Nanocytokine dựa trên IL{0}}có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch chống ung thư một cách an toàn thông qua việc kiểm soát tình trạng viêm theo không gian thời gian để loại bỏ các khối u lạnh tiến triển
Dec 08, 2023
Điều trị khối u lạnh miễn dịch là một thách thức lớn đối với thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch (ICI). Interleukin 12 (IL-12) có thể tiếp thêm sinh lực cho ICI chống lại các khối u lạnh bằng cách thiết lập khả năng miễn dịch chống ung thư mạnh mẽ. Tuy nhiên, độc tính và cảm ứng hệ thống của nó đối với các tín hiệu ức chế miễn dịch đã cản trở quá trình dịch mã. Ở đây, hoạt động IL{2}} được kiểm soát theo thời gian về mặt không gian để tăng cường hiệu quả một cách an toàn mà không kích thích các phản ứng miễn dịch cản trở bằng cách tạo ra một cytokine nano không hoạt động ở pH sinh lý nhưng giải phóng hoạt động hoàn toàn của nó ở pH axit của khối u. Nano cytokine dựa trên IL-12-(Nano-IL-12) tích lũy và giải phóng IL-12 trong các mô khối u, gây ra tình trạng viêm chống ung thư cục bộ, đồng thời ngăn chặn phản ứng miễn dịch toàn thân, phản ứng miễn dịch phản tác dụng và độc tính bất lợi ngay cả sau khi tiêm tĩnh mạch nhiều lần. Khả năng kiểm soát tình trạng viêm theo không gian và thời gian qua trung gian Nano-IL{8}} mang lại hiệu quả chống ung thư vượt trội và phối hợp với ICI để kích thích sâu sắc môi trường vi mô khối u và loại bỏ hoàn toàn các khối u nguyên phát và di căn kháng ICI. Chiến lược này có thể là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn hướng tới các liệu pháp miễn dịch an toàn và hiệu quả hơn.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
1. Giới thiệu
Các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch (ICI), chẳng hạn như kháng thể kháng PD-1 (nivolumab) và kháng CTLA- 4 (ipilimumab), đã cách mạng hóa liệu pháp điều trị ung thư.[1,2] Tuy nhiên, một số lượng lớn các thuốc này bệnh nhân vẫn không được hưởng lợi từ các phương pháp điều trị này.[3] Phản ứng thiếu hụt như vậy có liên quan đến kiểu hình khối u lạnh không nhạy cảm với ICI.[4,5] Những khối u lạnh này thường biểu hiện một môi trường vi mô ức chế miễn dịch và mức độ thâm nhiễm tế bào T thấp làm suy yếu tác dụng của ICI.[5–7 ] Do đó, nhu cầu cấp thiết về các tác nhân là chuyển khối u từ kiểu hình lạnh sang kiểu hình bị viêm (nóng) với khả năng thâm nhiễm tế bào T cao nhằm nâng cao hiệu quả của ICI và mở rộng phạm vi điều trị. Interleukin-12 (IL-12), là một trong những cytokine tiền viêm mạnh nhất, có tiềm năng cao trong việc tăng cường khả năng miễn dịch chống ung thư và khắc phục tình trạng kháng ICI.[8–10] Tuy nhiên, IL-12 gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng liên quan đến miễn dịch (irAE) khi được tiêm vào hệ thống. [8,10] Do đó, một loạt các phương pháp kỹ thuật protein, bao gồm các cytokine miễn dịch, [11–13] protein tổng hợp, [14] và các cytokine nhạy cảm với protease, [15 ] đang được nghiên cứu kỹ lưỡng để cải thiện tính an toàn của IL-12 bằng cách giảm phơi nhiễm toàn thân và tăng cường khả năng chọn lọc của khối u. Mặt khác, IL{27}} vẫn bộc lộ những hạn chế nghiêm trọng liên quan đến động lực không gian thời gian của tình trạng viêm dẫn đến các phản ứng miễn dịch phản tác dụng làm suy yếu hiệu quả của nó.[16–19] Ví dụ: việc tiêm IL-12 lặp đi lặp lại đã thúc đẩy sự mở rộng toàn thân của interleukin chống viêm-10 (IL-10) ở bệnh nhân, điều này đã hạn chế hiệu quả chống khối u.[20–22] Về vấn đề này, việc phát triển các hệ thống có khả năng kiểm soát IL{{36 theo thời gian }}tình trạng viêm qua trung gian có thể tối đa hóa chức năng tác động và kích thích khả năng miễn dịch chống ung thư mạnh mẽ, đồng thời tránh cản trở các phản ứng miễn dịch. Thật không may, động lực gây viêm của các hệ thống được thiết kế bằng protein nói trên vẫn chưa được hiểu đầy đủ và mối liên hệ của chúng với các phản ứng thứ cấp chống lại vẫn chưa được làm rõ. Trong tài liệu này, chúng tôi đã phát triển các cytokine có kích thước nano (nano cytokine) đáp ứng kích thích bằng cách bao bọc IL-12 tự nhiên bằng các polyme tương thích sinh học để đạt được khả năng kiểm soát hoạt động của nó theo không gian và thời gian. Các cytokine nano dựa trên IL{40}}(Nano-IL-12) được thiết kế để giải phóng IL-12 hoạt động hoàn toàn sau khi cảm nhận được độ pH có tính axit trong khối u, vì nhiễm toan là một dấu hiệu đặc trưng của bệnh ung thư[23] và có liên quan đến sự ức chế miễn dịch.[24,25] Trên thực tế, gần đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng chức năng thay đổi độ pH có thể cho phép kích hoạt cao và có chọn lọc ở các khối u kháng ICI.[26] Dược động học, độ an toàn và hiệu quả của Nano-IL-12 đã được đánh giá trên mô hình chuột mắc bệnh u ác tính lạnh và ung thư vú. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng NanoIL-12 gây ra phản ứng viêm kéo dài trong các mô khối u bằng cách tăng cường độ và thời gian tiếp xúc với IL-12 đồng thời tránh sự tương tác với các tế bào miễn dịch trong các mô khỏe mạnh để ngăn chặn tác động xấu đáp ứng miễn dịch mục tiêu. Do đó, Nano-IL-12 đã ngăn chặn một cách hiệu quả các phản ứng thứ cấp cả về mặt hệ thống và bên trong khối u, cho thấy hiệu quả ở liều 10-thấp hơn gấp nhiều lần so với IL nguyên gốc-12. Khả năng miễn dịch chống ung thư nâng cao của Nano-IL{60}} phối hợp một cách an toàn với ICI để kích thích mạnh mẽ vi môi trường khối u (TME), dẫn đến phản ứng hoàn toàn (CR) trong các mô hình u ác tính kháng ICI cũng như di căn nguyên phát và phổi của ung thư ba ung thư vú âm tính (TNBC).
