Một mô hình chuyển gen tiết lộ vai trò của Klotho trong việc phát triển ung thư tuyến tụy và mở đường cho liệu pháp dựa trên Klotho mới

Vui lòng bấm vàooscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Tóm tắt đơn giản:Chúng tôi nhằm mục đích nghiên cứu vai trò của protein chống lão hóa klotho và isoform được tiết ra của nó, ở Anh, trong bệnh ung thư tuyến tụy. Ba mô hình in vivo, bao gồm một mô hình chuột di truyền mới và các phân tích tin sinh học, đã chỉ ra klotho như một chất ức chế khối u trong ung thư biểu mô tuyến ống tụy và tiết lộ một mô hình siêu methyl hóa DNA klotho duy nhất trong các khối u tuyến tụy. Những kết quả này có giá trị tiên lượng đáng kể, và càng gợi ý rằng cô ấy có thể dùng như một tác nhân điều trị cho ung thư biểu mô tuyến ống tụy.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Tóm tắt: Klotho là một protein xuyên màng chống lão hóa, có thể bị rụng và có thể hoạt động như một loại hormone. Dữ liệu tích lũy chỉ ra rằng klotho là một chất ức chế khối u trong một loạt các khối u ác tính và chỉ định miền phụ KL1 là vùng hoạt động của protein cho hoạt động này. Chúng tôi nhằm mục đích nghiên cứu vai trò của klotho như một chất ức chế khối u trong ung thư biểu mô tuyến tụy (PDAC). Phân tích tin sinh học của bộ dữ liệu Bản đồ bộ gen ung thư (TCGA) cho thấy mối tương quan giữa khả năng sống sót của bệnh nhân PDAC, mức độ biểu hiện klotho và sự methyl hóa DNA, và chứng minh một mô hình siêu methyl hóa độc đáo của klotho trong các khối u tuyến tụy. Hiệu ứng in vivo của klotho và KL1 đã được kiểm tra bằng cách sử dụng ba mô hình chuột. Sử dụng một mô hình di truyền mới, kết hợp loại bỏ klotho tuyến tụy với đột biến ở Kras, việc thiếu klotho góp phần tạo ra PDAC và giảm khả năng sống sót của chuột. Trong một mô hình xenograft, việc sử dụng các hạt virus mang bầu trời, một đồng dạng klotho nối có chứa miền KL1, đã ức chế các khối u tuyến tụy.mua cistancheCuối cùng, điều trị bằng bầu trời hòa tan kéo dài thời gian tồn tại của Pdx 1- Cre; KrasG12D / cộng; Chuột Trp53R172H / plus (KPC), một mô hình được biết là tổng hợp lại PDAC của con người.bioflavonoids,Kết luận, nghiên cứu này cung cấp bằng chứng rằng klotho là một chất ức chế khối u trong PDAC. Hơn nữa, những dữ liệu này gợi ý rằng mức độ biểu hiện klotho và sự methyl hóa DNA có thể có giá trị tiên lượng ở bệnh nhân PDAC, và việc sử dụng sKL ngoại sinh có thể đóng vai trò như một chiến lược điều trị mới để điều trị PDAC.

Từ khóa:klotho; KL1; sKL; Thuốc ức chế khối u; ung thư tuyến tụy; PDAC

1. Giới thiệu

Ung thư tuyến tụy là một trong những bệnh ung thư mạnh nhất, với tỷ lệ sống sót sau 5- năm là 9 phần trăm. Tỷ lệ mắc và tử vong đang tăng lên, với 60.430 trường hợp mắc mới và 48.220 trường hợp tử vong được dự báo vào năm 2021 chỉ riêng tại Hoa Kỳ [1]. Ung thư biểu mô tuyến tụy (PDAC) đại diện cho 85-90 phần trăm của tất cả các khối u ác tính tuyến tụy. Các mô hình hiện tại cho thấy sự phát triển của nó từ ung thư nội biểu mô tuyến tụy lành tính (PanlN) 1-3 đến ung thư biểu mô xâm lấn, cùng với việc thu nhận các đột biến di truyền. Kích hoạt Kras được coi là bước đầu tiên đối với bệnh ác tính [2], và trong các mô hình chuột, dẫn đến sự phát triển của PanIN sau 9 tháng [3]. Mặc dù hiếm gặp PDAC công khai ở những con chuột này, nhưng trong mô hình KPC, kết hợp đột biến Kras với mất chất ức chế khối u p53 [4], PDAC thường phát triển khi 3-6 tháng tuổi [5].

Cistanche có thể chống lão hóa

Klotho (ở đây được sử dụng là klotho) là một loại protein xuyên màng loại I liên quan đến quá trình điều hòa lão hóa [6]. Ở chuột, thiếu klotho dẫn đến một hội chứng giống như lão hóa nhanh, trong khi biểu hiện quá mức klotho kéo dài tuổi thọ [7,8]. Vùng ngoại bào klotho bao gồm hai miền tương đồng, KL1 và KL2, có thể tách khỏi màng và hoạt động như các hormone tuần hoàn [9-11]. Một dạng đồng dạng klotho nối phân biệt thứ hai được tiết ra (Anh). Bầu trời giống hệt KL1, cộng thêm 15 axit amin bổ sung ở ga cuối C. Các hoạt động khác nhau của klotho đã được mô tả, bao gồm kích hoạt tín hiệu của yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) 23 [12,13], điều hòa kênh cation tiềm năng thụ thể thoáng qua thành viên phụ họ V (TRPV) kênh canxi 5 [14,15], và ức chế các con đường -1 insulin và yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF) -1 [8,16,17].

