Acteoside như một lựa chọn điều trị tiềm năng cho ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát: Một nghiên cứu tiền lâm sàng

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen và Zhiyong Wang

trừu tượng

Cơ sở: Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một khối u ác tính phổ biến với các đặc điểm tiên lượng xấu, tỷ lệ mắc bệnh cao và tỷ lệ tử vong trên toàn thế giới. Đặc biệt, chỉ có một số lựa chọn điều trị toàn thân dành cho bệnh nhân HCC tiến triển và bao gồm sorafenib và chế độ atezolizumab cộng với bevacizumab được mô tả gần đây là phương pháp điều trị đầu tay có thể. Ở đây chúng tôi đề xuất acteoside, một glycoside phenylethanoid phân bố rộng rãi trong nhiều cây thuốc như một ứng cử viên tiềm năng chống lại HCC nâng cao.

Phương pháp: Sự tăng sinh tế bào, sự hình thành thuộc địa và sự di cư được phân tích trong ba dòng tế bào HCC của người BEL7404, HLF và JHH -7. Thử nghiệm tạo mạch được thực hiện bằng HUVESs. Mô hình chuột khỏa thân xenograft BEL7404 hoặc JHH -7 được thành lập để phân tích tác dụng chống khối u có thể có của acteoside. qRT-PCR và phương pháp thấm phương tây đã được sử dụng để tiết lộ các cơ chế chống khối u tiềm năng của acteoside.

Kết quả:Acteoside từ cistancheức chế sự tăng sinh tế bào, sự hình thành thuộc địa và sự di cư ở cả ba dòng tế bào HCC của người BEL7404, HLF và JHH -7. Việc cấm hình thành mạch bằng acteoside đã được tiết lộ bằng cách ức chế sự hình thành ống và sự di chuyển tế bào của HUVECs. Sự kết hợp giữa acteoside và sorafenib tạo ra sự ức chế mạnh mẽ hơn sự hình thành thuộc địa tế bào và sự di chuyển của tế bào HCC cũng như sự hình thành mạch của HUVECs. Hiệu quả chống khối u in vivo của acteoside đã được chứng minh thêm trong mô hình chuột khỏa thân xenograft BEL7404 hoặc JHH -7, với sự tăng cường khi kết hợp với sorafenib trong việc ức chế sự phát triển của xenograft JHH -7. Việc điều trị thêm các tế bào JHH -7 bằng acteoside cho thấy sự gia tăng mức độ protein ức chế khối u p53 cũng như sự giảm mức độ gen peptidase liên quan đến kallikrein (KLK1, 2, 4, 9 và 10) mà không có ý nghĩa những thay đổi của phần còn lại của gen KLK1–15.

Kết luận:Acteoside từ cistanchecó tác dụng chống khối u có thể thông qua việc điều chỉnh tăng mức p53 cũng như ức chế biểu hiện KLK và hình thành mạch. Acteoside có thể hữu ích như một chất hỗ trợ trong điều trị ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển tại phòng khám.

Từ khóa: Acteoside, Ung thư biểu mô tế bào gan, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

Tiểu sử

Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một khối u ác tính phổ biến với đặc điểm tiên lượng xấu, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao trên toàn thế giới [1, 2]. Các yếu tố khác nhau đã được xác định là góp phần vào sự xuất hiện và tiến triển của HCC, bao gồm nhiễm vi rút viêm gan B hoặc C, sự bất hoạt của các gen ức chế khối u như p53, sự kích hoạt bất thường của các gen sinh ung thư như K-ras và một số phân tử tín hiệu chẳng hạn như PI3K, ERK / MAPK, và Wnt / -catenin cũng như sự trốn tránh của hệ thống miễn dịch vật chủ [3, 4]. Đối với việc quản lý ung thư biểu mô tế bào gan, cắt bỏ, ghép gan và cắt bỏ bằng sóng cao tần là những lựa chọn cho bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn đầu, nhưng có tỷ lệ tái phát và di căn cao [3, 5, 6]. Ngoài ra, chỉ có một số lựa chọn điều trị toàn thân dành cho bệnh nhân HCC tiến triển và bao gồm sorafenib và chế độ atezolizumab cộng với bevacizumab được mô tả gần đây là phương pháp điều trị đầu tay [7]. Trong bối cảnh này, việc phát triển các tác nhân mới nhắm mục tiêu vào nhiều mục tiêu phân tử hoặc thiết lập một chiến lược mới như áp dụng liệu pháp kết hợp trong điều trị ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển là rất quan trọng và được quan tâm.