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
2. Kết quả
2.1. Nano-IL-12 Cảm nhận độ pH trong khối u để giải phóng Cytokine hoạt động hoàn toàn
Để tạo ra Nano-IL-12, chúng tôi đã tổng hợp poly(ethylene glycol)-poly(LLysine) (PEG-pLL(CDM)) được biến đổi bằng carboxydimethylmaleic anhydrit (CDM) thông qua phương pháp được báo cáo[27] (Sơ đồ S1, Thông tin hỗ trợ). Polyme có một nửa số nhóm amino trong khối pLL được liên hợp với CDM thông qua liên kết amide (Hình S1–S3, Thông tin hỗ trợ). Nano-IL{{10}} được hình thành chỉ bằng cách trộn polyme với cytokine trong điều kiện nước mà không cần thêm dung môi hữu cơ (Hình 1a). Các nhóm amino trong phức hợp ion dạng polyme với các gốc carboxylate trong protein, trong khi các nhóm CDM phản ứng với các nhóm amino trong IL-12 cũng như trong các chuỗi polyme để tạo thành liên kết amide nhạy cảm với pH. Hiệu suất đóng gói của IL-12 trong nanocytokine được xác định là khoảng 80%, được đo bằng HPLC bằng cách so sánh diện tích các đỉnh của IL-12 tự do được gắn nhãn Alexa Fluor 647 (A647) và IL{20}} được nạp vào nanocytokine (Hình 1b). Trong trường hợp IL{23}} không phát huỳnh quang có nhãn IL{23}}, hiệu quả bao bọc được xác nhận bằng phép đo ELISA, vì phương pháp ELISA chỉ có thể phát hiện IL{24}} tự do không được bao bọc trong hỗn hợp phản ứng vì lớp phủ polymer của Nano -IL-12 chặn việc nhận dạng IL-12 đã được nạp bằng kháng thể phát hiện. Do đó, bằng cách tính tỷ lệ của nguồn cấp dữ liệu IL-12 không được đóng gói so với tổng nguồn cấp dữ liệu IL-12, hiệu suất đóng gói cũng được xác định là khoảng 80% (Hình S4a, Thông tin hỗ trợ), phù hợp với kết quả từ phép đo HPLC. NanoIL-12 được tinh chế bằng phương pháp lọc ly tâm để loại bỏ IL-12 tự do và các liên hợp polymer-IL-12 tương đối nhỏ (Hình S4b, Thông tin hỗ trợ). Quá trình tinh chế được xác nhận bằng HPLC (Hình 1b, bảng phía dưới). Sự hình thành lớp chắn polyme trên Nano-IL-12 đã được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và tán xạ ánh sáng động (DLS). Trong TEM, lõi chứa IL{40}}của NanoIL-12 được hình thành bởi khối pLL của polyme và IL-12 được nhuộm bằng uranyl axetat[28] và được hiển thị dưới dạng các chấm đen đồng nhất với đường kính trung bình ở mức 23,2 ± 4 nm (Hình 1c, d). Bằng DLS, đường kính thủy động lực của Nano-IL-12 được đo là 42 ± 2 nm (Hình 1e). Bằng cách so sánh kích thước đo được bằng TEM và DLS, chúng ta có thể tính được rằng độ dày của lớp vỏ PEG trong các hạt này là khoảng 10 nm. Kết quả này cho thấy PEGylation dày đặc, sẽ hữu ích cho việc cải thiện dược động học.[29] Hơn nữa, các nghiên cứu quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS) của Nano-IL được gắn nhãn A647-Nano-IL-12 đã xác nhận sự hình thành các liên kết có trọng lượng phân tử lớn hơn IL647-được gắn nhãn A{59}} tự do (Bảng S1, Thông tin hỗ trợ). Bằng cách so sánh số lượng trên mỗi phân tử trong phép đo FCS của các mẫu IL{62}} được gắn nhãn A647-và các mẫu Nano-IL{65}} được gắn nhãn A647-, chúng tôi đã xác định được rằng mỗi Nano-IL{ {67}} trung bình chứa khoảng 1,5 phân tử IL{70}}. Ngoài ra, điện tích bề mặt của Nano-IL-12 được phát hiện là gần trung tính (Bảng S2, Thông tin hỗ trợ), cho thấy polyme đang che chắn IL-12 tích điện âm. Các liên kết amit trong Nano-IL{76}} được hình thành giữa các gốc CDM và các amin bậc một được cho là nhạy cảm với độ pH.[30] Do đó, Nano-IL-12 dự kiến sẽ phân ly trong điều kiện axit để giải phóng cytokine được bao bọc. Trước tiên, chúng tôi sàng lọc độ nhạy pH của Nano-IL{83}} ở các giá trị pH khác nhau từ pH 4,5 đến 8,5 bằng phép đo FCS để phản ánh trạng thái phân ly của Nano-IL-12 bằng sự thay đổi của hệ số khuếch tán. Sự gia tăng hệ số khuếch tán, tương ứng với sự giảm trọng lượng phân tử của các hạt, có thể được quan sát thấy trong điều kiện axit dưới độ pH 7,0, cho thấy rằng Nano-IL-12 ổn định ở pH sinh lý, nhưng có thể mất đi tính chất của chúng. tính toàn vẹn trong các tổn thương trong khối u với môi trường axit hóa [23,31] (Hình 1f). Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu động học phân ly của Nano-IL-12 ở độ pH sinh lý là 7,4 và độ pH trong khối u là 6,5 bằng phép đo FCS. Phép đo FCS cho phép đánh giá chính xác hệ số khuếch tán của Nano-IL{104}} và IL{105}} được phát hành. Kết quả mới cho thấy Nano-IL{107}} nhanh chóng mất tính toàn vẹn ở độ pH 6,5 và hệ số khuếch tán của mẫu đạt đến giá trị IL tự do-12 sau 4 giờ ủ, cho thấy Nano-IL đã kích hoạt hoàn toàn -12 trong những điều kiện như vậy. Hơn nữa, ở độ pH 7,4, Nano-IL{117}} ổn định (Hình 1g), duy trì hệ số khuếch tán ngay cả sau vài ngày (Hình S4c, Thông tin hỗ trợ). Những quan sát này hỗ trợ quá trình kích hoạt có chọn lọc Nano-IL{121}} ở điều kiện pH trong khối u và tính ổn định ở điều kiện sinh lý. Vì IL-12 có thể kích thích sự tiết IFN-𝛾 từ tế bào lách,[32] tác dụng của việc che chắn/khử che chắn polymer đối với hoạt tính sinh học của Nano-IL-12 đã được đánh giá trong ống nghiệm bằng xét nghiệm tế bào lách ( Hình 1h). Nano-IL{130}} gây ra mức độ sản xuất IFN- 𝛾 thấp hơn từ tế bào lách ở chuột, cho thấy sự tắc nghẽn hoạt tính sinh học của IL-12 do quá trình bao bọc polyme. Mặt khác, Nano-IL{134}} được kích hoạt bằng cách ủ trước trong axit (pH 6,5) cho thấy hoạt tính sinh học tương tự như hoạt tính sinh học của IL-12 tự nhiên, cho thấy Nano-IL{140}} đã được kích hoạt có thể lấy lại đầy đủ hoạt tính sinh học của cytokine.
Hình 1. Nano-IL-12 kích hoạt ở độ pH trong khối u để giải phóng cytokine hoạt động hoàn toàn. a) Sự hình thành và cấu trúc của nanocytokine dựa trên IL-12-(Nano-IL- 12). Nano-IL-12 có thể tự lắp ráp trong điều kiện nước bằng cách trộn polyme với IL-12. Việc lắp ráp được điều khiển bởi các liên kết amide nhạy cảm với pH và tương tác tĩnh điện. b) Kết quả HPLC của protein IL{11}} tự do, hỗn hợp PEG-pLL(CDM) + IL-12 và Nano-IL{16}} tinh khiết. Protein IL{17}} được dán nhãn A647. c) Ảnh TEM đại diện của Nano-IL{20}} tinh khiết cho thấy rõ cấu trúc lõi của các hạt. d) Phân bố đường kính lõi hạt đo được từ ảnh TEM. n=100 hạt được đếm. e) Phân bố đường kính thủy động lực của Nano-IL-12 được đo bằng DLS. f) Sự phân ly Nano-IL{26}} phụ thuộc vào độ pH được biểu thị bằng phép đo FCS của Nano-IL-12 được ủ ở các độ pH khác nhau trong 24 giờ. Đường chấm chấm ở 5,3 × 107 cm2 s−1 biểu thị hệ số khuếch tán của IL tự do-12. g) Hồ sơ phát hành IL-12 của Nano-IL-12 được đo bằng phương pháp FCS. Các đường chấm chấm ở 1,2 × 107 cm2 s−1 và 5,3 × 107 cm2 s−1 lần lượt đề cập đến các hệ số khuếch tán của Nano-IL-12 nguyên vẹn và IL tự do được giải phóng-12. h) Sự bài tiết IFN-𝛾 bởi các tế bào lách ở chuột được xử lý bằng Nano-IL-12, Nano-IL-12 được kích hoạt và IL nguyên gốc-12. IFN-𝛾 được đo bằng ELISA. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD; đối với các phép đo song song f và g, n=3. Đối với các phép đo song song h, n=5.
Khả năng bảo quản và tính ổn định của công thức cũng rất quan trọng để chuyển Nano-IL-12 thành thuốc. Do đó, chúng tôi đã phát triển phiên bản đông khô của Nano-IL-12 sử dụng trehalose làm chất bảo vệ lạnh.[33] Nano-IL{6}} hoàn nguyên cho thấy kích thước và điện tích bề mặt tương đương với Nano-IL-12 mới, không bị rò rỉ hàng hóa, đồng thời có chung độ nhạy pH và khả năng cảm ứng IFN-𝛾 trong ống nghiệm (Hình S4d–g và Bảng S2, Thông tin hỗ trợ). Những kết quả này hỗ trợ công thức đông khô như một đối tác Nano-IL{13}} khả thi.
