Tác dụng bảo vệ thần kinh phụ thuộc vào liều cấp tính của Poly(pro-17 estradiol) trên mô hình chuột bị chấn thương cột sống

Tóm tắt

17 -Estradiol (E2) có tác dụng bảo vệ thần kinh trong các mô hình tổn thương tủy sống tiền lâm sàng khi được sử dụng một cách có hệ thống. Mục tiêu của nghiên cứu này là áp dụng E2 cục bộ vào tủy sống bị tổn thương trong thời gian dài bằng cách sử dụng vật liệu sinh học màng poly(pro-E2).

Khi mọi người tìm hiểu thêm về chấn thương tủy sống, chúng tôi bắt đầu nhận ra tác động của nó đối với sức khỏe thể chất và tinh thần của con người. Mặc dù chấn thương tủy sống có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nhưng may mắn thay, tác động của chúng lên trí nhớ có thể được kiểm soát.

Đầu tiên chúng ta cần làm rõ chấn thương tủy sống là gì. Tủy sống là một dây thần kinh được bảo vệ ở cột sống, chịu trách nhiệm truyền các hướng dẫn từ não đến các bộ phận khác nhau của cơ thể. Nếu tủy sống bị tổn thương, một số bộ phận trong cơ thể sẽ mất kết nối tốt với não, dẫn đến ảnh hưởng đến cử động, cảm giác và khả năng tự chủ của tứ chi.

Chấn thương tủy sống có thể có tác động nhất định đến trí nhớ của con người, đặc biệt là trong giai đoạn đầu phục hồi chức năng của bệnh nhân bị chấn thương tủy sống. Chấn thương tủy sống có thể khiến khả năng chú ý, trí nhớ làm việc và khả năng xử lý cảm xúc của một người bị suy giảm, điều này sẽ ảnh hưởng đến khả năng ghi nhớ của một người.

Tuy nhiên, những tác động tiêu cực này sẽ giảm dần khi bệnh nhân trải qua quá trình điều trị phục hồi chức năng. Bệnh nhân có thể cải thiện trí nhớ bằng cách tham gia các trò chơi trí nhớ và rèn luyện nhận thức khác. Đồng thời, việc phục hồi thể chất còn có lợi cho việc phục hồi các chức năng vận động và cảm giác của cơ thể, từ đó cải thiện chức năng cảm xúc và nhận thức.

Chúng ta nên khuyến khích những bệnh nhân bị chấn thương tủy sống tích cực tham gia điều trị phục hồi chức năng và kiên trì tập luyện phục hồi chức năng để cải thiện sức khỏe thể chất và tinh thần. Hãy tin rằng với sự trợ giúp của nhận thức đúng đắn và điều trị sau phẫu thuật, bệnh nhân có thể khắc phục được ảnh hưởng của tổn thương tủy sống lên trí nhớ và tiếp tục sống một cuộc sống năng động. Có thể thấy rằng chúng ta cần cải thiện trí nhớ và Cistanche có thể cải thiện trí nhớ đáng kể vì Cistanche còn có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng rất quan trọng đối với trí nhớ và học tập. Ngoài ra, Cistanche cũng có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy việc cung cấp oxy, điều này có thể đảm bảo rằng não có đủ dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức bền của não.

Bấm biết bổ sung để cải thiện trí nhớ

Sau chấn thương dây cột sống ở chuột đực trưởng thành, màng poly(pro-E2) được cấy dưới màng cứng và khả năng bảo vệ thần kinh được đánh giá bằng phương pháp hóa mô miễn dịch 7 ngày sau khi bị thương và cấy ghép. Trong các nghiên cứu này, màng poly(pro-E2) cải thiện khả năng bảo vệ thần kinh một cách khiêm tốn mà không ảnh hưởng đến phản ứng viêm khi so sánh với các điều khiển bị thương.

Để tăng liều E2 được giải phóng, màng poly(pro-E2) giải phóng bolus được chế tạo bằng cách kết hợp E2 không liên kết vào màng poly(proE2).