Acteoside từ cistanchelà một glycoside phenylethanoid phân bố rộng rãi trong nhiều cây thuốc, bao gồm Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9], và Ligustrum purpurascens [10]. Nhiều bằng chứng đã chỉ ra rằng acteoside có thể thực hiện các hoạt động sinh học khác nhau, bao gồm cả hoạt động chống khối u của nó. Ví dụ, acteoside cho thấy tác dụng chống tăng sinh mạnh đối với tế bào ung thư tuyến tiền liệt [11]. Việc cung cấp acteoside vào phúc mạc đã ngăn chặn sự phát triển của khối u ở mô hình chuột bị u ác tính có thể thông qua việc ức chế protein kinase C [12]. Ngoài ra, acteoside tăng cường sự nhạy cảm của các tế bào ung thư đại trực tràng với 5- Fluorouracil thông qua tín hiệu PI3K / Akt nhắm mục tiêu [13]. Dữ liệu trước đây của chúng tôi cũng cho thấy sự ức chế hình thành hắc tố bằng acteoside trong tế bào u ác tính B16 [14]. Mặc dù vậy, có rất ít thông tin về hiệu quả có thể có của acteoside trong điều trị HCC và các cơ chế tiềm ẩn cơ bản.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằngActeoside từ cistancheức chế sự tăng sinh tế bào, hình thành khuẩn lạc và di cư ở cả ba dòng tế bào HCC của người BEL7404, HLF và JHH7. Sự hình thành mạch cũng bị ức chế sau khi điều trị bằng acteoside, thể hiện qua việc ức chế sự hình thành ống và sự di chuyển tế bào của HUVECs. Hiệu quả chống khối u in vivo của acteoside còn được chứng minh trong mô hình chuột khỏa thân xenograft BEL7404 hoặc JHH -7, với sự tăng cường khi kết hợp với sorafenib trong việc ức chế sự phát triển của xenograft JHH -7. Tác dụng chống khối u của acteoside có thể được quy cho việc điều hòa p53 của nó cũng như ức chế các KLK và hình thành mạch.

Phương pháp

Nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan ở người (HCC) BEL7404, HLF và JHH7 được lấy từ Bộ sưu tập nuôi cấy loại Mỹ và được nuôi cấy thường quy trong môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bò thai được bổ sung 100 đơn vị / ml penicillin G và 100 ug / ml streptomycin trong tủ ấm được làm ẩm ở 37 độ với 5 phần trăm carbon dioxide. Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVECs) được phân lập từ tĩnh mạch rốn người (do Phòng thí nghiệm Nghiên cứu ScienCell, San Diego, Hoa Kỳ cung cấp) và được duy trì trong môi trường tế bào nội mô như đã mô tả trước đây [15].

Thuốc thửActeoside từ cistanche (A 0 1) được mua từ Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, China; Lô số 100581; Độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 99 phần trăm bởi HPLC). Sorafenib được lấy từ Selleck Chemicals (Houston, Hoa Kỳ). Chúng tôi hòa tan acteoside trong nước muối 0,9%. Dung dịch gốc của sorafenib được chuẩn bị trong dimethyl sulfoxide (DMSO; 10 mM), được phân tách và bảo quản ở - 20 độ.

Loài vật

Chuột đực BALB / c (Nu / Nu) (18-20 g, 6–8 tuần tại thời điểm nhận) đã được sử dụng trong nghiên cứu (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc). Các con vật đã được nhốt trong lồng polysulfone được thông gió riêng biệt trong một căn phòng được kiểm soát nhiệt độ và ánh sáng (chu kỳ tối 12 giờ sáng - 12 giờ, đèn sáng lúc 7 giờ: 00 sáng) và được tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống . Tất cả các quy trình thử nghiệm đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Tổ chức phê duyệt và được thực hiện theo hướng dẫn của Hiệp hội Quốc tế về Nghiên cứu Đau đớn liên quan đến việc sử dụng động vật thí nghiệm.

Xét nghiệm tăng sinh tế bào Hoạt động chống tăng sinh được thực hiện bằng xét nghiệm MTT. Tóm lại, các tế bào được mạ với mật độ 4– 5 × 103 tế bào mỗi giếng trong 96- đĩa giếng. Sau khi được gắn vào qua đêm, các tế bào được xử lý bằng một loạt các nồng độ acteoside. Sau khi điều trị bằng thuốc vào thời điểm đã chỉ định, các tế bào được ủ với 3- (4, 5- Dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Nồng độ cuối cùng: 5 ug / ml) trong 3–4 giờ ở 37 độ. Sản phẩm formazan được hòa tan trong DMSO để định lượng ở bước sóng 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 tế bào được đếm dưới kính hiển vi ánh sáng (độ phóng đại × 100; Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

Thử nghiệm chữa lành vết thương Các tế bào được gieo hạt trong {{{0}} đĩa giếng (1 × 105 tế bào mỗi giếng) và được nuôi cấy đến 90 phần trăm hợp lưu. Lớp tế bào được cào bằng đầu pipet 200 ul vô trùng để tạo ra một khoảng trống vết thương. Sự di chuyển của tế bào vào vùng bị thương được hình dung tại các điểm thời gian đã chỉ định (0, 10 và 24 giờ) dưới kính hiển vi ánh sáng ngược ở độ phóng đại × 100. Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần.