Hình 2. Nano-IL-12 cải thiện dược động học và hiệu quả chống khối u. a) Hình ảnh IVCLSM của da dái tai chuột sau khi tiêm iv 10 ug A647-có nhãn IL-12 hoặc Nano-IL-12 xấu xí (màu đỏ). Thanh tỷ lệ=50 μm. Cường độ huỳnh quang trung bình ở vùng mô (hộp màu trắng) lúc 5 giờ sau khi tiêm được định lượng và chuẩn hóa ở cường độ tối đa trong mạch máu ngay sau khi tiêm (Vmax). b) Hồ sơ lưu thông máu của IL{11}} và Nano-IL{13}} tự do sau khi tiêm iv 10 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL{17}} tương đương được xác định bằng ELISA. Ngoài ra, nồng độ IL{18}} được giải phóng từ Nano-IL{20}} trong máu cũng được vẽ biểu đồ (dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD, n=5 chuột trong mỗi nhóm). c) Hình ảnh IVIS của khối u ác tính B16F10 được cắt bỏ 24 giờ sau khi tiêm iv 10 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL{28}} tương đương được dán nhãn A647. d) Định lượng mức IL-12 trong khối u TNBC 4T1 ở 24- và 48 giờ sau khi tiêm iv 10 ug IL-12 hoặc Nano-IL-12 tương đương bằng ELISA ( Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD; n=3 chuột trên mỗi nhóm; giá trị p được tính bằng ANOVA một chiều). e) Hoạt tính chống khối u của một lần tiêm iv (ngày tiêm được biểu thị bằng mũi tên (Ngày 8 đối với mẫu B16F10 và Ngày 7 đối với mẫu 4T1)) của 10 ug IL-12 hoặc Nano-IL tương đương{ {51}}. Kết quả về khối u ác tính B16F10 được hiển thị ở bảng trên và kết quả trong TNBC 4T1 được hiển thị ở bảng dưới. Các đường cong phát triển khối u riêng lẻ được hiển thị trong bảng bên trái. Đường cong thể tích khối u trung bình được hiển thị ở bảng trung tâm và đường cong sinh tồn được hiển thị ở bảng bên phải (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM; n=5 chuột trên mỗi nhóm, giá trị p được tính toán thông qua phân tích thứ hạng log ).
2.2. Nano-IL-12 cải thiện dược động học của IL-12 và kích hoạt trong các khối u để tăng cường tác dụng chống ung thư
Việc đóng gói vào Nano-IL-12 có thể cải thiện dược động học của IL-12. Để hình dung sự tuần hoàn của Nano-IL-12 khi tiêm vào tĩnh mạch (iv), kính hiển vi quét laser đồng tiêu in vivo (IVCLSM) đã được sử dụng để theo dõi Nano-IL dựa trên A647-IL-12- -12 trong các mạch của dái tai chuột sau khi tiêm từ tĩnh mạch đuôi. IL-12 tự do cho thấy sự thoát mạch sau khi tiêm (Hình 2a), được biểu thị bằng cường độ huỳnh quang tăng lên trong mô kẽ. Xét rằng các đại phân tử có kích thước tương đương với IL-12 (75 kDa), chẳng hạn như 70 kDa dextran và albumin (65 kDa), cho thấy khả năng tiếp cận da bị hạn chế,[34] sự rò rỉ IL-12 từ mạch máu cho thấy sự mất ổn định của IL{17}} trong quá trình lưu thông máu. Trên thực tế, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra sự phân giải protein IL-12 bằng các enzyme có trong huyết thanh.[35,36] Để hỗ trợ thêm cho sự phân hủy IL-12 trong các thí nghiệm của chúng tôi, tính ổn định của A{{22 }} được gắn nhãn IL{23}} trong huyết tương chuột được nghiên cứu bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC). Khi ủ với huyết tương chuột, chúng tôi nhận thấy IL{24}} phân hủy thành các mảnh có trọng lượng phân tử nhỏ hơn (Hình S5, Thông tin hỗ trợ), xác nhận tính không ổn định của IL-12 trong máu. Mặt khác, Nano-IL{28}} cho thấy sự rò rỉ tối thiểu vào da, cho thấy sự ổn định trong tuần hoàn máu. Hồ sơ lưu thông được định lượng được đo từ xét nghiệm ELISA đã xác nhận tổng thể Nano-IL-12 có thời gian lưu thông dài hơn IL tự do-12 (Hình 2b). Trong khi đó, mức độ Nano-IL{34}} được kích hoạt, được xác định bởi IL-12 được phát hành, bị hạn chế rất nhiều trong máu, cho thấy tính ổn định in vivo của Nano-IL-12 trong quá trình toàn thân tuần hoàn, giúp giảm tác dụng phụ toàn thân. Sự tích tụ Nano-IL-12 trong tim, lá lách, phổi và thận tương tự như sự tích tụ IL-12 tự do ở cả 24 và 48 giờ sau khi dùng thuốc, trong khi ở gan, sự tích tụ của Nano-IL-12 cao hơn IL-12 miễn phí sau 24 giờ, nhưng có thể so sánh được sau 48 giờ (Hình S6, Thông tin hỗ trợ). Nano-IL-12 cho thấy sự tích lũy khối u cao hơn đáng kể so với IL tự do-12 (Hình 2c) vào lúc 24 giờ sau khi tiêm. Hơn nữa, mặc dù IL{54}} tự do đã bị loại bỏ khỏi khối u vào 48 giờ sau khi tiêm, nhưng nồng độ Nano-IL-12 vẫn ở mức cao (cao hơn khoảng 4-gấp so với IL tự do{{59} }) (Hình 2d), cho thấy Nano-IL-12 đã tăng diện tích dưới đường cong nồng độ (AUC) của IL-12 bên trong các khối u. Cùng với sự tích lũy tăng cao và khả năng kích hoạt khả thi trong các khối u, Nano-IL{65}} cho thấy hiệu quả chống ung thư được cải thiện so với IL{66}} tự do trong khối u ác tính B16F10 dưới da và mô hình ung thư vú ba âm tính 4T1 chỉnh hình (TNBC) (Hình 2e). Trong cả hai mô hình, chỉ cần tiêm tĩnh mạch một lần Nano-IL{74}} ở mức tương đương 10 IL xấu xí-12 đã dẫn đến khả năng ức chế sự phát triển của khối u được cải thiện đáng kể so với IL-12, dẫn đến thời gian sống sót lâu hơn . Đáng chú ý, trong mô hình 4T1 TNBC, nổi tiếng với khả năng ức chế miễn dịch mạnh và khả năng chống lại điều trị bằng ICI,[37] việc điều trị bằng Nano-IL-12 đã mang lại hiệu quả điều trị rõ ràng, trong khi IL{{83} tự do } là vô ích trong việc chống lại sự phát triển của khối u.
2.3. Nano-IL-12 Kiểm soát phản ứng viêm theo không gian theo thời gian
Để nghiên cứu sâu hơn về sự khác biệt giữa tác dụng sinh học của Nano-IL{1}} và IL tự do-12, mức độ phản ứng viêm gây ra từ phương pháp điều trị được đánh giá bằng phản ứng cytokine ở cả các vị trí ngoài mục tiêu, tức là , máu và các cơ quan khỏe mạnh, và trong các khối u (mô hình chỉnh hình 4T1). Bốn cytokine hạ lưu của IL-12, cụ thể là IFN-𝛾, yếu tố hoại tử khối u-𝛼 (TNF-𝛼), interleukin{{10}} (IL-6) và interleukin -10 (IL-10) đã được chọn làm chỉ số phản ứng viêm. Trong số đó, IFN-𝛾, TNF- 𝛼 và IL-6 là các cytokine tiền viêm quan trọng có liên quan đến tác dụng chống ung thư của IL-12,[20,38] trong khi IL{{20 }} là một cytokine chống viêm, là một phản hồi tiêu cực đối kháng kích thích IL{21}}.[20,39] Nano-IL-12 và IL{26}} tự do đã được tiêm hai lần vào Ngày 0 và 3 và phản ứng viêm được theo dõi hàng ngày trong 1 tuần. Cài đặt thử nghiệm này cho phép chúng tôi xác định tác động của cả liều tiêm đơn và liều lặp lại đối với phản ứng viêm theo không gian và thời gian. Lần tiêm IL{30}} tự do đầu tiên vào Ngày 0 đã dẫn đến sự tiết ra bốn cytokine trong máu và các cơ quan, với nồng độ đỉnh trong huyết tương được quan sát thấy vào Ngày 2 (Hình 3a–e,g), cho thấy nồng độ đã tắt mạnh -viêm mục tiêu liên quan đến các tác dụng phụ liên quan đến miễn dịch (irAE) của IL-12.[8,10] Mặt khác, lần tiêm Nano-IL- 12 đầu tiên cho thấy nồng độ cytokine thấp hơn đáng kể so với IL{41}} tự do trong máu và các cơ quan khỏe mạnh, cho thấy sự điều hòa phản ứng viêm ngoài mục tiêu. Lần tiêm IL{43}} tự do thứ hai vào Ngày thứ 3 lại kích thích tiết IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL-6. Tuy nhiên, mức đỉnh điểm của IFN-𝛾 và TNF-𝛼 quan sát được vào Ngày 5 rõ ràng là thấp hơn so với mức độ quan sát được vào Ngày 2 sau lần tiêm IL{52}} đầu tiên. Hơn nữa, lần tiêm IL{53}} tự do thứ hai đã làm tăng đáng kể mức IL-10 chống viêm trong huyết tương, các cơ quan và khối u, điều này có liên quan đến sự mở rộng quá mức toàn thân của các tế bào Th1 để tạo ra một giai đoạn điều tiết.