Tuy nhiên, so với nhóm đối chứng bị thương, màng poly(pro-E2) giải phóng bolus không tăng cường đáng kể khả năng bảo vệ thần kinh hoặc hạn chế tình trạng viêm ở thời điểm 7 hoặc 21 ngày sau chấn thương. Công việc trong tương lai sẽ tập trung vào phát triển vật liệu sinh học poly(pro-E2) có khả năng chính xác hơn là giải phóng liều điều trị của E2.

GIỚI THIỆU

Chấn thương tủy sống (SCI) là một tình trạng suy nhược ảnh hưởng đến hơn 18,000 người mỗi năm ở Hoa Kỳ,1 trong khi tỷ lệ mắc SCI trên toàn cầu được ước tính là từ 236 đến 1009 trên một triệu.2

Bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi SCI bị suy giảm thần kinh nghiêm trọng bao gồm mất cảm giác, suy giảm chức năng ruột/bàng quang và tê liệt.3,4 Tác động chính lên tủy sống dẫn đến tử vong nơ-ron thần kinh tại vị trí tổn thương, tình trạng này càng trầm trọng hơn do một số đợt tổn thương thứ phát liên quan đến tế bào hình sao và đại thực bào .

Theo thời gian, những tế bào hình sao này hình thành một vết sẹo thần kinh đệm ngăn chặn sự mở rộng của các sợi trục ra ngoài rìa tổn thương.5 Cho đến nay, không có loại thuốc bảo vệ thần kinh nào được FDA phê chuẩn để điều trị SCI.

Nghiên cứu kéo dài nhiều thập kỷ đã tập trung vào việc quản lý các phân tử sinh học một cách có hệ thống để ngăn ngừa mất tế bào thần kinh do chấn thương thứ cấp và/hoặc thúc đẩy tái tạo sợi trục, cuối cùng dẫn đến phục hồi chức năng bị mất.6 Một phân tử sinh học đã chứng tỏ có triển vọng đáng kể trong các mô hình tiền lâm sàng của SCI là nữ hormone giới tính, 17 -estradiol(E2).

Sử dụng E2 nhìn chung có lợi cho hệ thần kinh trung ương bằng cách giảm viêm,7–9 làm giảm phản ứng tế bào thần kinh đệm,10 hạn chế căng thẳng oxy hóa,11–14 và giảm thiểu cái chết do tế bào thần kinh kích thích do glutamate gây ra.15 E2 cải thiện khả năng phục hồi chức năng trong các mô hình gặm nhấm khác nhau của SCI.10, 16,17 Điều thú vị là, việc sử dụng E2 toàn thân nhiều liều giúp phục hồi chức năng nhanh hơn18,19 so với động vật chỉ nhận một liều duy nhất.17

Vì E2 thúc đẩy quá trình phục hồi chức năng hiệu quả hơn thông qua chế độ điều trị nhiều liều, nên mục tiêu của chúng tôi là giải phóng E2 ổn định cục bộ tại vị trí tổn thương (để ngăn chặn bất kỳ tác động ngoài mục tiêu nào) nhằm tránh các vấn đề phát sinh từ nhiều liều lượng/tiêm E2 toàn thân.

Để đạt được mục tiêu đó, chúng tôi đã sử dụng chiến lược vật liệu sinh học poly(prodrug), trong đó thuốc tự nhiên (E2) lần đầu tiên được chức năng hóa với các nhóm allyl phản ứng và sau đó được polyme hóa thông qua việc bổ sung gốc photoinitiatethiol–ene với dithiol oligo-(ethylene glycol) linh hoạt, như đã mô tả trước đây. .20 Chúng tôi thu được chuỗi polyme có trọng lượng phân tử cao, bao gồm tiền chất E2 là đơn vị lặp lại trong polyme.