Thử nghiệm hình thành ống Các HUVEC đã được nuôi cấy như đã mô tả trước đây [15]. Tóm lại, các đĩa giếng 96- được phủ Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó đưa trở lại tủ ấm để trùng hợp trong 30–40 phút. Sau đó, các HUVEC được gieo với mật độ 2 × 105 tế bào / mL và được xử lý bằng các loại thuốc nhất định trong 8 giờ. Sự hình thành ống được chụp bằng kính hiển vi đảo ngược tại các điểm thời gian đã chỉ định và được phân tích bằng phần mềm ImageJ.

Phân tích Western blotting

Tổng số dịch ly giải tế bào được chuẩn bị bằng dung dịch đệm xét nghiệm kết tủa phóng xạ (RIPA) (5 0 mM Tris HCl ở pH 8. 0, 150 mM NaCl, 1 phần trăm NP40, 1 phần trăm natri deoxycholate, 0,1 phần trăm SDS, 10 ug / ml leupeptin, 10 ug / ml aprotinin và 2 mM PMSF). Các mẫu protein với lượng bằng nhau (20 ug / làn) được tách trên gel SDS-PAGE và chuyển sang màng PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Màng được ủ qua đêm với kháng thể p53 (Công nghệ tín hiệu tế bào, Boston, MA). Đối với kiểm soát tải trọng, các màng được rửa sạch bằng dung dịch đệm tước và được quấn lại bằng kháng thể -actin (Công nghệ sinh học Santa Cruz, Santa Cruz, CA). Protein được phát hiện bằng hệ thống phát hiện ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​các dòng tế bào bằng cách sử dụng thuốc thử Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ) và trải qua phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng một bộ kit bán sẵn trên thị trường. QRT-PCR thời gian thực sử dụng 2xSYBR xanh qPCR Supermix được tiến hành trên máy Stratagene Mx3000P PRC ma chine (Agilent Technologies, USA). Trình tự mồi được hiển thị bên dưới: sense 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC -3 ′ và anti-sense 5′- CAAACAAGTT GTGGCGACCC -3 ′ cho KLK1; sense 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC -3 ′ và anti-sense 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG -3 ′ cho KLK2; giác 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA -3 ′ và phản 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG -3 ′ cho KLK3; giác 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC -3 ′ và phản giác 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT -3 ′ cho KLK4; giác 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT -3 ′ và phản 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT -3 ′ cho KLK5; giác 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA -3 ′ và phản 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT -3 ′ cho KLK6; giác 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG -3 ′ và phản giác 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT -3 ′ cho KLK7; cảm giác 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG -3 ′ và phản giác 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG -3 ′ cho KLK8; giác 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT -3 ′ và phản 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG -3 ′ cho KLK9; cảm giác 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC -3 ′ và phản giác 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA -3 ′ cho KLK10; giác 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT -3 ′ và phản cảm 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT -3 ′ cho KLK11; giác 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG -3 ′ và phản giác 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC -3 ′ cho KLK12; giác 5′-CCTGAACCACGACCATGACA -3 ′ và phản giác 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT -3 ′ cho KLK13; cảm giác 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC -3 ′ và phản giác 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA -3 ′ cho KLK14; giác 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG - 3 ′ và phản giác 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG - 3 ′ cho KLK15; cảm giác 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT -3 ′ và phản giác 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC -3 ′ cho GAPDH. Giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) của mỗi gen KLK được chuẩn hóa thành giá trị của GAPDH và được phân tích bằng phần mềm MxPro.

Hoạt động chống khối u in vivo của A 0 1 đơn lẻ hoặc kết hợp với sorafenib Huyền phù tế bào BEL74 0 4 đã được chuẩn bị (3 × 1 0 6 tế bào) và được tiêm dưới da vào sườn bên phải của những con chuột khỏa thân thể thao. Mười ngày sau khi cấy, những con chuột mang khối u (trọng lượng cơ thể (g): 22–26; trung bình ± SEM: 23,8 ± 0. 14) được sàng lọc và chọn ngẫu nhiên thành 7 nhóm điều trị theo thể tích khối u ({ {12}} mm3). Tổng cộng 38 con chuột được chỉ định vào các nhóm điều trị khác nhau (n=5 mỗi nhóm ngoại trừ nhóm mô hình (n=8)). Sau đó, động vật được điều trị qua đường miệng với acteoside (A01; 12,5, 25 và 50 mg / kg), sorafenib một mình (50 mg / kg) hoặc kết hợp với A01 (50 mg / kg) một lần mỗi ngày trong 14 ngày. Hơn nữa, liều 20 mg / kg A01 cũng được truyền qua đường tĩnh mạch. Liều lượng được lựa chọn dựa trên các nghiên cứu trước đây và dữ liệu sơ bộ của chúng tôi [15]. Sự phát triển của khối u được theo dõi 3 hoặc 4 ngày một lần bằng thước cặp điện tử, với thể tích được tính là 0,5xlengthxwidth (mm3). Ngoài ra, một thử nghiệm song song sử dụng phương pháp cấy JHH -7 đã được đưa vào. Bảy ngày sau khi cấy, những con chuột mang khối u (trọng lượng cơ thể (g): 20–26; trung bình ± SEM: 24,0 ± 0,20) được sàng lọc và chọn ngẫu nhiên thành các nhóm điều trị phù hợp với thể tích khối u (80-130 mm3 ). Tổng cộng 23 con chuột được phân vào 4 nhóm điều trị (n=5 mỗi nhóm ngoại trừ nhóm mô hình (n=8)). Các con vật sau đó được nhận A01 (20 mg / kg, iv), sorafenib một mình (50 mg / kg, ig) hoặc kết hợp với A01 (20 mg / kg, iv) một lần mỗi ngày trong 14 ngày liên tục. Tất cả những con chuột được gây mê bằng chloral hydrat (350 mg / kg) và hy sinh bằng cách trật khớp cổ vào cuối giai đoạn quan sát. Và khối u đã được loại bỏ và hình ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Trừ khi có quy định khác, các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai (ANOVA), sau đó là kiểm tra Tukey posthoc. Giá trị thể tích khối u được thể hiện dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình (SEM). ANOVA hai chiều sau đó là các xét nghiệm Tukey được sử dụng để phân tích dữ liệu thể tích khối u. Phần mềm GraphPad Prism được sử dụng để phân tích thống kê. Giá trị p <0. 05="" được="" coi="" là="" có="" ý="" nghĩa="" thống="">