Klotho được biểu hiện chủ yếu ở thận và não, nhưng cũng có trong các mô khác nhau, bao gồm tuyến tụy ngoại tiết và nội tiết [7, 17-20]. Các hoạt động sinh lý của nó trong tuyến tụy vẫn chưa được xác định; tuy nhiên, có bằng chứng về sự liên quan của nó trong việc điều chỉnh cân bằng nội môi glucose. Klotho kích thích sản xuất và bài tiết insulin trong ống nghiệm và in vivo, làm giảm độ nhạy insulin ở chuột và bị cạn kiệt ở các đảo tụy của bệnh nhân đái tháo đường týp 2 (T2DM) [8, 19-22]. Klotho là một chất ức chế khối u mạnh trong nhiều khối u ác tính, bao gồm cả ung thư đường tiêu hóa [16,17, 23-30]. Nó im lặng về mặt biểu sinh trong bệnh ung thư và cả klotho và Karl đều làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư trong ống nghiệm và in vivo [16,17,23,25,26,28, 31-33]. Trong ung thư tuyến tụy, sự điều hòa giảm của klotho có tương quan với sự sống còn của bệnh nhân. Trong ống nghiệm, klotho làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tụy và ức chế con đường IGF-Iand bFGF [17,34].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhằm mục đích giải mã vai trò của klotho như một chất ức chế khối u trong PDAC bằng cách sử dụng ba mô hình in vivo. Sử dụng một mô hình di truyền mới, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc hạ gục klotho tuyến tụy góp phần vào sự phát triển PDAC và làm giảm khả năng sống sót của chuột đột biến Kras. Trong mô hình thứ hai, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc sử dụng các hạt virus mang sKL đã ức chế các khối u tuyến tụy trong một mô hình xenograft. Cuối cùng, điều trị bằng bầu trời tái tổ hợp hòa tan kéo dài thời gian sống của chuột KPC. Những kết quả này cho thấy vai trò của koto như một nhân tố quan trọng trong việc phát triển PDAC và đề xuất klotho như một chiến lược điều trị để điều trị bệnh nhân PDAC.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Phân tích TCGA bằng trình duyệt UCSC Xena

Bộ dữ liệu biểu hiện gen RNAseg (IlluminaHiSeq) và methyl hóa DNA (Methylation450k) cho nhóm thuần tập Bản đồ hệ gen ung thư (TCGA) Ung thư tuyến tụy (PAAD) đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng Trình duyệt Xena của Đại học California Santa Cruz (UCSC) (http: // xena.ucscedu /, truy cập ngày 19 tháng 7 năm 2020) [35].cistanchSử dụng Trình duyệt Xena, tỷ lệ sống sót tổng thể và khoảng thời gian không tiến triển của bệnh nhân ung thư tuyến tụy được phân tích theo biểu hiện klotho hoặc sự methyl hóa DNA KLOTHO, và đồ thị Kaplan-Meier đã được tạo ra. Dữ liệu cá nhân trùng lặp chỉ được loại bỏ bằng cách lọc các khối u nguyên phát. Dữ liệu biểu hiện gen, được cho theo đơn vị log2 (x cộng 1), được chia thành hai nhóm theo giá trị trung vị; Dữ liệu về sự methyl hóa DNA được chia thành hai nhóm theo phần tư thấp hơn và phần tư trên.

Đối với sự methyl hóa DNA KLOTHO cụ thể tại vị trí, các mẫu có mức độ biểu hiện klotho thấp hoặc cao, được xác định theo phần tư thấp hơn hoặc trên, được phân tích thêm. Các giá trị 36] cho mỗi vị trí methyl hóa đã được tính toán, và mối tương quan với biểu hiện klotho trong mẫu tương ứng được kiểm tra thông qua hệ số tương quan Pearson (r).

2.2. Hóa chất, kháng thể và cấu tạo

Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm biến thể mối nối người hòa tan klotho, bao gồm các axit amin 34-549 (tên miền trượt tuyết; số gia nhập BAA24941.1), với trình tự axit amin duy nhất 15- ở đầu cuối C ({ {6}}; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, Hoa Kỳ); glucose （Floris, Misgav, Israel）, human insulin （Actrapid; Novo Nordisk A / S, Bagsværd, Den-mark), và luciferin (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, Hoa Kỳ).

Các kháng thể được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm kiểm soát isotype IgG2a của chuột (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và chống - - actin (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) . Các kháng thể kháng klotho chống lại miền KL1 (KM2076) là một món quà tốt từ Công ty TNHH Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Nhật Bản.