[40] Phản ứng khác biệt như vậy gây ra từ việc điều trị IL-12 lặp đi lặp lại đã được xác nhận trong các thử nghiệm lâm sàng ở người và nó góp phần làm giảm tác dụng sinh học của IL-12, bao gồm cả hiệu lực chống ung thư.[20] Ngược lại với IL-12, lần tiêm Nano-IL-12 thứ hai không làm trầm trọng thêm quá trình bài tiết IL-10 trong máu và các cơ quan. Ngoài ra, nồng độ của các cytokine gây viêm trong máu và các mô khỏe mạnh thấp hơn đáng kể so với IL{66}} tự do. Những kết quả này cho thấy Nano-IL{68}} không chỉ có thể làm giảm phản ứng viêm toàn thân mà còn khắc phục được những hạn chế của việc sử dụng IL{69}} lặp đi lặp lại, vốn gây ra phản ứng chống viêm phản tác dụng. Trong các khối u, một mũi tiêm Nano-IL{72}} qua đường tĩnh mạch đã thúc đẩy sản xuất IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL-6 gây viêm, đạt được nồng độ trong khối u cao hơn đáng kể so với IL tự do{{77} } điều trị (Hình 3f,g). Trong khi đó, phương pháp điều trị bằng Nano-IL{80}} khiến IL-10 chống viêm trong khối u thấp hơn so với IL-12 tự do, tránh khởi phát phản ứng chống viêm. Hơn nữa, sau lần tiêm Nano-IL-12 thứ hai, nồng độ cao của các cytokine gây viêm vẫn được duy trì trong các khối u, trong khi nồng độ IL-10 trong khối u được giữ ở mức thấp. Sự điều hòa tăng cường IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL-6 này cũng như sự điều hòa giảm IL-10 trong các khối u tương quan với nồng độ Nano-IL-12 cao và bền vững trong khối u, đồng thời hỗ trợ phản ứng viêm tăng cao đối với Nano-IL-12, điều này rất quan trọng để nâng cao hiệu quả chống ung thư.[41]
Để kiểm tra xem Nano-IL{1}} có thể cải thiện hiệu quả thông qua việc kiểm soát tình trạng viêm theo không gian và thời gian hay không, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm trong Hình 2e, nhưng lần này chúng tôi điều trị cho chuột với liều thấp hơn 10-, tức là, 1 ug IL-12 tương đương, sử dụng lịch dùng thuốc lặp lại để kích hoạt phản ứng miễn dịch chống lại IL- 12 miễn phí. Theo phương pháp điều trị định kỳ liều thấp này, Nano-IL-12 đã nâng cao rõ ràng hiệu quả chống khối u so với IL-12 ở các khối u TNBC 4T1 (Hình 3h), dẫn đến khối u phát triển chậm hơn và kéo dài thời gian sống sót. Mặt khác, phương pháp điều trị IL{15}} miễn phí cho thấy hiệu quả không đáng kể ngay cả sau khi được tiêm liều mạnh sáu lần, điều này có thể là do sự phát triển của các cytokine chống viêm như IL-10. Những kết quả này hỗ trợ khả năng của Nano-IL{19}} trong việc tăng cường hiệu quả chống ung thư bằng cách kiểm soát tình trạng viêm theo thời gian. Việc kiểm soát phản ứng viêm cũng giúp nâng cao tính an toàn. Chúng tôi đã tiến hành đánh giá mô học và phân tích máu để xác định độc tính của IL{{20}} và Nano-IL-12 sau hai lần tiêm vào Ngày 0 và 3 (Hình S7a,c, Thông tin hỗ trợ) . Kết quả cho thấy độc tính đối với gan, thận và tuyến tụy thấp hơn đáng kể khi điều trị bằng Nano-IL{27}} so với IL-12 tự do. Ngoài ra, sự thay đổi trọng lượng cơ thể trong quá trình điều trị cũng được theo dõi như một thông số về độc tính. Động vật được điều trị bằng Nano-IL{30}} tăng cân nhẹ trong quá trình điều trị, trong khi những con chuột nhận được IL-12 miễn phí lại bị giảm cân (Hình S7b, Thông tin hỗ trợ). Do đó, những quan sát này chỉ ra rằng Nano-IL- 12 có thể ưu tiên thúc đẩy phản ứng viêm trong các khối u để nâng cao hiệu quả chống ung thư đồng thời hạn chế các tác động ngoài mục tiêu ở các mô khỏe mạnh nhằm giảm độc tính và làm giảm phản ứng chống viêm phản tác dụng.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.4. Phương pháp điều trị bằng Nano-IL-12 gây ra sự xâm nhập của tế bào miễn dịch chống khối u trong TME
IL-12 còn được gọi là yếu tố kích thích tế bào T, vì nó có thể kích thích sự phát triển và chức năng của tế bào T để bắt đầu các phản ứng miễn dịch chống ung thư nâng cao. Do đó, chúng tôi đã đánh giá sự xâm nhập của tế bào CD8+ vào các khối u sau khi điều trị bằng Nano-IL-12 lặp đi lặp lại. Phân tích tế bào học dòng chảy của khối u ác tính B16F10 được điều trị bằng hai lần tiêm IL tự do-12 hoặc Nano-IL-12 ở mức tương đương/tiêm 1 IL-12 xấu xí cho thấy rằng Nano-IL{{13} } đã tăng cường đáng kể khả năng xâm nhập của tế bào T CD8+ vào khối u so với IL-12 tự do (Hình 4a). Bằng cách thực hiện thí nghiệm làm suy giảm tế bào miễn dịch ở chuột mang khối u TNBC 4T1, chúng tôi đã nghiên cứu sự đóng góp của các quần thể tế bào miễn dịch khác nhau vào phản ứng từ phương pháp điều trị bằng Nano-IL{20}}. Nano-IL-12 đã được tiêm iv năm lần vào Ngày 7, 9, 11, 13 và 15 (tương đương/tiêm 1 ug IL-12). Hơn nữa, chuột được tiêm kháng thể GM1 kháng CD4, kháng CD8 hoặc kháng asiago vào màng bụng (ip) vào Ngày 6, 8 và 10 để làm cạn kiệt CD4+, CD8+, hoặc tế bào NK tương ứng. Kết quả cho thấy sự suy giảm của tế bào T gây độc tế bào CD8+, tế bào T CD4+ và tế bào NK làm giảm đáng kể hiệu quả điều trị của Nano-IL-12, được biểu thị bằng sự phát triển khối u nhanh hơn và tỷ lệ sống sót giảm ở các nhóm bị cạn kiệt so với những con chuột chỉ được điều trị bằng Nano-IL{46}} (Hình 4b). Kết quả này phù hợp với chức năng sinh học của IL-12, bao gồm tăng cường hoạt động gây độc tế bào của tế bào T CD8 [42] và tế bào NK,[43] và làm trung gian cho sự biệt hóa của tế bào T ngây thơ thành tế bào T trợ giúp (Th) .[44]
Hơn nữa, hiệu quả giảm thiểu khác nhau của hoạt động chống khối u do thí nghiệm cạn kiệt cho thấy mức độ liên quan của từng quần thể tế bào đối với hiệu quả của Nano-IL-12, trong đó tế bào T gây độc tế bào CD8+ là thành phần quan trọng nhất . Phân tích hóa mô miễn dịch của các phần khối u TNBC 4T1 cho thấy sự phân bố không gian của các tế bào tác động xâm nhập khối u (Hình 4c). Mặc dù IL{7}} tự do không cải thiện sự hiện diện của tế bào T gây độc tế bào CD8+ và tế bào Tbet+ (Th1) trong các khối u, nhưng Nano-IL-12 đã thúc đẩy sự xâm nhập cao của cả hai tế bào vào sâu các vùng khối u. Ngoài ra, sự điều hòa tăng của Granzyme B trong Tế bào CD8+ cho thấy mức độ kích hoạt cao hơn của tế bào T gây độc tế bào sau khi xử lý bằng NanoIL{14}} (Hình 4d). Hơn nữa, chúng tôi quan sát thấy rằng phương pháp điều trị bằng Nano-IL{17}} đã làm tăng biểu hiện PD-L1 ở các khối u so với các khối u được điều trị bằng PBS và IL tự do{{20}}. Mức PD-L1 tăng lên này có thể là do IFN-𝛾 khối u được tạo ra bởi Nano-IL-12 cao hơn, được báo cáo là có tác dụng kích thích biểu hiện PD-L1 trong mô khối u,[45] đóng vai trò như một cơ chế ức chế miễn dịch chống lại sự xâm nhập của tế bào lympho. Sự điều hòa lại PD-L1 trong khối u này gợi ý khả năng tổng hợp hiệu quả chống khối u của Nano-IL-12 bằng cách kết hợp nó với các ICI chống PD-1 hoặc chống PD-L1. Dựa trên quan sát ở trên, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của Nano-IL-12 như một liệu pháp đơn trị liệu và kết hợp với kháng thể antiPD-1 trên TME (Hình 4e). Thí nghiệm được thực hiện trên các khối u TNBC chỉnh hình được điều chế từ các tế bào 4T1 biểu hiện hemagglutinin (4T1-HA) vì hemagglutinin là một chất gây miễn dịch được xác định rõ, có thể tạo ra phản ứng tế bào lympho T gây độc tế bào đặc hiệu với kháng nguyên trong mô hình chuột.[46 ,47] Những con chuột này được điều trị hai lần bằng 10 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL-12 tương đương vào Ngày 0 và 3, và đối với liệu pháp kết hợp, những con chuột này đồng thời được tiêm hai lần 100 thuốc chống PD xấu xí -1 kháng thể. Vào ngày thứ 7, các mẫu khối u được thu hoạch để đo tế bào theo dòng chảy.