Kết quả

Ảnh hưởng của A01 đối với sự tăng sinh và hình thành khuẩn lạc của HCC trong ống nghiệm

Ba dòng tế bào HCC (BEL7404, HLF và JHH7) được sử dụng cho xét nghiệm tăng sinh tế bào. Như thể hiện trong Hình 1, xét nghiệm MTT cho thấy A01 ức chế sự tăng sinh của cả ba tế bào HCC. Để hỏi thêm liệu hoạt động chống tăng sinh của A01 có phải là do khả năng ức chế sự sinh dòng tế bào của nó hay không, thử nghiệm hình thành khuẩn lạc đã được thực hiện. A01 ở 100 μM cho thấy sự ức chế mạnh mẽ sự hình thành khuẩn lạc trong các tế bào BEL7404 (Hình 2a và b). Khi kết hợp với sorafenib (2 μM), hiệu lực ức chế mạnh hơn so với A01 hoặc sorafenib một mình. Kết quả tương tự cũng được thấy trong hai tế bào HCC khác, HLF và JHH -7 (Hình 2c và d).

Ảnh hưởng của A01 đơn lẻ hoặc kết hợp với sorafenib đối với sự di chuyển tế bào của HCC trong ống nghiệm

Tiếp theo, chúng tôi đánh giá sự di chuyển của tế bào bằng cách sử dụng xét nghiệm vết xước. Như thể hiện trong Hình 3, sự kết hợp của A01 (100 hoặc 500 μM) và sorafenib (10 μM) đã ngăn chặn đáng kể quá trình lành vết thương ở cả ba tế bào HCC, khi so sánh với nhóm đối chứng. Đối với các tế bào BEL7404, cả A01 (100 hoặc 500 μM) và sorafenib (10 μM) chỉ tạo ra xu hướng ngăn ngừa việc chữa lành vết thương không có ý nghĩa thống kê (Hình 3a và d). Đối với tế bào HLF, A01 ở 500 μM và sorafenib ở 10 μM ức chế quá trình chữa lành vết thương. Đặc biệt, A01 (500 μM) kết hợp với sorafenib (10 μM) tạo ra sự ức chế chữa lành vết thương mạnh hơn so với sorafenib đơn thuần (Hình 3b và e). Đối với tế bào JHH, việc chữa lành vết thương bị ngăn cản bởi A01 (500 μM) và sorafenib (10 μM). Sự kết hợp của A01 (100 μM) và sorafenib (10 μM) tạo ra sự ức chế chữa lành vết thương mạnh hơn so với A01 (100 μM) hoặc sorafenib (10 μM) một mình. Hơn nữa, A01 ở 500 μM kết hợp với sorafenib (10 μM) cho thấy sự ức chế chữa lành vết thương mạnh hơn so với A01 (500 μM) hoặc sorafenib (10 μM) đơn thuần (Hình 3c và f).

Ảnh hưởng của A01 một mình hoặc kết hợp với sorafenib trên sự hình thành mạch in vitro

Sự hình thành mạch liên quan chặt chẽ với sự phát triển, tiến triển và di căn của khối u [16], và do đó được coi là một trong những mục tiêu can thiệp trong điều trị ung thư. Đầu tiên, chúng tôi thực hiện một thử nghiệm hình thành ống để phân tích khả năng hình thành mạch trong ống nghiệm. Như thể hiện trong Hình 4, điều trị trong 3 giờ chỉ với sorafenib (10 μM) hoặc kết hợp A01 (100 và 500 μM) và sorafenib (10 μM) bắt đầu cho thấy tác dụng ức chế sự hình thành cấu trúc giống như mạch máu, tức là độ giãn dài và căn chỉnh của các HUVEC (Hình 4a và c). Sau khi điều trị trong 8 giờ, A01 (100 và 500 μM), sorafenib (10 μM) cũng như sự kết hợp của A01 và sorafenib đều ức chế đáng kể sự hình thành cấu trúc giống mạch, với sự ức chế mạnh hơn bởi sự kết hợp của A01 và sorafenib hơn A01 hoặc sorafenib một mình (Hình 4a và c). Ngoài ra, sự di chuyển tế bào của HUVECs là một bước quan trọng để hình thành các mạch mới trong quá trình hình thành mạch và do đó được nghiên cứu. Như thể hiện trong Hình 4b và d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM) cũng như sự kết hợp của A01 (100 và 500 μM) và sorafenib (10 μM) đều ức chế đáng kể sự di chuyển tế bào của HUVECs. A01 (500 μM) kết hợp với sorafenib (10 μM) tạo ra sự ức chế mạnh hơn A01 (500 μM) hoặc sorafenib (10 μM) một mình.