2.3 Sản xuất và làm sạch véc tơ AAV

Các vectơ AAV9, vectơ trống rỗng và bầu trời (chứa đồng dạng biến thể mối nối klotho được tiết ra, số gia nhập BAA24941.1) được sản xuất và tinh chế trong các cơ sở an toàn sinh học cấp 2 của United Mixta UAB-VHIR và Đơn vị Sản xuất Vector (VPU) Tóm tắt , vectơ được tạo ra bằng cách sử dụng hệ thống truyền ba lần trong các tế bào HEK293. Sau 48 giờ, vectơ AAV được thu hoạch, xử lý bằng benzonase, tinh chế trong gradient iodixanol, và được chuẩn độ bằng PicoGreen [37]. Biểu hiện gen chuyển được thúc đẩy bởi một promoter CMV, như đã mô tả trước đây [37].

2.4. Bảo dưỡng động vật

Thí nghiệm và bảo dưỡng chuột được thực hiện tại Trung tâm Y tế Sourasky (Tel Aviv, Israel) và tuân theo các quy định và tiêu chuẩn của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Trung tâm Y tế Sourasky.

Các dòng chuột được sử dụng cho các mô hình chuyển gen đều trên nền C57BL / 6 và JVB / NJ hỗn hợp. Chuột Pdx 1- Cre, LSL-KrasG12D / plus và LSL-Trp53R172H / plus t là những món quà tử tế từ Tiến sĩ Ziv Gil (Viện Công nghệ Technion-Israel tại Rambam, Haifa, Israel).

2.5. Mô hình chuột KLOTHO Knockdowm dành riêng cho tuyến tụy

Để nhắm mục tiêu hạ gục KLOTHO đối với chuột pancreata, những con chuột mang alen KLOTHO floxed (KLlox) đã được tạo ra, như đã mô tả trước đây [38].cistanche ÚcChuột Keflex / flox đã được lai với chuột Pdx 1- Cre, biểu hiện sự tái tổ hợp Cre được kiểm soát bởi promoter của Pdxl, do đó thu được Pdx 1- Cre; KL - / - chuột. Sự hạ gục KLOTHO của tuyến tụy đã được xác nhận với hóa mô miễn dịch và mức mRNA, như được mô tả sau đây.

Để tạo ra những con chuột có khả năng hạ gục KLOTHO được kiểm soát bởi Pdxl và biểu hiện Kras đột biến, chuột LSL-KrasG12D / plus [3], mang trình tự Lox-Stop-Lox theo sau là alen Kras đột biến, được lai với chuột KLflox / flox. Những con chuột này tiếp tục được lai với chuột Pdx 1- Cre, tạo ra Pdx 1- Cre; KL - / -; Chuột KrasG12D / plus. LSL-KrasG12D / plus cũng được lai với chuột Pdx 1- Cre riêng và Pdx 1- Cre này; Chuột KrasG12D / plus được sử dụng làm đối chứng. Những con chuột được kiểm tra hàng ngày để tìm các dấu hiệu đau khổ, bao gồm thở khó, thay đổi trọng lượng lớn và khối u lớn (hơn 1 cm), và những con chuột đáp ứng các tiêu chuẩn do ủy ban đạo đức đặt ra đã bị hy sinh. Những con chuột được theo dõi để tồn tại, với cái chết được xác định là tự nhiên hoặc bởi các dấu hiệu cần phải hy sinh. Do sự tiêu hóa nhanh chóng của mô tụy bởi dịch tụy, chúng tôi chỉ có thể kiểm tra phần pancreata của những con chuột đã bị hy sinh. Các mô được thu hoạch và giữ trong formaldehyde trong 24 giờ, sau đó được thay thế bằng 70% ethanol.

2.6. Nghiên cứu Xenograft Khối u Chuột

Chuột cái khỏa thân thể thao (nền BALB / c), {{0}} tuần tuổi, được mua từ Envigo RMS (Jerusalem, Israel). Chuột được nuôi nhốt và duy trì trong tủ cấy trong các điều kiện không có mầm bệnh cụ thể. Vào ngày đầu tiên của thử nghiệm, các tế bào MIA PaCa -2 biểu hiện ổn định m-Cherry / luciferase đã được cấy dưới da (sc) vào hai bên sườn của chúng （n =21, các tế bào 1 × 10 độ trong 100 μL / 5 phần trăm FCS DMEM trung bình）. Mười ngày sau khi cấy vào khối u, liều cao (5 × 1011 GC / mL, n {11}}) hoặc liều thấp (5 × 1010GC / mL, n =6) AAV của người-cô ấy được tiêm bắp (im) .AAV-null đóng vai trò là đối chứng (5 × 1010 GC / mL, n =8). Các khối u được đo bằng thước cặp kỹ thuật số ba lần một tuần và thể tích được tính bằng công thức tính thể tích ellipsoid (0,5 × dài × rộng2). Vào ngày 20 của thử nghiệm, các khối u được đánh giá in vivo bằng cách theo dõi hoạt động luciferase của tế bào MIA PaCa -2 bằng cách tiêm luciferin 150 ug / mL vào trong phúc mạc và cường độ luciferase được đo bằng Biospase.