Kết quả xác nhận rằng phương pháp điều trị bằng Nano-IL-12 khiến bạch cầu (CD{2}}) xâm nhập vào khối u cao hơn IL-12. Sự kết hợp giữa Nano-IL-12 với kháng thể kháng PD-1 cũng tạo ra các tế bào CD45+ cao hơn trong các khối u. Trong số các bạch cầu, tế bào bạch huyết và tế bào T được điều hòa bởi Nano-IL{10}} và bởi tổ hợp kháng thể Nano-IL- 12/anti-PD{14}}. Phương pháp điều trị bằng Nano-IL{16}} dẫn đến sự thay đổi khiêm tốn trong quần thể tế bào NK nhưng lại dẫn đến những thay đổi đáng kể trong phân nhóm tế bào T so với IL{17}} tự do. Đáng chú ý là sự xâm nhập của tế bào T CD8+ trong các khối u HA 4T1-được Nano-IL-12 tăng rõ ràng so với IL{23}} tự do. Hơn nữa, các tế bào HA-tetramer+ T, tương ứng với các tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên, đã tăng đáng kể trong sự kết hợp kháng thể Nano-IL-12 cộng với kháng thể kháng PD- 1, cho thấy việc thúc đẩy hệ miễn dịch thích ứng phản ứng nhờ sức mạnh tổng hợp của Nano-IL-12 và ICI. Các tế bào T CD4+ nói chung thể hiện sự điều hòa tăng lên trong các nhóm được xử lý NanoIL-12. Để xác định rõ hơn quần thể tế bào T CD4+ trong các khối u, chúng tôi đã nhuộm các tế bào bằng thuốc chống Foxp3 để nghiên cứu các tế bào T điều hòa (Treg). Mặc dù đơn trị liệu chống PD{39}} không cho thấy bất kỳ sự ức chế nào đối với Tregs trong mô hình khối u HA 4T1-, sự kết hợp giữa Nano-IL-12 cộng với kháng PD-1 một cách đáng kể làm cạn kiệt Tregs. Hơn nữa, các khối u được điều trị bằng Nano-IL{47}} có lượng tế bào Th cao hơn IL-12 tự do. Những kết quả này chỉ ra rằng phương pháp điều trị bằng Nano-IL-12 đã tăng cường khả năng lọc của các tế bào miễn dịch chống khối u và phối hợp với các kháng thể kháng PD-1 để vượt qua TME ức chế miễn dịch.
Hình 3. Nano-IL-12 kiểm soát phản ứng viêm theo thời gian theo không gian. a) Nồng độ cytokine tiền viêm (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) và kháng viêm (IL-10) trong máu ở chuột mang 4T1-được tiêm 1{{14 }} ug IL-12 hoặc Nano-IL{13}} tương đương hai lần vào Ngày 0 và 3. Nồng độ cytokine được đo bằng ELISA. Các giá trị cao nhất sau hai lần tiêm (vào Ngày 2 và 5 đối với IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL-10; vào Ngày 2 và 6 đối với IL-6) được hiển thị dưới dạng biểu đồ thanh trên bảng bên phải. b–f) Nồng độ Cytokine trong các cơ quan và khối u của chuột mang 4T{25}}được tiêm 10 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL{29}} tương đương hai lần vào Ngày 0 và 3. Những con chuột này được hy sinh vào Ngày 2 và Ngày 5 để thu thập mô. (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD; n=6 chuột trong mỗi nhóm; giá trị p được tính toán thông qua thử nghiệm t không ghép đôi.) g) Bản đồ nhiệt về nồng độ cytokine trong máu, các cơ quan và khối u từ các giá trị trung bình trong af được chuyển đổi thành điểm Z. h) Hoạt tính chống khối u của việc tiêm iv lặp lại (tiêm vào Ngày 7, 9, 11, 13, 15 và 25, được biểu thị bằng mũi tên) của 1 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL tương đương-12 chống lại TNBC chuột. Các đường cong phát triển khối u riêng lẻ được hiển thị trong bảng bên trái. Đường cong khối lượng khối u trung bình được hiển thị trong bảng trung tâm và đường cong sinh tồn được hiển thị trong bảng bên phải (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM; n=6 chuột trên mỗi nhóm, giá trị p được tính toán thông qua phân tích thứ hạng log ).
Hình 4. Tác dụng chống khối u của Nano-IL-12 được tạo ra từ sự xâm nhập nâng cao của các tế bào tác động trong TME. a) Phân tích tế bào học dòng chảy về sự xâm nhập của CTL trong khối u ác tính sau khi điều trị bằng Nano-IL-12. Chuột được tiêm tế bào B16F10 vào Ngày 0. IL-12 (1 ug) hoặc Nano-IL{12}} tương đương đã được tiêm iv hai lần vào Ngày 8 và 11. Các mẫu khối u được thu thập và phân tích vào Ngày 15 (Dữ liệu hiển thị dưới dạng trung bình ± SD; n {{ 16}} chuột trong mỗi nhóm; giá trị p được tính toán thông qua ANOVA một chiều). b) Hoạt tính chống ung thư của Nano-IL-12 khi các tế bào CD4+, CD8+ và NK cạn kiệt. Những con chuột mang khối u 4T1 đã được tiêm iv Nano-IL-12 (tương đương 1 ug IL-12) vào các Ngày 7, 9, 11, 13 và 15. Hơn nữa, những con chuột này được tiêm thuốc chống CD4 , kháng thể kháng CD8 và kháng asiago GM1 vào Ngày 6, 8 và 10. Đường cong phát triển khối u (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM) và đường cong sinh tồn đã được ghi lại (n=6 chuột trong mỗi nhóm, giá trị p được tính toán thông qua phân tích thứ hạng log). c) Hình ảnh IHC của lát cắt khối u 4T1. Những con chuột mang khối u TNBC 4T1 (khối lượng khối u trung bình: 200 mm3) được tiêm PBS hai lần, 10 IL xấu xí-12 hoặc Nano-IL-12 tương đương vào Ngày 0 và 3. Vào Ngày 7, chuột đã bị hy sinh để thu thập các khối u. Các tế bào CD8+, Tbet hoặc PD-L1+ trong khối u được hiển thị bằng màu vàng. Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst (màu xanh). Thanh tỷ lệ=1 mm. d) Nhuộm miễn dịch Granzyme B (xanh) và CD8 (đỏ) trên lát cắt khối u 4T1. Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst (màu xanh). Các pixel màu vàng biểu thị các tế bào T CD8+ đã được kích hoạt. Thanh tỷ lệ=100 μm. e) Phân tích thâm nhiễm tế bào bạch huyết trong khối u 4T1-HA được điều trị bằng PBS, kháng thể kháng PD1, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 cộng với kháng thể Kháng thể PD1 và Nano-IL-12 cộng với kháng thể kháng PD1. IL-12 và Nano-IL-12 được tiêm iv ở mức 10 xấu vào Ngày thứ 7 và 9 sau khi cấy. Anti-PD-1 được tiêm ip ở mức 100 ug vào Ngày 8 và 10 sau khi tiêm chủng. Vào Ngày 17, những con chuột bị giết và các khối u được đồng nhất hóa để đo tế bào học dòng chảy (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD, n=5 mẫu trên mỗi nhóm, giá trị p được tính toán thông qua ANOVA một chiều).