Ảnh hưởng của riêng A01 hoặc kết hợp với sorafenib lên sự phát triển khối u in vivo của BEL7404 và JHH -7 HCC xenografts

Để đánh giá thêm hiệu quả của A 0 1 đơn lẻ hoặc kết hợp với sorafenib đối với sự phát triển khối u in vivo của HCC, chúng tôi đã thiết lập mô hình chuột khỏa thân xenograft dưới da bằng cách sử dụng BEL74 0 4 hoặc JHH -7 tế bào. Như thể hiện trong Hình 5, thể tích khối u đã giảm đáng kể sau khi điều trị bằng A 0 1 (25 và 5 0 mg / kg, qua đường miệng; 2 0 mg / kg, qua tĩnh mạch đuôi; tất cả p <0,01 so="" với="" nhóm="" mô="" hình)="" hoặc="" sorafenib="" (50="" mg="" kg,="" qua="" đường="" miệng;="" p=""><0,01 so="" với="" nhóm="" mô="" hình)="" (hình="" 5a="" và="" b).="" sự="" kết="" hợp="" của="" a01="" (50="" mg="" kg)="" và="" sorafenib="" (50="" mg="" kg)="" cho="" thấy="" sự="" ức="" chế="" mạnh="" hơn="" sự="" phát="" triển="" của="" khối="" u="" khi="" so="" sánh="" với="" sorafenib="" đơn="" lẻ="" (p=""><0,01), nhưng="" tạo="" ra="" tác="" dụng="" tương="" tự="" như="" a01="" đơn="" lẻ="" (hình="" 5a="" và="" c="" ).="" tiếp="" theo,="" chúng="" tôi="" sử="" dụng="" mô="" hình="" chuột="" khỏa="" thân="" xenograft="" jhh="" -7="" để="" kiểm="" tra="" thêm="" hiệu="" quả="" chống="" khối="" u="" có="" thể="" có="" của="" a01.="" như="" thể="" hiện="" trong="" hình="" 6,="" điều="" trị="" bằng="" a01="" (20="" mg="" kg,="" iv)="" hoặc="" sorafenib="" (50="" mg="" kg,="" ig)="" tạo="" ra="" sự="" ức="" chế="" đáng="" kể="" sự="" phát="" triển="" khối="" u="" của="" jhh="" -7="" xenograft="" (p=""><0,01 so="" với="" nhóm="" mô="" hình="" ),="" với="" sự="" ức="" chế="" lớn="" hơn,="" khi="" kết="" hợp="" với="" nhau="" (hình="" 6a="" và="" b;="" p=""><0,01 so="" với="" a01="" hoặc="" nhóm="" sorafenib="" một="">

Có thể điều chế peptidase liên quan đến kallikrein và p53 bằng cáchActeoside từ cistanche

Peptidase liên quan đến kallikrein (KLK) đã được đề xuất như một dấu ấn sinh học ung thư trong chẩn đoán và tiên lượng các bệnh ung thư khác nhau, bao gồm cả ung thư biểu mô tế bào gan do biểu hiện rối loạn điều hòa của nó [17–19]. Trong trường hợp này, chúng tôi đã phát hiện biểu hiện gen của KLK1–15 trong dòng tế bào HCC JHH -7. Như được thể hiện trong Hình 7, điều trị với acteoside tạo ra sự ức chế đáng kể các mức mRNA KLK1, 2, 4, 9 và 10 (Hình 7a-e), không có sự thay đổi đáng kể nào của phần còn lại của KLK1–15 (dữ liệu không được hiển thị ). Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện mức độ protein ức chế khối u p53 và cho thấy sự gia tăng khi điều trị với acteoside (Hình 7f).