Vào cùng ngày, thí nghiệm kết thúc và những con chuột đã được chết. Các khối u đã được cắt bỏ, cân và đo bằng thước cặp kỹ thuật số. Máu được thu thập trước khi gây tử vong, và nồng độ klotho ở người được đo trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA (IBL, Minneapolis, MN, USA). Năm mươi microlit huyết thanh trên mỗi mẫu (trong các bản sao) được sử dụng cho ELISA, và xét nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mối tương quan giữa trọng lượng của khối u và nồng độ klotho trong máu của con người được kiểm tra thông qua hệ số tương quan của Pearson.

2.7. Mô hình chuột KPC

Việc tạo ra chuột KPC được thực hiện bằng cách lai với chuột LSL-Trp53R172H / plus [5] mang trình tự Lox-Stop-Lox, tiếp theo là alen p53 đột biến điểm có chức năng như một đột biến rỗng, với chuột LSL-KrasG12D / plus t. Chúng được cho lai với chuột Pdx 1- Cre, dẫn đến Pdx 1- Cre; KrasG12D / cộng; Chuột Trp53R172H / plus. Các con chuột được kết hợp theo giới tính, tuổi và cân nặng và được chỉ định ngẫu nhiên để được điều trị bằng cách tiêm vào màng bụng (ip) da người hòa tan (15 mg / kg, hai lần mỗi tuần) hoặc kiểm soát phương tiện (n =6 cho nhóm được bầu trời đối xử; n =7 cho nhóm kiểm soát). Điều trị tiếp tục cho đến 30 tuần. Những con chuột được kiểm tra hàng ngày để tìm các dấu hiệu đau khổ, bao gồm thở khó, thay đổi trọng lượng lớn và khối u lớn (hơn 1 cm), và những con chuột đáp ứng các tiêu chuẩn do ủy ban đạo đức đặt ra đã bị hy sinh. Những con chuột được theo dõi để tồn tại, với cái chết được xác định là tự nhiên hoặc bởi các dấu hiệu cần phải hy sinh.

2.8. Định kiểu gen

Đuôi chuột được lấy ở 3 tuần tuổi để xác định kiểu gen. DNA được chiết xuất bằng cách ủ đuôi trong dung dịch ly giải kiềm, bao gồm 25 0 μM NaOH và 2 μM dinatri EDTA (pH 12. 0), trong 30-60 phút ở 95 độ , tiếp theo là trung hòa với 0. 4 mM Tris HCL (pH 5,0). DNA sau đó đã trải qua quá trình khuếch đại PCR cho các kiểu gen khác nhau, sử dụng hỗn hợp phản ứng PCR REDTaq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Mồi ở nồng độ cuối cùng là 1000 nM. Các chu kỳ và mồi PCR được trình bày chi tiết trong Bảng S1. Các sản phẩm được mạ điện trên 1,5% gel agarose và được nhuộm bằng ethidium bromide.

2.9. Phân tích hóa mô miễn dịch (IHC)

Các mô được cố định trong 4 phần trăm paraformaldehyde, và các mô nhúng đã được phân cắt theo thứ tự. Các phần được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E) và được kiểm tra bằng kính hiển vi bởi một nhà nghiên cứu bệnh học có kinh nghiệm, hoặc nhuộm bằng IHC, như đã mô tả. Đối với klotho IHC, các phần được cố định bằng formalin và nhúng parafin, dày 4 um, được khử trùng bằng xylen và được làm ẩm. Việc thu hồi kháng nguyên được thực hiện bằng cách sử dụng bể nước nóng (95 độ) trong 2 0 phút trong dung dịch đệm citrate pH6.0. Sau khi làm lạnh 30 phút, các phiến kính được rửa trong đệm TBS-triton (TBS-T).lợi ích cistancheSau đó, và khối peroxidase nội sinh được thực hiện trong 10 phút trong 3% H, O / metanol. Sau khi rửa trong TBS-T, các phần được chặn trong 30 phút bằng cách sử dụng 5% BSA trong TBS-T và sau đó được ủ qua đêm với kháng thể chính klotho ở độ 4. Việc phát hiện được thực hiện với ZytoChem Plus (HRP) One-Step Polymer chống Chuột / Thỏ / Chuột (ZUC053; Zytomed Systems, Berlin, Đức). Chuột IgG2a đóng vai trò kiểm soát isotype.

2.10. Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)

Pancreata từ Pdxl-Cre đã hy sinh; Chuột đối chứng KL - / - và KLflox / flox đã được cắt tiết, đông lạnh trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80 độ. Sau khi đồng nhất hóa pancreata, RNA tổng số được chuẩn bị bằng cách sử dụng bộ phân lập RNA (Sigma) và được phiên mã ngược bằng cách sử dụng JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA). CDNA được khuếch đại cho klotho và -actin (như bộ điều khiển tải) bằng cách sử dụng REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma). PCR được tối ưu hóa ở 94 độ trong 5 phút, tiếp theo là các chu kỳ 30 giây ở 94 độ, 90 giây ở 52,5 độ và 20 giây ở 72 độ (45 chu kỳ đối với klotho, 25 chu kỳ đối với -actin) và 10 phút ở 72 độ để mở rộng, sử dụng mồi 12,5 pmol klotho (F, 5- ACGTTCAAGTGGACACTACTCT -3 'và R, 5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC -3') và 5 mồi pmol -actin (F, 5 ' -TGTTACCAACTGGGACGACA -3 'và R, 5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA -3). Các sản phẩm được mạ điện trên 1,5% gel agarose được nhuộm bằng ethidium bromide. Việc định lượng được thực hiện bằng phần mềm ImageJ, Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD, Hoa Kỳ.