Sau khi phân hủy thủy phân, polyme dần dần giải phóng E2 vào môi trường xung quanh. Các sản phẩm phụ duy nhất khác từ quá trình giải phóng này là carbon dioxide và oligo(ethylene glycol) (oEG) (Hình 1). Chuỗi Poly(pro-E2) được chế tạo thành màng hoặc vi sợi có thể giải phóng E2 ở nồng độ nano mol trong ống nghiệm trong khoảng thời gian từ vài tháng đến nhiều năm 0,20

E2 được giải phóng từ các giàn giáo poly(pro-E2) này có hoạt tính sinh học và các giàn giáo này thúc đẩy quá trình dinh dưỡng thần kinh và bảo vệ thần kinh trong ống nghiệm bằng cách bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa do hydro peroxide gây ra. Ở đây, chúng tôi đã áp dụng màng poly (pro-E2) trong mô hình chuột bị nhiễm SCI, ngay sau chấn thương và đánh giá khả năng bảo vệ thần kinh của chúng trên cơ thể.

Thiết kế màng poly(pro-E2) ban đầu của chúng tôi tăng khả năng bảo vệ thần kinh cấp tính (7 ngày sau chấn thương) tại vị trí chấn thương mà không ảnh hưởng đến phản ứng viêm. Do màng poly(pro-E2) giải phóng nanogram E2 mỗi ngày nên chúng tôi đã phát triển một chiến lược phát hành khác trong đó E2 không liên kết được tích hợp vào ma trận poly(pro-E2). Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc giải phóng nhanh E2 không liên kết có thể mang lại thêm lợi ích bảo vệ thần kinh.

Màng poly(pro-E2) giải phóng E2 một cách bùng nổ, sau đó là giải phóng E2 liên tục từ polyme ở nồng độ thấp hơn. Nhuộm mô miễn dịch đánh giá tế bào thần kinh, tế bào hình sao và đại thực bào/microglia hiện diện tại vị trí tổn thương một cách cấp tính (7 ngày sau chấn thương) và mãn tính (21 ngày sau chấn thương) sau SCI với sự hiện diện của các màng poly (pro-E2) giải phóng bolus này.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Màng poly(pro-E2) giải phóng E2 ở nồng độ nano mol, thúc đẩy sự phát triển thần kinh từ hạch rễ lưng và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa do hydrogen peroxide gây ra trong ống nghiệm.20 Nghiên cứu được trình bày ở đây tìm cách xác định khả năng của poly(pro-E2) phim để cung cấp khả năng bảo vệ thần kinh in vivo bằng cách sử dụng mô hình SCI truyền nhiễm ở chuột.

SCI nhiễm trùng vừa phải được gây ra ở chuột đực trưởng thành và ngay sau khi bị thương, màng poly (pro-E2) được đặt ngay phía trên vết thương (Hình 2A). Để đảm bảo màng poly(pro-E2) vẫn ở đúng vị trí sau khi cấy ghép, màng poly(pro-E2) chứa rhodamine B được cấy vào tủy sống của động vật bị thương. Bảy ngày sau khi cấy ghép, các dây cột sống được thu thập và chụp ảnh bằng kính hiển vi ánh sáng (Hình 2B). Ở tất cả các loài động vật, màng poly(pro-E2) chứa rhodamine B được cấy ghép vẫn giữ nguyên vai trò xác nhận quy trình cấy ghép.

Để kiểm tra khả năng của màng poly(pro-E2) trong việc bảo vệ thần kinh và giảm viêm, màng poly(pro-E2) (không có rhodamine B) đã được cấy ghép sau chấn thương đụng dập cột sống và tủy sống được thu thập 7 ngày sau chấn thương và cấy ghép. Các mặt cắt dọc (dày 10 μm) đã được cắt, tập trung quanh tâm chấn thương và được dán nhãn miễn dịch để hình dung các tế bào thần kinh và đại thực bào trong tủy sống (Hình 3).

Các phần được dán nhãn NeuN để đánh giá sự hiện diện của tế bào thần kinh và phân tích định lượng chất nhuộm cho thấy màng poly (pro-E2) làm tăng đáng kể vùng dương tính NeuN xung quanh tâm chấn thương so với các đối chứng bị thương không được cấy ghép phim (Hình 3A; p=0.0002). Nhuộm bổ sung cho các sợi trục bằng cách sử dụng NFH (chuỗi nặng sợi thần kinh) cũng cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh cấp tính của màng poly(pro-E2) được cấy ghép (Hình 3B; p=0.0017).

