay đổi khả năng phản ứng của A [58]. Do đó, trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã quan sát thấy rằng chuột TgAPP đã tăng mức độ mRNA của các chất trung gian gây viêm IL-1 , TNF- và IFN- , so với chuột WT, cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức của APPswe có thể gây ra các đợt viêm thần kinh kích hoạt một loạt các con đường phân tử trong tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh, sẽ kích hoạt phản ứng viêm. Quercetin và rutin có thể làm giảm biểu hiện gen IL-1 ở cả nam và nữ và các vùng não được nghiên cứu. Một số bằng chứng ủng hộ tác dụng chống viêm do quercetin gây ra ở cấp độ CNS, vì nó có thể ức chế sự kích hoạt các yếu tố phiên mã như yếu tố hạt nhân-kappa B (NF-κB) [59], liên quan đến việc tạo ra iNOS, và do đó, hãy giảm việc giải phóng các chất hòa giải như IL-1 , TNF- và IFN- [60]. Về tác động của GSH đối với phản ứng viêm, cần lưu ý rằng GSH tham gia vào việc duy trì mức độ cytokine tối ưu theo cách mà sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm (TNF- , IL-1 và IL -6) tăng lên do suy giảm GSH, trong khi biểu hiện của các cytokine chống viêm (tức là IL-10) vẫn không thay đổi. Sự thay đổi cân bằng nội môi GSH này xảy ra do sự điều chỉnh lại trong các đường dẫn tín hiệu NF-κB và JNK, đây có thể là con đường apoptotic khả thi đối với sự chết của tế bào thần kinh [61]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc điều chỉnh giảm NF-κB bằng quercetin và rutin có thể là một cơ chế hợp lý để phục hồi cân bằng nội môi GSH/GSSG và do đó là nguyên nhân của sự cân bằng giữa các cytokine tiền viêm và chống viêm. Cuối cùng, do promotor BACE1 có vị trí gắn kết NF-κB, nên việc kích hoạt NF-κB do viêm gây ra tạo điều kiện thuận lợi cho việc điều chỉnh lại biểu hiện BACE1 và sau đó làm tăng sản xuất A [62]. Do đó, nếu việc điều chỉnh giảm NF-κB xảy ra theo chế độ ăn kiêng quercetin và rutin, hoạt động của BACE1 sẽ giảm do quy định giải phóng các cytokine tiền viêm và không chống viêm.

4. Vật liệu và phương pháp

4.1. Động vật thí nghiệm

Một con chuột biến đổi gen (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) biểu hiện đột biến kép Thụy Điển của protein tiền chất amyloid ở người (hAPP) đã được sử dụng làm mô hình động vật của AD thử nghiệm [14]. Chuột là một dòng dị hợp tử biểu hiện đồng dạng A PP695 của con người với đột biến kép tiếng Thụy Điển (K670N/M671L; Lys670→Asn và Met671→Leu) dưới sự kiểm soát của chất kích thích protein prion của chuột đồng [63]. Kết quả là, con chuột này thể hiện mức protein tiền thân amyloid của con người (A PP), cao hơn sáu lần so với mức A PP của chuột. Ngoài ra, con chuột này cho thấy mức độ cao hơn của A 40 và A 42. Tiền gửi bắt đầu từ 9 tháng tuổi [63]. Trong vùng hồi hải mã và vỏ não Tg2576, sự biểu hiện gen chuyển của APPswe chủ yếu là tế bào thần kinh [64].

Để kiểm soát âm tính, chuột hoang dã (WT) từ cùng một thuộc địa [65,66] đã được sử dụng. Đàn chuột Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) được phát triển trong phòng thí nghiệm của chúng tôi từ những con đực dị hợp tử Tg2576 và những con cái kiểu hoang dã. Bố mẹ chuyển gen được tặng bởi Tiến sĩ Diana Frechilla từ Phòng Khoa học Thần kinh tại Trung tâm Nghiên cứu Y học Ứng dụng tại Đại học Navarra (Pamplona, ​​Tây Ban Nha) [67].

Động vật được nhốt trong các lồng thông gió riêng và giữ ở nhiệt độ 22–24 ◦C theo chu kỳ sáng/tối 12-h với độ ẩm 50–60 phần trăm. Các giao thức động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC) tại Đại học Complutense Madrid và hoàn toàn phù hợp với Chỉ thị Châu Âu 2010/63/về bảo vệ động vật được sử dụng cho mục đích khoa học và luật Tây Ban Nha về Phúc lợi Động vật ( Nghị định Hoàng gia 53/2013, ngày 1 tháng 2 năm 2013).

4.2. Phân tích kiểu gen của chuột

Tính chuyển gen được xác định trong vòng 30 ngày sau khi sinh bằng sinh thiết đuôi. Phân tích kiểu gen của động vật được thực hiện bằng PCR. Xét rằng Tg2576 (TgAPP) là một dòng dị hợp tử, gen chèn (PrP, từ protein prion) đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát phản ứng dương tính. DNA bộ gen được chiết xuất từ ​​đuôi chuột được tiêu hóa bằng proteinase K (0.1 µg/µL) trong dung dịch đệm NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05% gelatin, 0,45% NP-40 và 0,4% Tween 20) ở 56 ◦C trong 3 giờ và lắc. Các đoạn DNA được kết tủa bằng isopropanol và được rửa bằng ethanol 70%. Kết tủa DNA được hòa tan trong 30 µL dung dịch đệm TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). Độ tinh khiết và nồng độ của DNA được xác định ở bước sóng 260 và 280 nm.

Các gen PrP và APP được khuếch đại bằng PCR. Trình tự mồi được sử dụng để sàng lọc chuột chuyển gen như sau: PrP chuyển tiếp: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP đảo ngược: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; Đảo ngược ứng dụng: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Các bước của phản ứng PCR như sau: biến tính ở 94 ◦C trong 90 giây, 39 chu kỳ ở 60 ◦C trong 60 giây và 72 ◦C trong 90 giây, sau đó kéo dài lần cuối ở 72 ◦C trong 7 phút.

Trong mọi trường hợp, các biện pháp kiểm soát âm tính (không có khuôn DNA) và kiểm soát tích cực của gen APP đã được xem xét. Các sản phẩm PCR thu được được phân tách bằng điện di trong gel agarose 1,5 phần trăm trong bộ đệm 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Đức) ở 70 V (điện áp không đổi) và sau đó được tạo ảnh bằng cách nhuộm với Gel Đỏ (Millipore).

4.3. điều trị động vật

Chuột TgAPP và bạn cùng lứa hoang dã, cả hai đều ở độ tuổi 6–7 tuần với trọng lượng cơ thể ban đầu là 16,2 ± 0.8 g, được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm sau (n=8/nhóm): ( a) TgAPP chưa được xử lý; ( b ) TgAPP được xử lý bằng quercetin; ( c ) TgAPP được xử lý bằng rutin; và ( d ) Loại hoang dã chưa được xử lý. Vì cả chuột đực và chuột cái đều được nghiên cứu nên hai nhóm được thành lập. Khi được 45 tuần tuổi, chuột bắt đầu được điều trị bằng quercetin hoặc rutin trong 4 tuần.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) và rutin hydrat (quercetin-3-O-rutinoside hydrat) lớn hơn hoặc bằng 95 phần trăm nguyên chất và được mua từ Sigma–Aldrich. Mỗi loại flavonoid được kết hợp vào chế độ ăn tiêu chuẩn (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Tây Ban Nha) ở nồng độ 200 ppm, tương ứng với lượng flavonoid 30 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Những con chuột không được điều trị chỉ nhận được chế độ ăn tiêu chuẩn không bổ sung. Chế độ ăn uống và nước đã được cung cấp cho lượng uống tự do quảng cáo.

4.4. Chuẩn bị mô não cho các xét nghiệm sinh hóa và mô học

Khi kết thúc quá trình điều trị, những con chuột được nhịn ăn qua đêm, chúng được tiêu hóa bằng cách sử dụng trật khớp cổ tử cung và toàn bộ não nhanh chóng bị loại bỏ. Não được rửa sạch bằng nước muối ở 4 ◦C và màng nhện được loại bỏ cẩn thận. Sau đó, hồi hải mã và vỏ não được cô lập. Các mẫu ngay lập tức được bảo quản ở −80 ◦C cho đến khi sử dụng tiếp.

Toàn bộ não của một số động vật được sử dụng để thu thập các phần mô học, sau khi được làm chết bằng cách sử dụng dịch chuyển cổ tử cung, não được đông lạnh bằng cách ngâm trong isopentane ở -80 ◦C. Ngay sau đó, các phần vành của não (độ dày 30 µm) được tạo ra từ khứu giác đến tiểu não, cách nhau 120 µm trong một máy lạnh (Leica CM1850, Nussloch, Đức). Toàn bộ quy trình được thực hiện ở −20 ◦C. Các phần mô học được thu thập trên các phiến kính và giữ ở −80 ◦C cho đến khi phân tích (Xem Phương pháp bổ sung).

4.5. Glutathione

Đối với các xét nghiệm glutathione, các mẫu vỏ não và hồi hải mã được đồng nhất hóa trong dung dịch đệm làm nguội oxi hóa khử-5% Axit axetic Trichloride (RQB-5% TCA) (trước đó được sủi bọt với N2 trong 15 phút trên nước đá) ở nồng độ là 25 mg/mL (w/v). Các mẫu được tái tạo huyền phù bằng cách siêu âm trong 10 giây, sau đó ly tâm ở tốc độ 12,000× g trong 10 phút ở 4 ◦C và thu phần nổi phía trên.

Sau đó, trong phần nổi phía trên thu được, các phương pháp đo quang phổ huỳnh quang đã được áp dụng để xác định mức GSH và GSSG bằng phương pháp o-phthalaldehyd, được mô tả bởi Senft et al. [68]. Các giá trị GSH và GSSG đã được hiệu chỉnh cho phản ứng tự phát khi không có mẫu sinh học. Trong cả hai trường hợp, chất nổi trên bề mặt được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó, huỳnh quang được đo bằng đầu đọc vi bản FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Đức), với bộ lọc kích thích được đặt ở 360 nm (băng thông 5 nm) và bộ lọc phát xạ được đặt ở 460 nm (băng thông 5 nm). Nồng độ GSH và GSSG trong mỗi mẫu được nội suy từ các tiêu chuẩn GSH đã biết. Nồng độ của cả GSH và GSSG được biểu thị bằng nmol GSH/mg protein, cho phép tính toán tỷ lệ oxy hóa khử glutathione GSH/GSSG.

Các viên còn lại được xoáy cho đến khi hòa tan hoàn toàn trong 240 µL NaOH 0,1 M để đo nồng độ protein bằng phương pháp axit bicinchoninic (BCA), sử dụng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】