2.11. Phân tích thống kê

Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD hoặc SEM, như đã đề cập. Các biến liên tục được so sánh bằng cách sử dụng kiểm định t trừ khi được đề cập khác. Tất cả các thử nghiệm ý nghĩa đều có hai phía và giá trị p của Nhỏ hơn hoặc bằng 0. 05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Mối tương quan được đánh giá bằng hệ số tương quan của Pearson (r). Phân tích tỷ lệ sống sót được thực hiện bằng cách sử dụng bài kiểm tra xếp hạng nhật ký.

3. Kết quả

3.1 Mức độ biểu hiện Klotho và sự methyl hóa DNA trong khối u tuyến tụy tương quan với sự sống còn của bệnh nhân ung thư

Nhóm thuần tập về trình duyệt gen ung thư (TCGA) Ung thư tuyến tụy (PAAD) đã được kiểm tra bằng cách sử dụng trình duyệt Xena của Đại học California Santa Cruz (UCSC) [35]. Phân tích biểu hiện gen cho thấy khả năng sống sót tổng thể (OS) giảm và khoảng thời gian không tiến triển (PFI) đối với bệnh nhân ung thư tuyến tụy có khối u biểu hiện klotho thấp, so với mức cao (n =89 cho mỗi nhóm; Hình 1A, B). Kiểm tra dữ liệu methyl hóa cho thấy xu hướng tương thích của OS và PFI bị cản trở ở những bệnh nhân có khối u với mức độ methyl hóa DNA KLOTHO cao, so với mức thấp (tương ứng là n=45 và n =46; Hình 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0. 3) trong ung thư tuyến tụy ở người (Hình 2C-E).

3.2. Thế hệ của chuột Knockdown Knockdown tuyến tụy

Chuột loại trực tiếp KLOTHO không có điều kiện chết vào khoảng 8-9 tuần tuổi [7], do đó, chúng không thể dùng làm mô hình phát triển ung thư. Do đó, chúng tôi nhắm mục tiêu hạ gục KLOTHO đối với chuột pancreata. Với mục đích này, chuột Pdx 1- Cre được lai với chuột mang các alen KLOTHO floxed, KLlox / lox [38], do đó thu được Pdx 1- Cre; KL - / - chuột (Hình 3A, B) .RNA và mức protein đã xác nhận khả năng hạ gục Klotho của tuyến tụy (Hình 3C-E). Pdx 1- Cre; Chuột KL -77 cho thấy trọng lượng tăng nhẹ theo thời gian so với đối chứng (Hình 3F), nhưng không có sự khác biệt về lượng đường huyết hoặc insulin và dung nạp glucose (Hình S1).

Hình 3. Thế hệ chuột nhắt KLOTHO tuyến tụy. (A) Sơ đồ về alen KLflox: Các trang web LoxP nằm cạnh exon 2 của KLOTHO, dẫn đến việc nó bị đánh bại mục tiêu trong pancreata của Pdx 1- Cre; KL - / - chuột. Bảng trên hiển thị allele floxed, bảng dưới hiển thị kết quả dự kiến ​​của sự tái tổ hợp Cre. (B) Gel đại diện hiển thị các sản phẩm PCR của kiểu gen KLOTHO của chuột: KL plus / plus (WT; 370 bp), KLl / plus (470 và 370 bp), và KLflox / flox (470 bp). (C, D) RNA tuyến tụy được tách chiết từ Pdx 1- Cre; KL - / - (n =7) và chuột điều khiển (n =4). Mức mRNA Klotho được xác định bằng RT-PCR bán định lượng và được định lượng. Gel đại diện được hiển thị (các đốm ban đầu chưa được cắt xén có sẵn trong Hình S2). (E) Phương pháp nhuộm klotho hóa mô miễn dịch đại diện của pancreata được phân tách từ Pdx 1- Cre; KL - / - và điều khiển chuột. Độ phóng đại: X20. W / O, không có. (F) Trọng lượng của chuột ở cả hai nhóm (n =5 mỗi nhóm). Được phân tích bằng cách sử dụng các phép đo lặp lại ANOVA.p =0. 01. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM. Kiểm soát, chuột KLflox / flox. Chuột chứa KLOTHO tuyến tụy và biểu hiện Kras đột biến được tạo ra bằng cách lai Pdx 1- Cre với chuột LSL-KrasG12D / plus [3] (Pdx 1- Cre; chuột KrasG12D / plus) và lai tiếp tục lai chúng với Chuột KLflox / lox (chuột Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasG12D / plus). Các phân tích được tiến hành bằng cách sử dụng chuột đực. Chuột cái bị loại do tỷ lệ tổn thương hậu môn cao ở cả Pdx 1- Cre; KrasG12D / plus và Pdx 1- Cre; KL - / -; Chuột KrasG12D / plus, phù hợp với các báo cáo trước đây về u nhú trên da ở những con chuột như vậy [3].