Chúng tôi quan sát thấy rằng sự thay đổi trong bảo vệ thần kinh này không phải do sự thay đổi trong quá trình apoptosis (caspase 3) tại vị trí tổn thương (Hình hỗ trợ S1; p=0.9966). Nhuộm các đại thực bào được kích hoạt (CD68) cũng không tiết lộ bất kỳ sự khác biệt đáng kể giữa động vật được xử lý bằng màng poly(pro-E2) và động vật không được xử lý (Hình 3C; p= 0.7207).

Khi kết hợp với nhau, màng poly(pro-E2) tăng cường bảo vệ thần kinh một cách khiêm tốn mà không làm thay đổi phản ứng viêm. Màng poly(pro-E2) làm tăng mật độ tế bào thần kinh một cách sâu sắc gần 20%, nhưng màng không có tác dụng chống viêm rõ ràng (dựa trên định lượng của khu vực bị chiếm giữ bởi các đại thực bào được kích hoạt) (Hình 3).

Việc không giảm viêm này có thể chỉ ra rằng liều chống viêm và bảo vệ thần kinh của E2 là khác nhau và cả hai đều không đạt được với công thức màng hiện tại.20 Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc tăng giải phóng E2 từ màng poly(pro-E2) một cách sâu sắc có thể làm giảm viêm và cho phép phản ứng bảo vệ thần kinh mạnh mẽ hơn.

Để tăng liều lượng E2 được giải phóng nhanh chóng, màng thepoly(pro-E2) đã được sửa đổi sao cho việc giải phóng liều nhanh E2 sẽ xảy ra ngay sau khi cấy ghép. Sau khi giải phóng nhanh E2, sự phân hủy polyme sẽ tiếp theo để giải phóng E2 ở cùng nồng độ như trước. Thí nghiệm được mô tả ở trên được lặp lại bằng cách sử dụng các màng poly(pro-E2) giải phóng bolus này và khả năng bảo vệ thần kinh cũng như tình trạng viêm được đánh giá sau 7 ngày sau chấn thương (dpi).

Tuy nhiên, thay vì mang lại lợi ích bổ sung, màng poly(pro-E2) giải phóng bolus không làm tăng đáng kể vùng dương NeuN so với các đối chứng bị tổn thương, không được điều trị (Hình 4A; p=0.6770). Màng poly(proE2) giải phóng bolus làm tăng biểu hiện CD68, nhưng mức tăng không khác biệt về mặt thống kê (p= 0.1780).

Xu hướng ngày càng tăng trong phản ứng thần kinh đệm và viêm vi mô cũng được quan sát thấy khi có sự hiện diện của màng poly (pro-E2) giải phóng bolus do sự gia tăng biểu hiện GFAP (tế bào hình sao) và Iba1 (microglia); tuy nhiên, những mức tăng này không lớn hơn về mặt thống kê so với những gì được quan sát thấy ở nhóm đối chứng bị tổn thương, không được điều trị (lần lượt là p=0.3233 và p=0.3053). Khi kết hợp lại với nhau, các màng poly(pro-E2) giải phóng bolus đã không tăng cường bảo vệ thần kinh, đồng thời khả năng phản ứng của tế bào hình sao và sự hiện diện của đại thực bào/microglia không giảm như giả thuyết ban đầu.

Do sự khác biệt giữa động vật bị thương, không được điều trị và động vật được điều trị bằng màng poly(proE2) bị thương, giải phóng bolus không được quan sát thấy ở thời điểm cấp tính, 7 dpi, nên mốc thời gian mãn tính đã được chọn để điều tra thêm vì màng poly(pro-E2) có thể giải phóng E2 lâu dài.20 Thí nghiệm được mô tả ở trên được lặp lại với màng poly(pro-E2) giải phóng bolus, nhưng động vật được đánh giá thường xuyên ở mức 21 dpi (Hình 5).

Spinalcords được dán nhãn cho cùng loại tế bào đã nêu trước đó. Sau khi phân tích, có xu hướng tăng tỷ lệ diện tích NeuN ở động vật được cấy màng poly(pro-E2) giải phóng bolus so với động vật bị thương, không được điều trị (Hình 5A; p=0.0897) Ngoài ra, các xu hướng đã được quan sát thấy trong đó các màng poly(pro-E2) giải phóng nhanh làm giảm phần diện tích biểu hiện CD68 và GFAP so với dữ liệu từ các đối chứng động vật bị thương, không được điều trị (Hình 5B, C; p=0.0859 và p=0.2780).

Tuy nhiên, không có xu hướng nào khác biệt về mặt thống kê. Mặt khác, các phần mô được gắn nhãn Iba1 từ động vật được xử lý bằng poly(pro-E2) giải phóng bolus cho thấy biểu hiện tăng lên so với dữ liệu từ các đối chứng bị thương, không được điều trị (p < 0.0001). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng poly(pro -E2) phim được đúc trên tấm phủ 15 mm × 15 mm giải phóng khoảng 266 ng E2 mỗi ngày,20 nghĩa là khoảng 2 ng E2 mỗi ngày từ các phim (1 mm × 1,8 mm) được sử dụng ở đây. Các màng poly(pro-E2) phóng thích nhanh sẽ giải phóng thêm 40 mg E2 không liên kết ngay sau khi cấy ghép.

Nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng E2 trong các mô hình SCI của loài gặm nhấm cho thấy rằng estrogen liều thấp (10 ug/kg) được tiêm vào tĩnh mạch làm suy giảm bệnh thần kinh đệm phản ứng và cung cấp khả năng bảo vệ thần kinh đồng thời làm giảm các biến cố viêm, ức chế quá trình chết theo chương trình và tăng sự hình thành mạch. Ngược lại, liều estrogen cao toàn thân có tác dụng tác dụng phụ bao gồm tăng tỷ lệ huyết khối tĩnh mạch sâu và ung thư22,23 và sự phát triển các đặc điểm thể chất nữ tính ở nam giới. Điều này rất đáng chú ý vì hầu hết các nghiên cứu về E2 đều tập trung vào việc cung cấp E2 một cách có hệ thống qua đường tĩnh mạch hoặc trong màng bụng.

Xem xét các mối lo ngại về an toàn khi sử dụng E2 liều cao một cách có hệ thống, điều quan trọng là phải tối ưu hóa nồng độ E2 để phân phối cục bộ đến tủy sống bị tổn thương nhằm ngăn ngừa tác dụng phụ. Cho đến nay, chỉ có một nghiên cứu đã phân phối E2 từ vật liệu sinh học bằng cách sử dụng các hạt nano để phân phối E2 một cách tập trung (2,5 ug hoặc 25 ug). Sự giải phóng từ các hạt nano làm giảm nhanh chóng tình trạng viêm cấp tính trong mô hình chuột bị nhiễm trùng SCI.9 Việc thiếu phản ứng có ý nghĩa thống kê trong dữ liệu của chúng tôi (Hình 4 và 5) có thể là do sự mất cân bằng về lượng E2 mà chúng tôi đang cung cấp cục bộ cho tủy sống bằng Quá nhiều E2 (40 ug) được giải phóng nhanh chóng trong khi rất ít (2 ng) được giải phóng thường xuyên.

Mặc dù những gì chúng tôi quan sát được từ những dữ liệu này là những xu hướng khiêm tốn, nhưng nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng liều E2 để thúc đẩy khả năng bảo vệ thần kinh trong cơ thể. Việc giảm liều E2 ban đầu và điều chỉnh động học phân hủy của vật liệu sinh học poly(pro-E2) có thể giúp giảm bớt vấn đề này và có khả năng mang lại kết quả bảo vệ thần kinh tốt hơn.

Mặc dù nghiên cứu này chỉ được thực hiện ở nam giới, nhưng điều quan trọng là phải đánh giá tác động của các màng poly(pro-E2) này ở cả hai giới để thiết lập tiềm năng tịnh tiến hợp lệ cho vật liệu sinh học này. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sau SCI, nồng độ estrogen tăng lên ở nữ giới có thể là nguyên nhân một phần giúp cải thiện kết quả chức năng của họ so với nam giới.24Vì có sự hiện diện estrogen tăng lên ở nữ giới nên bất kỳ chiến lược vật liệu sinh học nào sử dụng estrogen đều phải tính đến mức tăng này và sửa đổi vật liệu giải phóng động học phù hợp để đảm bảo rằng liều lượng được cung cấp vẫn như nhau cho nam và nữ.

PHƯƠNG PHÁP

Chế tạo màng Poly(pro-E2).

Poly(pro-E2) polyme P1 đã được tổng hợp và có đặc tính như được mô tả chi tiết trước đây.20 Polyme này có trọng lượng phân tử trung bình trọng lượng là MW ~ 80 kDa và độ phân tán Đ ~ 3, theo phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC). Màng poly(pro-E2) được chế tạo bằng cách hòa tan polyme trong cloroform (5 wt %/wt; polymer/chloroform), thả từng giọt dung dịch lên các lá kính phủ thủy tinh 15 mm × 15 mm (100 μL dung dịch trên mỗi lá kính phủ) và để chúng để khô qua đêm trong chân không (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Để tạo màng poly(pro-E2) có E2 không liên kết, màng được chế tạo bằng cách thêm E2(Abcam, Cambridge, MA) không liên kết vào dung dịch polymer (0.0625 wt %/wt; E2/chloroform) trước khi đúc dung dịch lên các lá kính đậy. Trước khi cấy, các nắp đậy có màng được khử trùng bằng tia cực tím (UV) trong 30 phút và màng được bóc ra khỏi nắp trong tủ an toàn sinh học vô trùng. Sau đó, màng poly(pro-E2) được cắt thành các mảnh có kích thước 1 mm×1,8 mm, thích hợp để cấy vào chuột trưởng thành như được mô tả dưới đây.

Chấn thương tủy sống và cấy ghép màng Poly(pro-E2).

Tất cả các quy trình chăm sóc phẫu thuật và hậu phẫu đã được phê duyệt bởi Viện Bách khoa Rensselaer và Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Bang Ohio (IACUC). Để gây ra SCI nhiễm trùng, chuột đực C57BL/6 trưởng thành (10- đến 12-tuần tuổi), được mua từ Phòng thí nghiệm Jackson (số hàng 000664; Bar Harbor, ME), đã được gây mê bằng tiêm trong màng bụng ketamine (80 mg/kg) và xylazine (10 mg/kg). Phần lưng của động vật được cạo lông và chuẩn bị vô trùng bằng 70% ethanol và betadine.

Sau khi đặt con vật trên một tấm đệm sưởi được duy trì ở nhiệt độ 37 độ, các lớp da và cơ được mở ra để lộ cột sống và phẫu thuật cắt lớp sống lưng được thực hiện trên đốt sống ngực thứ chín (T9) để lộ tủy sống. Một SCI truyền nhiễm vừa phải (75 kdyn) đã được tạo ra ở cấp độ này bằng cách sử dụng thiết bị tác động Infinite Horizons (Hệ thống chính xác và thiết bị đo, Lexington, KY).

Sau khi cầm máu xong, màng cứng được mở ra (Hình 2) và màng poly(pro-E2) hoặc màng poly(pro-E2) giải phóng bolus (1 mm × 1,8 mm) được đặt dưới màng cứng và phía trên tủy sống, bao phủ vị trí tổn thương. Ở động vật đối chứng, màng cứng được mở nhưng màng poly(pro-E2) không được cấy vào. Các lớp cơ sau đó được đóng lại bằng chỉ khâu vô trùng và da được đóng lại bằng kẹp kim loại vô trùng.