2.5. Phương pháp xử lý Nano-IL-12 Kích hoạt TME từ cấp độ phiên mã để tăng cường phản ứng ICI
Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu việc kích hoạt TME của các khối u HA 4T1-sau khi điều trị từ mức độ biểu hiện gen bằng phân tích phiên mã. Việc giải trình tự tổng số mẫu RNA được chiết xuất từ các mô khối u được tiến hành sau khi điều trị bằng PBS, kháng thể kháng PD-1, IL-12, Nano-IL-12 và sự kết hợp của các cytokine với ICI. Sơ đồ nhiệt biểu hiện gen toàn cầu chỉ ra rõ ràng cấu hình gen khác biệt trong các khối u nhận Nano-IL-12 và sự kết hợp giữa Nano-IL-12 với anti-PD- 1 (Hình S11, Thông tin hỗ trợ ). Để xác định các quá trình sinh học bị ảnh hưởng bằng cách xử lý Nano-IL{15}}, chúng tôi đã phân tích các gen được biểu hiện khác nhau trong mỗi nhóm và tiến hành phân tích làm giàu trên các gen được điều hòa tăng và giảm (Hình 5a, b). Cả phân tích GOBP và KEGG đều tiết lộ rằng, so với phương pháp điều trị IL{17}} và PBS, phương pháp điều trị Nano-IL-12 đã điều chỉnh tăng cường rõ rệt sự kích thích tăng sinh, biệt hóa và kích hoạt chức năng của các tế bào miễn dịch tác động khác nhau, chẳng hạn như tế bào T tăng sinh, biệt hóa tế bào T thành tế bào Th và kích hoạt tế bào T và đường truyền tín hiệu thụ thể tế bào T. Hơn nữa, các gen liên quan đến biểu hiện PD-L1 và con đường điểm kiểm tra PD{22}} cũng được phát hiện là được điều chỉnh lại khi xử lý bằng Nano-IL{24}}. Những kết quả này hỗ trợ sự kích thích mạnh mẽ của NanoIL{25}} đến tế bào T được quan sát thấy trong các nghiên cứu tế bào học dòng chảy và mô miễn dịch học. Đồng thời, các gen liên quan đến các tế bào miễn dịch khác, như tế bào đơn nhân và tế bào NK, bị ảnh hưởng tích cực bởi phương pháp điều trị Nano-IL{27}}. Ngoài ra, phản ứng của cytokine và các quá trình miễn dịch khác, như trình diện kháng nguyên, cũng được điều chỉnh lại nhờ phương pháp điều trị bằng Nano-IL{29}}. Mặt khác, các con đường điều hòa giảm Nano-IL{31}} liên quan đến sự phân chia tế bào, cho thấy rằng phương pháp điều trị có thể ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào khối u (Hình S11, Thông tin hỗ trợ). Những kết quả này cho thấy những ưu điểm của Nano-IL-12 trong việc kích hoạt cả nhánh bẩm sinh và nhánh thích ứng của khả năng miễn dịch trong khối u.
Nghiên cứu sâu hơn về các liệu pháp kết hợp cho thấy rằng phương pháp điều trị kết hợp giữa kháng thể Nano-IL{1}} cộng với kháng thể kháng PD-1 đã nâng cao khả năng miễn dịch trong khối u so với IL-12 cộng với kháng thể kháng PD{{6} } kháng thể hoặc đơn trị liệu chống PD{8}} bằng cách kích thích cả con đường miễn dịch bẩm sinh và thích ứng (Hình 5b và Hình S11c, Thông tin hỗ trợ). Thật ấn tượng, sự kết hợp kháng thể NanoIL{11}} cộng với kháng thể kháng PD{13}} đã dẫn đến sự ức chế mạnh hơn trên các con đường liên quan đến nguyên phân, suy ra rằng sự kết hợp này có thể làm trung gian hoạt động tiêu diệt mạnh hơn của các tế bào tác động đã xâm nhập chống lại các tế bào khối u. Dựa trên kết quả RNA-seq, chúng tôi cũng đã phân tích quần thể tế bào miễn dịch xâm nhập khối u (Hình 5c, d). Giống như kết quả từ phương pháp đo tế bào theo dòng chảy, các nhóm được xử lý bằng Nano-IL{18}} cho thấy sự xâm nhập tăng cường của các tế bào T CD8+. Hơn nữa, kết quả cũng cho thấy sự điều hòa của bạch cầu đơn nhân và bạch cầu hạt, xác nhận tình trạng viêm tăng cường trong các khối u từ con đường miễn dịch bẩm sinh được tăng cường. Những kết quả này đã xác nhận rằng Nano-IL-12 tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ chống lại các khối u và sự kết hợp với chất chống PD-1 có thể củng cố quá trình này.
Hình 5. Phương pháp xử lý Nano-IL{2}} giúp tăng cường kích hoạt miễn dịch trong TME để tăng cường kháng thể kháng PD1. a) Sơ đồ núi lửa của các gen được biểu hiện khác nhau so sánh giữa Nano-IL-12 so với IL-12 và Nano-IL-12 + anti-PD-1 so với IL{{12} } chống PD-1. Các sơ đồ thu được từ phân tích RNA-seq của các khối u HA 4T1-được điều trị bằng các phương pháp điều trị khác nhau: 10 IL xấu xí-12 và Nano-IL-12 tương đương đã được tiêm iv vào Ngày 7 và 9 sau quá trình cấy ghép . Anti-PD-1 được tiêm ip ở mức 100 ug vào Ngày 8 và 10 sau khi tiêm chủng. Vào ngày 17, những con chuột bị giết để lấy mẫu khối u. b) Phân tích mức độ phong phú cho thấy các con đường được điều chỉnh tăng lên trong hai cặp so sánh trong a. c) Sơ đồ nhiệt của quần thể tế bào trong TME được xác định bởi RNA-seq. Các quần thể đã được chuyển đổi thành điểm Z để vẽ hình. d) Biểu đồ của các quần thể tế bào cho thấy sự khác biệt đáng kể trong nhiều so sánh (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD; đối với nhóm PBS, n=5 mẫu; đối với các nhóm khác, n=4 mẫu cho mỗi nhóm; giá trị p được tính toán thông qua ANOVA một chiều).
2.6. Nano-IL-12 phối hợp với ICI để loại bỏ hiệu quả các khối u nguyên phát và di căn
Để nghiên cứu tiềm năng điều trị của Nano-IL-12 trong việc phối hợp với ICI, các khối u TNBC nguyên phát chỉnh hình đã được thiết lập ở chuột bằng cách cấy tế bào 4T1 vào lớp mỡ ở vú. Những con chuột được điều trị bằng Nano-IL-12 theo các lịch trình liều lượng và kiểu kết hợp khác nhau với ICI để kiểm tra hiệu quả chống ung thư của các phương pháp điều trị tương ứng. Chúng tôi nhận thấy rằng ngay cả với liều lượng thấp (tương đương 1 ug IL-12/tiêm), việc điều trị lặp lại bằng Nano-IL-12 đã tạo ra hoạt động chống khối u rõ ràng chống lại các khối u TNBC nguyên phát dưới dạng đơn trị liệu, như được thể hiện bằng việc ức chế tốc độ phát triển của khối u và khả năng sống sót kéo dài (Hình S12, Thông tin hỗ trợ). Tuy nhiên, việc điều trị IL{12}} miễn phí với liều lượng này không cho thấy bất kỳ hiệu quả nào, ngay cả khi kết hợp với liệu pháp chống PD{14}}. Sự kết hợp giữa Nano-IL- 12 với chất chống PD-1 đã làm tăng thêm hiệu quả và đạt được CR. Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu liều Nano-IL-12 cao hơn (tương đương/tiêm 10 IL-12 xấu) và kết hợp nó với hỗn hợp ICI (kháng thể antiPD-1 và kháng CTLA4) để đáp ứng hiệu quả điều trị tiềm năng. Đáng chú ý, ở liều này, liệu pháp kết hợp Nano-IL{27}} với ICI đã ngăn chặn sự phát triển của khối u và loại bỏ hoàn toàn các khối u (Hình 6a), với tất cả những con chuột đều biểu hiện CR trong nhóm điều trị này. Hơn nữa, những con chuột được chữa khỏi cho thấy khả năng chống lại sự tấn công trở lại của khối u bằng tế bào 4T1, hỗ trợ sự tồn tại của trí nhớ miễn dịch mạnh mẽ sau khi điều trị bằng liệu pháp kết hợp Nano-IL{32}} và ICI.
cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch
TNBC được biết đến như một khối u hung hãn với tỷ lệ di căn xa cao. [48,49] Vì vậy, tiếp theo chúng tôi đã nghiên cứu hiệu suất của Nano-IL-12 trong mô hình TNBC di căn. Một mô hình TNBC di căn tự phát đã được thiết lập bằng cách cắt bỏ các khối u chỉnh hình nguyên phát 4T1, điều này sẽ dẫn đến sự phát triển của di căn ở nhiều cơ quan, chủ yếu là phổi.[50] Trong mô hình này, liệu pháp kết hợp Nano-IL{8}} với ICI cũng cho thấy kết quả khả quan, giúp ngăn chặn sự tiến triển của di căn phổi (Hình 6b) và dẫn đến CR ở tất cả những con chuột được điều trị. Hơn nữa, khi thử thách lại bằng cách tiêm tế bào 4T1 qua đường tĩnh mạch, hầu hết những con chuột được chữa khỏi đều cho thấy sức đề kháng mạnh mẽ, cho thấy trí nhớ miễn dịch hiệu quả từ sự kết hợp Nano-IL{13}} và ICI. Ngoài TNBC, chúng tôi cũng đã thử nghiệm Nano-IL{15}} kết hợp với ICI trong mô hình khối u ác tính B16F10 nguyên phát (Hình S13, Thông tin hỗ trợ). Kết quả cho thấy rằng sự kết hợp giữa Nano-IL-12 (tương đương/tiêm 10 ug IL-12) với kháng thể kháng PD-1 đã dẫn đến CR ở 4 trong số 6 con chuột trong nhóm và những con chuột được chữa khỏi cho thấy khả năng chống lại sự tái sử dụng tế bào B16F10, cho thấy có trí nhớ miễn dịch mạnh mẽ.