3.3 Mất Klotho tuyến tụy góp phần làm giảm khả năng sống sót ở chuột

Không có sự khác biệt về tỷ lệ sống sót của Pdx 1- Cre; KL - / - chuột, so với đối chứng). Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa KLOTHO tuyến tụy và đột biến Kras đối với sự sống sót bằng cách theo dõi những con chuột trong 65 tuần. Cái chết xảy ra một cách tự nhiên hoặc chết vì các dấu hiệu của đau khổ nghiêm trọng, hoặc gánh nặng khối u cần phải hy sinh, bắt đầu. Sự tồn tại của Pdx 1- Cre; Chuột KL - / -; KrasG12D / plus (n =21) ​​đã bị giảm so với Pdx đối chứng 1- Cre; Chuột KrasG12D / plus (n =18; p=0. 02; Hình 4A). Do đó, đến 22 tuần tuổi, 100 phần trăm (18/18) của Pdx 1- Cre; Chuột KrasGi2D / plus còn sống, so với 71 phần trăm (15/21) của Pdx 1- Cre; KL - / -; Chuột KrasG12D / plus. Không có thay đổi đáng kể nào về trọng lượng được ghi nhận giữa các nhóm (Hình 4B).

Hình 4. Sự hạ gục KLOTHO của tuyến tụy góp phần làm giảm tỷ lệ sống sót và gây ra PDAC in vivo. (A) Các đường cong Kaplan-Meier của Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasGi2D / plus (n =21) so với điều khiển Pdx 1- Cre; KrasGi2D / plus (n =18) mouse.p =0. 02. ( B) Trọng lượng của chuột ở cả hai nhóm (n =19 mỗi nhóm). (CE) Pancreata đã được cắt bỏ khỏi Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasG12D / plus (n =7, tuổi trung bình 36 tuần) và kiểm soát Pdx 1- Cre; KrasGi2D / plus (n =8, tuổi trung bình 49 tuần) khi hiến tế. (C) So sánh giữa đánh giá bệnh lý của pancreata nhuộm H&E của cả hai nhóm. (D) Phương pháp nhuộm H&E đại diện cho pancreata thu hoạch từ 24- chuột tuần tuổi.Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasG12D / plus (phải): mất hoàn toàn tính phân cực của tế bào, mất nhân rõ rệt, và sự nảy chồi của các cụm tế bào vào lòng ống, cùng với xơ hóa và keratin dồi dào. Kiểm soát Pdx 1- Cre; KrasG12D / plus (trái): không có tổn thương. Độ phóng đại: × 10. (E) Các tổn thương PanIN đại diện của cả hai nhóm. Độ phóng đại: × 10.

3.4. Klotho hợp tác phát triển PDAC tại Vioo

Dựa trên các nghiên cứu trước đây cho thấy sự phát triển PDAC ở chuột mang đột biến Kras và mất hoạt tính ức chế khối u [4], chúng tôi đã kiểm tra Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasG12D / cộng với pancreata chuột cho các tổn thương. Do sự tiêu hóa nhanh chóng của mô tụy bởi dịch tụy, chúng tôi chỉ có thể sử dụng pancreata của những con chuột đã bị hy sinh. Các mẫu Pdx 1- Cre; KL -7-; KrasGi2D / plus (n =7) ​​và điều khiển Pdx 1- Cre; Chuột KrasGi2D / plus (n =8) được đánh giá bệnh lý (tuổi chết trung bình: 36 và 49 tuần, tương ứng). PDAC đã được xác định trong hai Pdx 1- Cre; KL - / -; Chuột KrasG12D / plus, nhưng không có chuột nào trong Pdx 1- Cre; Chuột KrasG12D / plus, trong khi PanN2 được ghi nhận trong hai trong số Pdx 1- Cre; KL - / -; KrasG12D / plus chuột và bốn trong số Pdx 1- Cre; Chuột KrasG12D / plus (Hình 4C). Hình ảnh đại diện được hiển thị (Hình 4D-E).

3.5. Điều trị bằng sKL ức chế khối u tuyến tụy và kéo dài thời gian sống sót ở Vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0. 729; Hình 5F-G).

Mô hình thứ hai được sử dụng cho mục đích này là mô hình KPC. Các con chuột được kết hợp theo giới tính, tuổi và cân nặng, và được điều trị bằng cách tiêm sKL hòa tan ở người hoặc kiểm soát phương tiện trong tối đa 30 tuần. Cái chết xảy ra một cách tự nhiên hoặc chết vì các dấu hiệu của đau khổ nghiêm trọng, hoặc gánh nặng khối u cần phải hy sinh, bắt đầu. Tỷ lệ sống của những con chuột được điều trị bằng sKL đã tăng lên so với đối chứng (p =0. 005; Hình 5H).