Những con chuột được tiêm dưới da 2 mL nước muối vô trùng và được đưa trở lại lồng của chúng và đặt trên một máy sưởi trượt được đặt ở nhiệt độ 37 độ qua đêm. Để đảm bảo hydrat hóa thích hợp và ngăn ngừa nhiễm trùng, chuột được tiêm dưới da 1–2 mL nước muối vô trùng và Gentocin (1 mg/kg) mỗi ngày trong 5 ngày đầu sau chấn thương (dpi). Bàng quang được thể hiện thủ công hai lần một ngày trong suốt thời gian thí nghiệm. Tất cả các loài động vật đều được nuôi trong điều kiện thông thường theo chu kỳ sáng-tối 12-giờ với khả năng tiếp cận thức ăn và nước uống tùy ý.

Thu hoạch mô.

Tại thời điểm cuối cùng được chỉ định là 7 hoặc 21 dpi, những con chuột được tiêm một liều ketamine/xylazine gây chết người (liều phẫu thuật 1,5 ×) và được tưới máu qua tim bằng dung dịch muối đệm 0.1 Mphosphate (PBS; pH 7,4) tiếp theo là 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7,4). Các dây cột sống được loại bỏ, cố định sau 2 giờ trong 4% PFA, sau đó được chuyển sang dung dịch đệm photphat 0.2M (PB; pH 7,4) qua đêm.

Các dây cột sống được bảo vệ lạnh trong 30% sucrose trong 48 giờ ở 4 độ và sau đó bị chặn thành các đoạn 10 mm tập trung quanh vị trí chấn thương với các cột lưng hướng lên trên. Các phần này được nhúng vào môi trường nhiệt độ cắt tối ưu Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) và đông lạnh nhanh chóng trên đá khô. Tất cả các dây cột sống được cắt ở mức 10 μm trên bộ điều hòa nhiệt độ Microm HM505E, đặt trên các slide ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), sau đó được bảo quản ở -20 độ cho đến khi được sử dụng để nhuộm miễn dịch.

Hóa mô miễn dịch và định lượng.

Các phiến kính được rã đông trên thiết bị làm ấm phiến kính trong 1 giờ và sau đó rửa sạch 3 lần trong 0.1 MPBS. Hoạt tính peroxidase nội sinh đã bị dập tắt bằng cách ủ các phiến kính trong H2O2 6% pha loãng trong metanol trong 15 phút tại RT. Sau khi rửa 3 lần trong 0.1 M PBS, các phần được ủ với 4% BSA và 0.1% Triton X-100 trong 0.1 M PBS trong 1 h sau đó ủ qua đêm các kháng thể chính ở 4 độ hoặc RT (Bảng 1).

Các phiến kính được ủ với các kháng thể thứ cấp biotatin hóa thích hợp (1: 1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) tại RT trong 1 giờ. Để hình dung kháng thể liên kết, các phiến kính được ủ với Vectastain Elite-ABC (Phòng thí nghiệm Vector) trong 1 giờ và được phát triển với chất nền ImmPACT3,3′-diaminobenzidine (DAB) hoặc Vector SG (Phòng thí nghiệm Vector) trong 10 phút.

Các phần được khử nước thông qua quá trình ủ tuần tự 2 × 2 phút trong ethanol 70% và 90%, 2 × 3 phút trong 100% ethanol, tiếp theo là 3 × 3 phút trong Histoclear và cuối cùng được phủ bằng Permount (ThermoFisher Scientific). Sáu phần cho mỗi con vật, cách nhau 100 μm ở tủy sống bị tổn thương, được sử dụng để phân tích định lượng.

Các phần được dán nhãn miễn dịch được chụp ảnh bằng kính hiển vi hình ảnh Axioplan 2 được trang bị máy ảnh AxioCamdigital và phần mềm AxioVision phiên bản 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Đức) và vật kính 5 ×.

Số lượng pixel dương trong mỗi phần được tính bằng phần mềm phân tích hình ảnh MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) để tính phần trăm diện tích dương trên mỗi phần. Diện tích phần trăm dương trung bình của sáu phần trên mỗi con vật được tính toán cho từng vết bẩn và được báo cáo.