Thảo luận

Việc quản lý ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển từ lâu đã trở nên khó khăn do không có khả năng chẩn đoán ở các giai đoạn trước đó và tính kháng hóa chất của khối u [5, 6]. Sorafenib, chất ức chế multikinase được báo cáo là ức chế sự tăng sinh tế bào và hình thành mạch, cùng với một chất ức chế multi-kinase đường uống khác lenvatinib đã trở thành phương pháp điều trị tiêu chuẩn cho HCC nâng cao [3, 5, 20, 21]. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót nói chung là khiêm tốn do tỷ lệ đáp ứng thấp và không phù hợp trong các cơ sở lâm sàng [3, 22]. Một nghiên cứu gần đây cho thấy atezolizumab cộng với bevacizumab tạo ra kết quả lâm sàng tốt hơn sorafenib ở những bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tế bào gan không thể cắt bỏ, làm cho sự kết hợp này trở thành một lựa chọn điều trị đầu tay mới cho bệnh ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển [7]. Trong bối cảnh này, chúng tôi đã xác định rằng glycoside phenylethanoid,Acteoside từ cistancheức chế sự tăng sinh tế bào, sự hình thành thuộc địa và sự di cư trong ba dòng tế bào HCC của người BEL7404, HLF và JHH -7 cũng như sự hình thành mạch của HUVECs bị cấm. Sự kết hợp giữa acteoside và sorafenib tạo ra sự ức chế mạnh mẽ hơn sự hình thành thuộc địa tế bào và sự di chuyển của tế bào HCC cũng như sự hình thành mạch của HUVECs. Acteoside đã trình bày hiệu quả chống khối u trong mô hình chuột khỏa thân xenograft BEL7404 hoặc JHH -7, với sự tăng cường khi kết hợp với sorafenib trong việc ức chế sự phát triển của xenograft JHH -7. Các phân tích sâu hơn cho thấy sự gia tăng p53 cũng như giảm một số gen KLK. Do đó, việc sử dụng acteoside có thể là chất bổ trợ trong điều trị ung thư biểu mô tế bào gan cấp tiến triển tại phòng khám nên được xem xét.

Việc thu thập bằng chứng đã cho thấy tác dụng chống khối u củaActeoside từ cistanchetrong các tế bào khối u khác nhau như tế bào u ác tính B16, tế bào u nguyên bào thần kinh đệm, tế bào ung thư đại trực tràng, tế bào ung thư biểu mô vảy ở miệng, tế bào ung thư tuyến tiền liệt và tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người [11–13, 23–25] hoặc ở động vật mang khối u [12]. Mặc dù vậy, rất ít nghiên cứu tập trung vào tác động của acteoside đối với HCC in vitro hoặc in vivo, ngoại trừ một nghiên cứu sử dụng diethylnitrosamine làm chất gây ung thư để gây ra ung thư gan ở chuột và tiết lộ biện pháp hóa học bằng acteoside [26]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã chỉ ra sự ức chế bởi acteoside đối với sự tăng sinh tế bào, sự hình thành khuẩn lạc và sự di chuyển trong các dòng tế bào HCC cũng như sự phát triển của khối u ở chuột mang xenografts dòng tế bào HCC, do đó trực tiếp chứng minh tác dụng chống khối u của acteoside trong HCC. Hơn nữa, sự kết hợp của acteoside và sorafenib tạo ra tác dụng chống khối u thậm chí còn mạnh hơn. Kết hợp với bằng chứng cho thấy rằng acteoside bảo vệ chống lại các tổn thương gan [27–29] mà không có tác dụng độc hại ở động vật và không gây đột biến [30], nó dường như khả thi cho việc áp dụng trong tương lai của liệu pháp kết hợp giữa acteoside và sorafenib ở những bệnh nhân tiến triển. HCC trong phòng khám.

Họ kallikrein ở người bao gồm 15 protease serine tương đồng, chuỗi đơn, tiết ra trypsin- hoặc chymotrypsin (KLK1–15) và có liên quan đến việc điều chỉnh sự phát triển của khối u, tiến triển tân sinh, hình thành mạch và di căn [18, 31]. Đặc biệt, các KLK đã được đề xuất như một dấu ấn sinh học ung thư trong chẩn đoán và tiên lượng các bệnh ung thư khác nhau, bao gồm ung thư biểu mô tế bào gan do biểu hiện rối loạn điều hòa của nó [17–19]. Ví dụ, KLK1 được đề xuất là dấu ấn sinh học của ung thư dạ dày do làm tăng nồng độ KLK1 trong ung thư dạ dày và ngăn chặn sự phát triển của khối u trong ung thư dạ dày bằng cách ức chế hoạt động của KLK1 với protein liên kết kallikrein (KBP) [32]. Trong kịch bản này, chúng tôi quan sát thấy sự ức chế đáng kể mức mRNA KLK bởi acteoside (KLK1, 2, 4, 9 và 10). Ứng dụng KBP, liên kết đặc biệt với kallikrein mô và ức chế hoạt động của kallikrein, đã được báo cáo để ngăn chặn sự phát triển của HCC ở chuột có thể thông qua hoạt động chống tạo mạch của nó [33], cho thấy có thể có sự tham gia của KLK trong sự tiến triển của HCC. Ngoài ra, protein p53 ức chế khối u có thể gây ra sự già đi, quá trình chết rụng cũng như bắt giữ chu kỳ tế bào. Biểu hiện p53 tăng làm tăng nhạy cảm với hóa chất ở các tế bào ung thư [34]. Về vấn đề này, kết quả phương tây của chúng tôi cho thấy sự gia tăng mức p53 sau khi điều trị bằng acteoside. Kết hợp lại với nhau, hợp lý để suy ra rằng acteoside có tác dụng chống khối u trên HCC có thể thông qua việc điều hòa p53 cũng như ức chế KLK và hình thành mạch.

Cần lưu ý rằng mục tiêu phân tử trực tiếp màActeoside từ cistanchecó thể ràng buộc trực tiếp vẫn chưa rõ ràng. Dữ liệu sơ bộ của chúng tôi bằng cách sử dụng kết nối phân tử cho thấy sự liên kết trực tiếp của acteoside với kallikrein (dữ liệu không được hiển thị). Các thí nghiệm tiếp theo sẽ là cần thiết để làm rõ giả định này. Ngoài ra, đối với liều lượng của acteoside được sử dụng để thử nghiệm tế bào trong nghiên cứu cao hơn 1 0 - 5 0 lần so với sorafenib (10 μM), trước tiên chúng tôi đã chọn những liều acteoside đó phù hợp với mối quan hệ giữa liều và đáp ứng trong xét nghiệm MTT. Thứ hai, liều lượng chúng tôi sử dụng (100, 500 μM) tương đương với các nghiên cứu trước đây [35], trong đó acteoside (100 μM) ức chế sự tăng sinh tế bào của tế bào ung thư đại trực tràng. Cuối cùng, mặc dù liều cao hơn trong thử nghiệm tế bào, acteoside tạo ra sự ức chế rõ rệt sự phát triển của khối u ở mô hình chuột khỏa thân xenograft HCC trong nghiên cứu của chúng tôi (25 và 50 mg / kg), tác dụng tương tự như sorafenib (50 mg / kg). Đối với sorafenib, nó được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi với liều 10 μM ở cấp độ tế bào. Liều này có thể so sánh với các nghiên cứu trước đây, trong đó sorafenib được phát hiện là ức chế khả năng sống của tế bào với IC50 là 4,0–6,5 μM trong các dòng tế bào HCC của tế bào PLC / PRF / 5 và tế bào HepG2. Ngược lại, liều lượng sorafenib được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển của xenografts HCC ở chuột cái SCID là 30 mg / kg (theo tỷ lệ) [36]. Tại phòng khám, liều lượng sorafenib được khuyến cáo cho bệnh nhân là 400 mg mỗi lần (2 * 0,2 g), hai lần một ngày (tổng cộng 800 mg mỗi ngày). Liều lượng này đối với sorafenib được sử dụng trong phòng khám trái ngược với liều lượng được sử dụng trong xét nghiệm tế bào (giá trị IC50 tính bằng μM), có thể do khả năng hấp thụ kém trong điều kiện in vivo. Đối với acteoside, dựa trên liều lượng của nó ở chuột (50 mg / kg, ig), liều tương đương của nó cho người (60 kg BW) là khoảng 250 mg. Liều lượng này tương đương với liều lượng sorafenib được sử dụng tại phòng khám và bệnh nhân phải chấp nhận được.

Kết luận Tóm lại,Acteoside từ cistanchecó khả năng tạo ra hiệu ứng chống khối u trong các dòng tế bào HCC và ở những con chuột khỏa thân mang xenografts dòng tế bào HCC, tác động có thể thông qua việc tăng mức p53 cũng như ngăn cấm KLK và hình thành mạch. Acteoside có thể hữu ích như một chất hỗ trợ trong điều trị ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển tại phòng khám.

Người giới thiệu

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Thống kê ung thư toàn cầu 2018: GLOBOCAN ước tính tỷ lệ mắc và tử vong trên toàn thế giới đối với 36 bệnh ung thư ở 185 quốc gia. CA Ung thư J Clin. 2018; 68 (6): 394–424 ..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Ung thư biểu mô tế bào gan. Nat Rev Dis Primers. 2016; 2: 16018.

3. Sim HW, Knox J. Ung thư biểu mô tế bào gan trong thời đại của liệu pháp miễn dịch. Curr Probl Ung thư. 2018; 42 (1): 40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Ung thư biểu mô tế bào gan: cơ chế tiến triển và liệu pháp miễn dịch. Thế giới J Gastroenterol. 2019; 25 (25): 3151– 67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Tranh cãi trong việc quản lý ung thư biểu mô tế bào gan. Đại diện JHEP 2019; 1 (1): 17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Chẩn đoán và điều trị ung thư biểu mô tế bào gan. Semin Diagn Pathol. 2017; 34 (2): 153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab cộng với Bevacizumab trong ung thư biểu mô tế bào gan không thể cắt bỏ. N Engl J Med. Năm 2020; 382 (20): 1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Monoterpenoid và phenylethanoid glycoside từ cuống Ligustrum. Hóa chất thực vật. Năm 1994; 36 (3): 709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC xác địnhacteosideở Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006; 31 (10): 822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Hoạt động chống oxy hóa của glycoside phenylethanoid từ Ligustrum purpurascens. J Thực phẩm Nông nghiệp Chem. 2001; 49 (6): 3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Một chiến lược tổng hợp chung và các đặc tính chống tăng sinh trên các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt cho các glycoside phenylethanoid tự nhiên. Tổ chức Biomol Chem. 2014; 12 (18): 2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Độc tính tế bào có chọn lọc của dược chất acteoside chống lại các tế bào khối u và những hiểu biết về cơ học của nó. Biol oxy hóa khử. 2018; 16: 169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: xác định, định lượng và khả năng nhạy cảm của tế bào Ung thư đại trực tràng với 5- FU bằng cách nhắm mục tiêu theo con đường PI3K / AKT. Tái bản khoa học 2018; 8 (1): 16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Chiết xuất từ ​​nước hoa Osmanthus aromans và acteoside phong phú của nó ức chế sự hình thành hắc tố và sắc tố do tia cực tím gây ra. Nat Prod Commun. 2018; 13 (5): 575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Chất ức chế PI3K S1 mới kết hợp với sorafenib trong các tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ liên quan đến tín hiệu Akt-S6. Điều tra các loại thuốc mới. 2019; 37 (5): 828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Dấu hiệu của ung thư: thế hệ tiếp theo. Tế bào. 2011; 144 (5): 646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Công dụng của các peptidase liên quan đến kallikrein (KLKs) như là dấu ấn sinh học ung thư. Clin Chem. 2008; 54 (10): 1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Tiềm năng đánh dấu sinh học chẩn đoán và tiên lượng của các gen họ kallikrein trong các loại ung thư khác nhau. Mục tiêu riêng. 2018; 9 (25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Các peptidases liên quan đến Kallikrein (KLKs) trong ung thư đường tiêu hóa: khía cạnh cơ học và lâm sàng. Thromb Haemost. 2013; 110 (3): 450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Hiệu quả và độ an toàn của sorafenib ở những bệnh nhân ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương bị ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển: một thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược pha III. Lancet Oncol. 2009; 10 (1): 25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib trong ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển. N Engl J Med. 2008; 359 (4): 378–90.

22. Bài hát MJ. Hóa trị liệu truyền động mạch gan cho ung thư biểu mô tế bào gan tiến triển. Thế giới J Gastroenterol. 2015; 21 (13): 3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Chiết xuất nước của Anisomeles Ấn Độ và hợp chất tinh khiết của nó có hoạt tính chống di căn thông qua việc ức chế kích hoạt NF kappaB / AP -1- MMP -9 phụ thuộc vào tế bào MCF -7 ung thư vú ở người. Thực phẩm Chem Toxicol. 2012; 50 (8): 2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Tác dụng của verbascoside đối với quá trình apoptosis và di căn trong ung thư biểu mô tế bào vảy ở miệng ở người. Int J Cancer. 2018; 143 (4): 980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Hiệp đồng tác dụng chống ung thư của hóa trị liệu u nguyên bào thần kinh đệm dựa trên acteoside và temozolomide. Int J Mol Med. Năm 2019; 43 (3): 1478 - 86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Acteoside làm trung gian hóa học ngăn chặn quá trình sinh ung thư gan thực nghiệm thông qua STAT -3 điều chỉnh stress oxy hóa và apoptosis. Môi trường Toxicol. 2016; 31 (7): 782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Các chất chuyển hóa của Acteoside trong chế độ ăn uống: cấu hình, phân lập, xác định và năng lực bảo vệ gan. J Thực phẩm Nông nghiệp Chem. 2018; 66 (11): 2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteoside ức chế quá trình apoptosis ở tổn thương gan do D-galactosamine và lipopolysaccharide gây ra. Khoa học đời sống. 1999; 65 (4): 421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Tác dụng bảo vệ của acteoside đối với tổn thương gan do miễn dịch gây ra bởi Bacillus Calmette Guerin cộng với lipopolysaccharide. Planta Med. 2009; 75 (14): 1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Chiết xuất từ ​​hoa thơm Osmanthus giàu phenylethanoid glycoside: nghiên cứu độc tính cấp và cận điện tử. J Ethnopharmacol. 2016; 187: 205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Kallikreins mô người: một họ các dấu ấn sinh học ung thư mới. Clin Chem. Năm 2002; 48 (8): 1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. So sánh kallikrein mô và biểu hiện thụ thể kinin trong loét dạ dày và u. Int Immunopharmacol. 2001; 1 (12): 2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein ngăn chặn sự phát triển của ung thư biểu mô tế bào gan bằng hoạt tính kháng nguyên sinh. Chữ cái ung thư. 2007; 257 (1): 97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Tăng protein p53 làm nhạy cảm ung thư phổi không tế bào nhỏ với paclitaxel và cisplatin in vitro. Chống ung thư Res. 2010; 30 (9): 3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside thúc đẩy quá trình chết rụng bằng cách điều chỉnh tín hiệu HIPK 2- p53 ở người ung thư đại trực tràng. Ung thư BMC. 2014; 14: 747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib phong tỏa con đường RAF / MEK / ERK, ức chế sự hình thành mạch của khối u và gây ra quá trình chết tế bào khối u trong tế bào gan mô hình ung thư biểu mô PLC / PRF / 5. Ung thư Res. 2006; 66: 11851–8.