Hình 5. Điều trị sKL làm giảm sự phát triển khối u cục bộ và kéo dài thời gian sống sót trong cơ thể sống. (AG) Chuột BALB / c khỏa thân thể thao được cấy với các tế bào MIA PaCa -2 biểu hiện ổn định m-Cherry / luciferase (tế bào 1 × 10 độ trên mỗi chuột). 10 ngày sau, chuột được tiêm AAV-sKL liều cao (5 × 1011 GC / mL, n =7), AAV-sKL liều thấp (5 × 1010 GC / mL, n {{13} }), hoặc kiểm soát AAV-null (5 × 1010 GC / mL, n=8). (A) Thể tích khối u được đo in vivo bằng thước cặp kỹ thuật số. (B) Hình ảnh đại diện về mô hình sinh học hoạt động luciferase của các khối u cục bộ. (C) Hoạt tínhluciferase của khối u được đo bằng số đếm mỗi phút. (D) Hình ảnh đại diện của khối u được thu hoạch vào ngày hy sinh. (E) Khối lượng của khối u đã thu hoạch. (F) Nồng độ klotho trong máu của con người. *P<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Thảo luận

Nghiên cứu này xác định vai trò của klotho như một chất ức chế khối u trong PDAC. Các phân tích tin sinh học cho thấy mối tương quan giữa sự sống sót của bệnh nhân PDAC, và mức độ biểu hiện klotho và sự methyl hóa DNA, và chứng minh một mô hình siêu methyl hóa độc đáo của KLOTHO trong các khối u tuyến tụy. Sử dụng một mô hình chuột mới, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc hạ gục klotho tuyến tụy hợp tác với đột biến Kras để giảm khả năng sống sót và tạo ra PDACin Vivo. Hơn nữa, L ức chế sự phát triển của các khối u có nguồn gốc từ tế bào tuyến tụy trong mô hình xenograft và kéo dài thời gian sống sót của chuột KPC.

Klotho im lặng về mặt biểu sinh thông qua quá trình siêu methyl hóa promoter trong một loạt các khối u ác tính [16,23,25,26, 28-31, 33,39,40]. Điều này cũng đã được báo cáo trong các nhóm nhỏ trong PDAC, cũng như trong mối tương quan giữa khả năng sống sót của bệnh nhân PDAC với mức độ biểu hiện klotho và sự methyl hóa DNA [17,34]. Theo đó, đánh giá của chúng tôi về OS, cũng như PFI bằng cách sử dụng dữ liệu bao gồm 178 mẫu PDAC, cho thấy mối liên quan dương tính với biểu hiện klotho và mối liên quan âm tính tương ứng với sự methyl hóa DNA KLOTHO. Những dữ liệu này chỉ ra rằng biểu hiện klotho có thể được điều chỉnh bởi quá trình methyl hóa DNA và củng cố quan điểm rằng những thông số này có thể dùng để đánh giá tiên lượng của bệnh nhân PDAC.

Các nghiên cứu trước đây về sự methyl hóa DNA của KLOTHO trong PDAC [17,34] dựa trên một số ít bệnh nhân và các thí nghiệm in vitro và không phân tích mô hình methyl hóa của các vị trí cụ thể trong toàn bộ gen KLOTHO. Phân tích hiện tại, dựa trên tập dữ liệu mở rộng nói trên, tiết lộ rằng ba vị trí cụ thể, hai trong số đó nằm trong CpGisland ở đợt cuối cùng của KLOTHO, hoạt động như những bộ điều chỉnh tiêu cực của biểu hiện klotho bằng cách siêu methyl hóa. Trước đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng một trong những vị trí này, cg23282559, cũng bị hypermethyl hóa trong ung thư đại trực tràng [25]. Người ta vẫn chưa xác định được liệu các trang web này có đóng một vai trò nào đó trong việc điều chỉnh klotho đối với các khối u ác tính khác hay không.

Klotho được biết là biểu hiện trong tuyến tụy; tuy nhiên, vai trò của nó đối với sự phát triển và chức năng bình thường của tuyến tụy vẫn chưa được biết rõ. Trong khi chuột thiếu klotho cho thấy sản xuất insulin giảm, cùng với sự gia tăng đáng kể độ nhạy insulin [22], sự biểu hiện quá mức của klotho ở chuột dẫn đến tăng insulin trong máu lúc đói, kèm theo kháng insulin [8]. Đáng ngạc nhiên, mô hình chuột được trình bày trong nghiên cứu này, chứa đựng sự đánh sập tuyến tụy, không cho thấy kiểu hình rõ ràng của bệnh tiểu đường hoặc thay đổi độ nhạy cảm với insulin. Hơn nữa, không có ảnh hưởng đến hình thái tuyến tụy, sự hình thành khối u hoặc sự sống còn. Những kết quả này cho thấy rằng mất klotho tuyến tụy có thể được bù đắp bằng các tác động ngoại vi của klotho toàn thân hoặc do các cơ chế khác. Hơn nữa, sự phát triển của bệnh tiểu đường là một quá trình phức tạp, không chỉ phụ thuộc vào tuyến tụy mà còn phụ thuộc vào gan, cơ và các mô mỡ. Như trong mô hình của chúng tôi, klotho bị đánh gục chủ yếu ở tuyến tụy, nó có thể giải thích cho việc thiếu bệnh tiểu đường trong mô hình chuột này.