Phân tích thống kê.

Tất cả dữ liệu được báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Phân tích thống kê được thực hiện bằng Phần mềm thống kê GraphPad Prism 9 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA). Trong tất cả các thí nghiệm, 5–6 con vật được sử dụng cho mỗi nhóm, có nguồn gốc từ ít nhất hai lô động vật khác nhau. Để kiểm tra sự khác biệt giữa nhóm màng đối chứng và nhóm màng poly(pro-E2), bài kiểm tra t của Sinh viên (Hình 3, 4 và 5) đã được sử dụng. Ý nghĩa được thiết lập ở p Nhỏ hơn hoặc bằng 0.05.

Tài liệu bổ sung

Tham khảo phiên bản Web trên PubMed Central để có tài liệu bổ sung.

LỜI CẢM ƠN

Các tác giả cảm ơn Wenmin Lai vì sự hỗ trợ của cô trong quá trình phẫu thuật chuột.

Tài trợ

Công trình này đã nhận được sự hỗ trợ từ Học bổng của Quỹ Craig H. Neilsen (Cấp 468116) và Học bổng của Quỹ Nghiên cứu Cựu chiến binh Hoa Kỳ bị Liệt (Cấp 3171) cho MKG và từ NIH R01 (Cấp NS092754) và Ban Đánh giá Chấn thương Tủy sống Tiểu bang New York Trợ cấp Thể chế C32245GG cho RJG Tất cả các công việc động vật được thực hiện với sự hỗ trợ của Khoa Khoa học Thần kinh của Đại học Bang Ohio, được hỗ trợ bởi NINDS Grant P30NS104177.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

(1). Trung tâm thống kê chấn thương tủy sống quốc gia. (2020) Sơ lược về các sự kiện và số liệu về chấn thương tủy sống, Đại học Alabama ở Birmingham, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J và Brown D (2011) Bản đồ toàn cầu về dịch tễ học chấn thương tủy sống do chấn thương: Hướng tới một kho lưu trữ dữ liệu sống để phòng ngừa thương tích. Tủy sống. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Chấn thương tủy sống - Quá khứ, Hiện tại và Tương lai. Tạp chí Y học Tủy sống 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Hiroma EJ, và Wilson DA (2010) Điều tra toàn tiểu bang về tình trạng sức khỏe bất lợi được chăm sóc y tế của những người bị chấn thương tủy sống. J. Tủy sống Med. 33 (3),221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, và Miller JH (2004) Tái sinh vượt ra ngoài vết sẹo thần kinh đệm. Nat. Mục sư Neurosci. 5 (2),146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, và Banik NL (2013) Chấn thương tủy sống: Đánh giá về liệu pháp hiện tại, phương pháp điều trị trong tương lai và các giới hạn khoa học cơ bản.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zenddel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, vàBeyer C (2018) Estrogen làm giảm biểu hiện và kích hoạt viêm cục bộ sau chấn thương tủy sống. Mol. Thuốc thần kinh. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG và Yune TY (2018) Estrogen làm giảm cơn đau thần kinh gây ra sau chấn thương tủy sống bằng cách ức chế kích hoạt microglia và tế bào hình sao. Biochim. Sinh lý. Acta, Mol. Cơ sở Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, và Banik N (2015) Hạt nano Estrogen trong chấn thương tủy sống chuột tạo ra tác dụng chống viêm nhanh chóng trong huyết tương, dịch não tủy và mô.J. Chấn thương thần kinh 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, và Banik NL (2010) Điều trị bằng Estrogen sau chấn thương đối với chấn thương tủy sống mãn tính giúp cải thiện chức năng vận động ở chuột. J. Khoa học thần kinh. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H và Akaike A (2001) Sự truyền tín hiệu chống ung thư phi gen bằng Estrogen trong các tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy. J.Thần kinh học. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK, và Banik NL (2003) Estrogen là chất bảo vệ thần kinh trong điều trị chấn thương tủy sống. Ann. Học viện NY. Khoa học. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com