3. Thảo luận
Chúng tôi đã phát triển chiến lược IL{1}} có thể kích hoạt khối u bằng cách sử dụng các nanocytokine nhạy cảm (Nano-IL-12) có thể làm giảm hoạt tính sinh học của IL-12 ở pH 7,4, nhưng lấy lại cytokine hoạt động hoàn toàn ở pH nội bào. Sau khi tiêm vào cơ thể, Nano-IL-12 lưu thông ổn định trong máu, làm giảm phản ứng miễn dịch ở những vị trí không có bệnh lý và tỷ lệ mắc irAE, ngay cả sau khi tiêm nhiều lần. Mặt khác, sự tích lũy và kích hoạt cao của Nano-IL{11}} trong các khối u dẫn đến sự nâng cao đáng kể về hiệu quả và sức mạnh tổng hợp với ICI, đạt được CR trong các mô hình khối u lạnh kháng ICI và mang lại hiệu quả vững chắc trí nhớ miễn dịch sau điều trị.
Nano-IL{1}} đã kích hoạt TME một cách sâu sắc bằng cách kích thích sự tiết ra mạnh mẽ các cytokine gây viêm, tăng cường sự xâm nhập của các tế bào tác động và giảm sự hiện diện của các tế bào ức chế miễn dịch. Hơn nữa, Nano-IL-12 đã điều chỉnh tăng mức PD-L1 trong tế bào khối u, điều này có thể thúc đẩy hoạt động của các kháng thể kháng PD-1. Những thay đổi trong TME do Nano-IL-12 gây ra đã phối hợp với kháng thể antiPD{10}} để kích thích khả năng miễn dịch ung thư thông qua việc tăng cường trình bày kháng nguyên, tăng cường sự hiện diện của các tế bào tác động và tăng cường hoạt động của chúng, cũng như thúc đẩy sự tương tác của tế bào miễn dịch. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng việc phong tỏa điểm kiểm tra kháng PD1/kháng PD-L1 có tỷ lệ đáp ứng cao hơn ở những bệnh nhân TNBC dương tính với PD-L1-có số lượng tế bào lympho thâm nhiễm khối u cao.[51,52] hiệu suất tổng thể của việc phong tỏa điểm kiểm tra miễn dịch như một liệu pháp đơn trị liệu chống lại TNBC là không đạt yêu cầu [53,54] do biểu hiện nhìn chung thấp và TME không đồng nhất đáng kể của TNBC [55,56] Trên thực tế, chỉ phong tỏa PD-L1 kết hợp với hóa trị liệu (Nab-Paclitaxel) đã được phê duyệt ở những bệnh nhân TNBC di căn, điều này chỉ mang lại lợi ích sống sót tổng thể khiêm tốn ở một phần nhỏ bệnh nhân TNBC. [57] Do đó, khả năng Nano-IL{30}} ghi đè lên TME ức chế miễn dịch và tăng cường biểu hiện PD-L1 của TNBC có thể mang lại một giải pháp thay thế mạnh mẽ để nâng cao tỷ lệ phản ứng của việc phong tỏa điểm kiểm tra. Độ an toàn nâng cao của Nano-IL-12 cũng là một lợi thế đáng kể cho ứng dụng điều trị. Các nghiên cứu lâm sàng trước đây đã chỉ ra rằng IL-12 được tiêm một cách có hệ thống gây ra độc tính mạnh về huyết học và gan.[58,59] Các tác dụng phụ như vậy chủ yếu liên quan đến việc sản xuất IFN-𝛾 và TNF-𝛼 do IL gây ra{{40} } điều trị.[42,60] Trong nghiên cứu của chúng tôi, Nano-IL-12 cho thấy nồng độ cytokine thấp hơn đáng kể so với IL-12 tự do trong máu và các cơ quan, giúp hạn chế tổn thương cơ quan. Do đó, chúng tôi có thể tiêm Nano-IL- 12 nhiều lần ở mức 10 ug IL-12 cho mỗi con chuột, tức là khoảng 500 ug kg-1, tức là khoảng {{52} }cao hơn gấp nhiều lần so với liều dung nạp tối đa (MTD) của IL-12 ở người, tức là 500 ng kg-1. [61] Một tác dụng phụ quan trọng khác của liệu pháp IL{57}} toàn thân được quan sát thấy trong các nghiên cứu lâm sàng là sự khởi đầu của phản ứng chống viêm thích ứng sau lần sử dụng IL-12 thứ hai, dẫn đến giảm hiệu quả. [20,21] Hiện tượng như vậy có liên quan đến các cơ chế phản hồi tiêu cực liên quan đến việc sản xuất quá mức IL chống viêm-10 và sự suy giảm của các cytokine gây viêm như IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL{{ 67}}.[20,22] Nano-IL-12 tránh được sự gia tăng IL-10 trong máu và các cơ quan sau lần tiêm thứ hai, điều này có thể thuận tiện cho việc thực hiện lịch trình tiêm lặp lại mà không làm giảm nồng độ tác dụng chống ung thư. Đáng chú ý là việc điều trị bằng Nano-IL-12 không làm tăng nồng độ IL-10 trong khối u, duy trì nồng độ IFN-𝛾, TNF-𝛼 và IL-6 trong khối u cao.
Hình 6. Nano-IL-12 phối hợp với các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch để loại bỏ các khối u vú. Trong cả hai mô hình TNBC chỉnh hình và di căn, chuột được nhóm lại để nhận các liệu pháp ICI PBS, IL-12 + (kháng CTLA4 và chống PD-1) và Nano-IL-12 + ICI (liều và lịch trình điều trị được thể hiện trong sơ đồ ở bảng phía trên tương ứng). a) Liệu pháp kết hợp Nano-IL{11}} và ICI đã dẫn đến việc loại bỏ hoàn toàn các khối u chỉnh hình ở tất cả các con chuột được điều trị. Các đường cong phát triển khối u riêng lẻ được hiển thị trong bảng bên trái. Khối lượng khối u trung bình và đường cong sống sót được hiển thị ở bảng phía trên bên phải. Những con chuột được chữa khỏi cho thấy khả năng phòng vệ mạnh mẽ chống lại việc tiêm lại tế bào 4T1 vào động vật có vú mà khối u không phát triển ở những con chuột được điều trị (bảng phía dưới bên phải). b) Liệu pháp kết hợp Nano-IL{17}} và ICI cho thấy sự ức chế mạnh mẽ sự tiến triển của khối u di căn. Sau khi điều trị (Ngày 23), phổi của những con chuột được điều trị bằng liệu pháp kết hợp Nano-IL{20}} ICI cho thấy ít di căn hơn rõ ràng, được thể hiện qua các bức ảnh đại diện (mũi tên màu xanh lá cây: di căn vĩ mô) và đánh giá mô học (Thanh tỷ lệ {{21) }} μm) được trình bày ở bảng bên trái. Liệu pháp kết hợp Nano-IL{23}} ICI cuối cùng đã mang lại phản ứng hoàn toàn ở tất cả những con chuột được điều trị, như được biểu thị bằng các đường cong sinh tồn (bảng phía trên bên phải). Ngoài ra, những con chuột được chữa khỏi bệnh còn cho thấy khả năng phòng vệ mạnh mẽ chống lại sự tái phát của khối u bằng cách tiêm tế bào 4T1 (bảng phía dưới bên phải). (Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM.; n=6 chuột trong mỗi nhóm; giá trị p được tính thông qua phân tích thứ hạng log).
Vì IL-12 được coi là một trong những cytokine kích thích miễn dịch mạnh nhất nên một số phương pháp đang được kiểm tra kỹ càng để làm giảm độc tính do IL-12-gây ra và tăng cường hiệu quả của nó. Các chiến lược sử dụng phương pháp tiêm trực tiếp vào khối u, chẳng hạn như các công thức dựa trên IL-12 và chất bổ trợ,[62] và DNA plasmid[63] hoặc RNA thông tin[64] mã hóa IL-12 để sản xuất cytokine tại chỗ, có thể tối đa hóa chỉ số điều trị.[8] Tuy nhiên, chính quyền địa phương có thể phải đối mặt với một số hạn chế trong phòng khám, bao gồm việc điều trị các khối u phát triển ở các vị trí không thể tiêm,[65] hiệu quả phụ thuộc vào người điều hành,[66] sự phân bố không đồng đều của thuốc tiêm trong khối u,[67] và phân phối không nhắm mục tiêu do rò rỉ gây ra.[68] Hơn nữa, hoạt tính chống ung thư của các công thức được tiêm vào trong khối u chống lại di căn xa chủ yếu dựa vào hiệu quả thay đổi của tác dụng abscopal, [69] cho thấy tỷ lệ xuất hiện thấp trong các nghiên cứu lâm sàng [70–72] và có thể không vượt qua được các tín hiệu ức chế miễn dịch trong di căn.[73] Khả năng sử dụng Nano-IL{21}} một cách an toàn bằng cách tiêm tĩnh mạch toàn thân, vốn là một quy trình lâm sàng tiêu chuẩn, có thể cho phép dược động học có thể dự đoán được và có khả năng tiếp cận tất cả các vị trí khối u thông qua nguồn cung cấp máu. Protein tổng hợp Fc dựa trên IL-12-[14] và immunocytokine[11–13] cũng có chung những ưu điểm này với NanoIL-12. Tuy nhiên, thành phần IL{28}} trong các hợp chất này hoạt động một cách có hệ thống, điều này gây ra mối lo ngại về an toàn. Ví dụ: các protein tổng hợp tuần hoàn kéo dài của IL-12 đã cho thấy nồng độ cao các cytokine miễn dịch IFN-𝛾[74,75] và IL{34}} trong huyết thanh đã cho thấy sự tích tụ ở các vị trí ngoài mục tiêu.[76, 77] Khả năng Nano-IL-12 kiểm soát kích hoạt không gian thời gian có thể cung cấp một chiến lược an toàn và hiệu quả với tính đặc hiệu trong việc nhắm mục tiêu khối u.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
Một hạn chế trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi là Nano-IL-12 dựa trên chuột IL-12. Xét rằng sự tương đồng giữa IL-12 của chuột và IL{4}} của con người là khoảng 60–70%, cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định công thức của nanocytokine dựa trên IL-12-của con người với hoạt tính và cấu hình an toàn tương đương với hệ thống dựa trên chuột. Thật đáng mừng là các thử nghiệm sơ bộ đã chỉ ra rằng các polyme được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi cũng có thể bao phủ IL-12 của con người với độ nhạy pH tương tự. Hơn nữa, vì các polyme có thể được thiết kế chính xác nên có thể phát triển một hệ thống dựa trên IL của con người với các cấu hình không gian thời gian phù hợp cho con người sử dụng. Tóm lại, Nano-IL-12 dưới dạng nano cytokine đã đạt được khả năng kiểm soát không gian thời gian hiệu quả đối với hoạt động của IL-12 khi sử dụng toàn thân, đảm bảo kích thích chính xác khả năng miễn dịch trong khối u để đạt được kết quả điều trị và an toàn thỏa đáng trong khối u lạnh nguyên phát và di căn mô hình, phối hợp phong tỏa trạm kiểm soát. Vì các polyme được sử dụng để lắp ráp Nano-IL{15}} có thể được thiết kế để đóng gói nhiều loại protein có trọng lượng phân tử và điện tích bề mặt khác nhau nên hệ thống này có tiềm năng triển vọng ứng dụng rộng hơn, chẳng hạn như đóng gói các cytokine trị liệu khác hoặc thậm chí cocktail cytokine. Hơn nữa, do hệ thống polyme có thể được thiết kế thêm để cảm nhận các kích thích khác ngoài pH, [78] các cytokine nano có thể được thiết kế để nhắm mục tiêu vào các vi môi trường khối u khác nhau. Cuối cùng, xem xét tiềm năng dịch chuyển của các polyme và nano cytokine được sử dụng, chiến lược này hứa hẹn cho tương lai của liệu pháp miễn dịch ung thư.
người giới thiệu
[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Mục sư Khám phá Thuốc 2021, 21, 509.
[2] A. Ribas, JD Wolchok, Khoa học 2018, 359, 1350.
[3] A. Haslam, V. Prasad, Mạng JAMA mở rộng 2019, 2, e192535.
[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Khám phá ung thư 2021, 11, 838.
[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. Mục sư lâm sàng. Oncol. 2020, 17, 251.
[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Sóc. Phòng khám. Oncol. Giáo dục. Sách. 2019, 39, 147.
[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. J. Lâm sàng. Oncol. 2020, 25, 790.
[8] KG Nguyễn, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, Front. Miễn dịch. 2020, 11, 2510.
[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K . Truman, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R. V Lukas, Khoa Ung thư Thần kinh 2021, 24, 951.
[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Ung thư 2021, 13, 167.
[11] A. Mansurov, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Gray, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. Sinh học. Anh. 2020, 4, 531.
[12] N. Pasche, D. Neri, Khám phá ma túy ngày nay 2012, 17, 583.
[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. Schlom, JL Gulley, lâm sàng. Ung thư Res. 2019, 25, 99.
[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.
[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Gray, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. Sinh học. Anh. 2022, 6, 819.
[16] HD Chang, A. Radbruch, Chuyên gia Rev. Clin. Miễn dịch. 2014, 3, 709.
[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. Học viện NY. Khoa học. 2007, 1109, 40.
[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.
[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.
[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Ung thư Res. 2003, 9, 76.
[21] JP Leonard, ML Sherman, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.
[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Ung thư Res. 1998, 4, 75.
[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Ung thư học 2013, 2, e22058.
[25] S. Damgaci, A. Ibrahim-Hashim, Thủ tướng Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Miễn dịch học 2018, 154, 354.
[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.
[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Sinh học. 2020, 20, 1900161.
[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.
[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, Adv. Giao thuốc Rev. 2016, 99, 28.
[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Chem., Int. Ed. 2016, 55, 1010.
[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Di căn ung thư Rev. 2019, 38, 149.
[32] G. Trinchieri, F. Gerosa, J. Leukocyte Biol. 1996, 59, 505.
[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Khoa học. 2020, 109, 496.
[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Tế bào gốc Int. 2013, 3, 1932.
[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyễn, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Tế bào gốc Int. 2017, 7, 5360.
[36] Nghị sĩ Hwang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Bản phát hành có kiểm soát 2019, 318, 270.
[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.
[38] G. Trinchieri, Annu. Linh mục Miễn dịch. 1995, 13, 251.
[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.
[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.
[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . Đầu tư. 2011, 121, 4746.
[42] W. Lasek, R. Zago˙zd˙zon, M. Jakobisiak, Nhà miễn dịch ung thư. Chất miễn dịch. 2014, 63, 419.
[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Chu, J. Zhang, Z. Tian, Hum. Miễn dịch. 2008, 69, 490.
[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.
[45] K. Mimura, JL Teh, H. OKama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Khoa học Ung thư. 2018, 109, 43.
[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.
[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.
[48] R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Ung thư Res. 2007, 13, 4429.
[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. Oncol. 2006, 24, 5652.
[50] AV Paschall, K. Liu, J. Exp trực quan. 2016, 2016, 54040.
[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.
[52] R. Thomas, G. Al-Khadairi, J. Decock, Mặt trận. Oncol. 2021, 10, 3464.
[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Lợi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. Oncol. 2019, 30, 397.
[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerusalem, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W .Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Ung thư vú Res. Đối xử. 2018, 167, 671.
[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akcakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 361.
[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Vú Ung thư Res. 2018, 20,71.
[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.
[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. Miễn dịch. 1994, 1, 187.
[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. Đầu tư. 1994, 71, 862.
[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.
[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. Oncol. 2003, 21, 2564.
[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , Nat. Sinh học. Anh. 2022, 6, 129.
[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. Đó. 2002, 5, 668.
[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zielinski, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst, và những người khác, Clin. Ung thư Res. 2020, 26, 6284.
[65] RS Riley, CH Tháng Sáu, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Mục sư Khám phá Ma túy 2019, 18, 175.
[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. Mục sư lâm sàng. Oncol. 2021, 18, 558.
[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.
[68] J. Hong, C.-O. Yun, BMC Biomed. Anh. 2019, 1, 17.
[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.
[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , NHƯ Yang, R.-A. Roman, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.
[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. J. Bức xạ. Oncol., Biol., Phys. 2013, 85, 293.
[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. Res. 2013, 1, 365.
[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. Oncol. 2021, 39, 1.
[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714
[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.
[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybridomics 2001, 20, 305.
[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. Công nghệ sinh học. 2002, 20, 264.
[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. Mẹ ơi. 2013, 12, 991.
[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. SLF, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, Bộ gen Biol. 2016, 17, 218