Phù hợp với các kết quả lâm sàng đã trình bày, Pdx 1- Cre; KL - / -; Chuột KrasG12D / plus đã rút ngắn tuổi thọ so với chuột đối chứng Pdx 1- Cre; KrasGi2D / cộng với chuột (48 tuần so với 60 tuần, tương ứng). Mặc dù chúng tôi không thể kiểm tra bệnh lý tất cả các pancreata của chuột, tỷ lệ PDAC công khai cao hơn đã được thấy trong Pdx 1- Cre; KL -7-; Chuột KrasG12D / plus, so với chuột điều khiển Pdx 1- Cre; Chuột KrasG2D / plus. Những kết quả này chứng minh tầm quan trọng của klotho trong sự phát triển của khối u ác tính tuyến tụy và sự sống sót trong cơ thể sống. Kiểu hình của Pdx 1- Cre; KL - / -: Chuột KrasGl2D / plus ít rõ rệt hơn, so với các mô hình kết hợp mất chất ức chế khối u khác với đột biến Kras. Ví dụ, chuột KPC có thời gian sống trung bình chỉ là 5 tháng [5]. Có thể điều này là do việc bù đắp một phần tổn thất của klotho cục bộ bằng cách luân chuyển klotho. Ngoài ra, biểu hiện còn lại của klotho trong tuyến tụy có thể đã ảnh hưởng đến kiểu hình. Đạt được mục tiêu hoàn toàn im lặng của klotho trong các nghiên cứu trong tương lai sẽ cho phép đánh giá thấp hơn vai trò của nó trong các mô khác nhau, cũng như đối trọng giữa tác dụng tại chỗ và toàn thân của klotho.

Chúng tôi đã trình bày hai mô hình chứng minh tiềm năng điều trị của klotho. Trong mô hình chuột xenograft, việc tiêm vec tơ da virus ung thư tuyến tụy có hiệu quả cao, không chỉ trong việc ức chế sự phát triển của khối u mà còn làm giảm kích thước của khối u. Điều trị bắt đầu khi các khối u đã được nhìn thấy và hình thành, giống như thời điểm bắt đầu điều trị ở hầu hết các bệnh nhân. Kết quả cho thấy cô ấy có thể được sử dụng cho liệu pháp gen, do đó vượt qua những trở ngại lớn đối với sự ổn định và phân phối hiệu quả của các loại thuốc dựa trên protein và peptide. Hơn nữa, một mối tương quan nghịch giữa trọng lượng khối u và nồng độ klotho trong máu của con người đã được ghi nhận. Nghiên cứu sâu hơn về nồng độ klotho trong máu liên quan đến tác dụng của nó có thể giúp dự đoán ai sẽ được lợi khi điều trị bằng klotho hoặc SQL, cũng như giữ mức trong cửa sổ điều trị.

Sự phát triển của các liệu pháp dựa trên klotho là một mục tiêu được nhiều nhóm nghiên cứu, cũng như các công ty dược phẩm tìm kiếm. Liên quan đến điều trị ung thư, có một số cách được khám phá. Người ta có thể tăng mức klotho nội sinh bằng cách tận dụng các cơ chế biểu sinh được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự biểu hiện klotho. Người ta đã báo cáo rằng promoter klotho bị methyl hóa nhiều trong nhiều bệnh ung thư, và cũng là một chức năng của tuổi tác. Do đó, các hợp chất ức chế DNA methyl transferase có thể trở thành mục tiêu điều trị để tăng biểu hiện klotho. Mặt khác, người ta có thể tăng mức độ bằng cách thêm klotho ngoại sinh, ví dụ, bằng cách sử dụng liệu pháp gen hoặc cung cấp một protein klotho tái tổ hợp. Ở đây, chúng tôi đã báo cáo việc giới thiệu vùng hoạt động của klotho (L) bằng cách sử dụng hệ thống AAVexpression, dẫn đến hiệu quả điều trị trong một mô hình ung thư tuyến tụy.

Tiếp theo, chúng tôi đã chỉ ra rằng điều trị bằng bầu trời hòa tan kéo dài thời gian sống sót của chuột KPC, một mô hình được biết là tổng hợp PDAC của con người. Điều này đã chứng minh tác dụng của bầu trời trong một vật chủ có thẩm quyền miễn dịch và môi trường khối u tự nhiên, hỗ trợ thêm cho việc sử dụng SSL có thể trong các cơ sở lâm sàng.

5. Kết Luận

Kết luận, nghiên cứu này đã xác định klotho là một chất ức chế khối u mạnh trong PDAC. Các phác đồ điều trị hiện tại cho PDAC là không đủ và việc sử dụng sKL ngoại sinh có thể được coi là một chiến lược mới để điều trị PDAC.

Bài viết này được trích từ Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers