Các túi màng ngoài của vi khuẩn gây ra sự thay đổi phiên mã ở cây Arabidopsis theo hướng kích hoạt hệ thống miễn dịch dẫn đến ức chế sự phát triển của mầm bệnh ở Planta

trừu tượng

Vi khuẩn gram âm hình thành các mụn nước hình cầu ở ngoại vi tế bào của chúng, sau đó chúng tách ra khỏi thành tế bào vi khuẩn để tạo thành các túi ngoại bào. Những cấu trúc có kích thước nano này, được gọi là túi màng ngoài (OMV), đã được chứng minh là có tác dụng thúc đẩy quá trình lây nhiễm và bệnh tật, đồng thời có thể tạo ra các hiệu ứng miễn dịch điển hình ở cả vật chủ là động vật có vú và thực vật. Để hiểu rõ hơn về sự thay đổi phiên mã rộng rãi mà thực vật trải qua sau khi tiếp xúc với OMV, chúng tôi đã xử lý cây giống Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) bằng OMV được tinh chế từ vi khuẩn gây bệnh thực vật gram âm Xanthomonas campestris pv. campestris và thực hiện phân tích RNA-seq trên OMV và các cây được xử lý mô phỏng vào lúc 2, 6 và 24 giờ sau thử thách. Sự thay đổi phiên mã rõ rệt nhất xảy ra ở hai thời điểm đầu tiên được thử nghiệm, được phản ánh qua số lượng gen biểu hiện khác nhau và sự thay đổi nếp gấp trung bình. OMV tạo ra sự thay đổi phiên mã lớn theo hướng kích hoạt hệ thống miễn dịch, điều chỉnh lại vô số con đường liên quan đến miễn dịch bao gồm nhiều loại thụ thể miễn dịch. So sánh phản ứng của Arabidopsis với OMV và với các bộ kích thích đã được tinh chế, cho thấy rằng OMV tạo ra một bộ gen và con đường tương tự như các bộ kích thích đơn lẻ, tuy nhiên, các con đường được kích hoạt bởi OMV chứ không phải bởi các bộ kích thích khác đã được phát hiện. Việc xử lý trước cây Arabidopsis bằng OMV và sau đó lây nhiễm mầm bệnh vi khuẩn cho chúng đã làm giảm đáng kể sự phát triển của mầm bệnh. Các đột biến ở thụ thể yếu tố kéo dài thực vật (EFR), thụ thể Flagellin (FLS2), hoặc đồng thụ thể kinase (BAK1) không nhạy cảm với Brassinosteroid 1, không ảnh hưởng đáng kể đến tác dụng mồi miễn dịch của OMV. Các kết quả này cùng nhau cho thấy rằng OMV tạo ra sự thay đổi phiên mã rộng rãi ở cây Arabidopsis dẫn đến sự điều hòa của nhiều con đường miễn dịch và sự thay đổi phiên mã này có thể tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn.

TỪ KHÓA

Arabidopsis thaliana, nhiễm khuẩn, túi ngoại bào, OMV, túi màng ngoài, miễn dịch thực vật, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch

1. GIỚI THIỆU

Thực vật liên tục phải đối mặt với các vi khuẩn gây hại phát triển mạnh trên các mô của chúng và cản trở sự phát triển bình thường. Một phản ứng phòng vệ hiệu quả phụ thuộc rất lớn vào việc phát hiện và xác định nhanh chóng và chính xác vi khuẩn xâm nhập. Với mục đích này, thực vật sử dụng các hệ thống giám sát rộng rãi để theo dõi sự xâm nhập của mầm bệnh (Cook và cộng sự, 2015). Người ta suy đoán rằng dòng đầu tiên của hệ thống giám sát thực vật, hay giao diện tế bào đầu tiên nơi thực vật và vi khuẩn tương tác, là không gian giữa các tế bào, apoplast. Ở đó, sự nhận biết các vi khuẩn xâm nhập được thực hiện qua trung gian bởi các thụ thể nhận dạng mẫu tiếp xúc với màng tế bào (PRR) (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). PRR nhận biết các yếu tố quyết định vi sinh vật hiện diện rộng rãi và được bảo tồn trong số nhiều vi khuẩn và được gọi là các mẫu phân tử liên quan đến vi khuẩn hoặc mầm bệnh (MAMPs) (Ranf et al., 2016). Do vi khuẩn trải qua quá trình đột biến với tốc độ nhanh, nên các thụ thể miễn dịch hữu ích về mặt tiến hóa được điều chỉnh để phát hiện các vùng được bảo tồn cao của các thành phần vi sinh vật quan trọng mà không thể dễ dàng loại bỏ hoặc biến đổi do chi phí thích ứng nghiêm trọng. Ví dụ, Flagellin của vi khuẩn là một yếu tố quan trọng trong sinh lý học của nhiều vi khuẩn bao gồm cả mầm bệnh và hiện là một trong những MAMP được nghiên cứu tốt nhất (Felix và cộng sự, 1999; Zipfel và cộng sự, 2004). Sự nhận thức về Flagellin, hoặc epitope tổng hợp flg22 (bao gồm 22 axit amin được bảo tồn cao ở đầu N của khối xây dựng roi, Flagellin), bởi cảm biến Flagellin thụ thể miễn dịch thực vật cùng nguồn gốc 2 (FLS2), dẫn đến một sự thay đổi phiên mã lớn , tiếp theo là phản ứng miễn dịch hiệu quả ngăn chặn nhiễm trùng (Chinchilla và cộng sự, 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Nhiều MAMP đã biết có liên quan đến thành tế bào của vi khuẩn. Ví dụ, chitin nấm (Fesel & Zuccaro, 2016), peptidoglycan vi khuẩn (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), lipopolysaccharides vi khuẩn (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al. ., 2005), Flagellin (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix và cộng sự, 1999), v.v. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ ràng làm thế nào các thành phần liên quan đến thành tế bào này tương tác với các thụ thể miễn dịch nhận thức của chúng ở thực vật. Liệu điều này xảy ra do tế bào chết và/hoặc sự suy thoái của thành tế bào hay thông qua việc giải phóng tích cực các thành phần như roi, vẫn là một chủ đề cần được nghiên cứu thêm (Bahar, 2020).

Một ví dụ về sự giải phóng tích cực các mảnh vách tế bào của vi khuẩn gram âm là sự tách rời các túi ngoại bào (EV) chảy máu và tách ra khỏi màng ngoài vào môi trường xung quanh (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018 ). Những EV vi khuẩn này thường được gọi là túi màng ngoài (OMV) và từ đó chúng tôi sẽ tuân theo danh pháp này (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Quá trình giải phóng OMV xảy ra liên tục và trong các điều kiện môi trường khác nhau, kể cả trong quá trình xâm chiếm vật chủ (Gurung và cộng sự, 2011; Ionescu và cộng sự, 2014; Jin và cộng sự, 2011). Ngoài các phân tử màng ngoài không thể thiếu như protein màng ngoài (OM), LPS và lipid, OMV còn đóng gói chất lỏng ngoại chất, bao gồm một loạt các phân tử như protein, enzyme phân hủy thành tế bào, polysacarit và axit nucleic (Kuehn & Kesty, 2005). Vì OMV được giải phóng trong quá trình xâm chiếm vật chủ và vì hàng hóa của chúng bao gồm MAMP, nên thật hấp dẫn khi suy đoán rằng chúng đóng vai trò là vật mang chất kích thích miễn dịch cung cấp các phân tử kích thích ở gần các thụ thể miễn dịch cùng nguồn gốc của chúng (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Thật vậy, OMV đã được chứng minh là có tác dụng tạo ra hệ thống miễn dịch của cả động vật có vú và thực vật khi tiếp xúc với vật chủ của chúng (Bahar và cộng sự, 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda và cộng sự, 2021; McMillan và cộng sự, 2021). Trong khi ở tế bào động vật có vú, cả thành phần LPS và protein của OMV đều hoạt động như chất kích thích miễn dịch (Ellis và cộng sự, 2010), thì ở thực vật, vẫn chưa rõ phân tử OMV nào là chất kích thích miễn dịch chính.

Ngoài việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch của vật chủ, OMV còn được chứng minh là mang các yếu tố độc lực và tham gia vào vô số quá trình. Điều này bao gồm giao tiếp giữa tế bào và tế bào (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), đưa chất độc đến các tế bào đích (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), hình thành màng sinh học (Đi học) & Beveridge, 2006), dập tắt các hợp chất kháng khuẩn (Manning & Kuehn, 2011), phản ứng với stress (MacDonald & Kuehn, 2013), chuyển gen ngang (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) và độc lực (Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann và cộng sự, 2015). Trong khi hầu hết các ví dụ này đến từ các nghiên cứu về mầm bệnh vi khuẩn ở động vật có vú, các nghiên cứu gần đây với vi khuẩn gây bệnh thực vật cũng ủng hộ rằng OMV thúc đẩy độc lực của vi khuẩn và sự xâm chiếm thực vật. Ionescu và cộng sự. (Ionescu và cộng sự, 2014) đã chỉ ra rằng việc sản xuất OMV bởi mầm bệnh thực vật Xylella fastidiosa trong quá trình xâm chiếm mạch xylem sẽ ức chế sự gắn kết của vi khuẩn với các yếu tố dẫn nước của thực vật (xylem), làm nghiêng sự cân bằng giữa dạng không cuống và dạng di động của dạng này. mầm bệnh chuyển sang dạng di động. Hình thức này được cho là thúc đẩy sự phân tán tế bào trong xylem, dẫn đến cây suy giảm nhanh hơn (Ionescu et al., 2014). Hai nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng các yếu tố độc lực như lipase/esterase và xylanase do loại II tiết ra, và các tác nhân được tiết ra loại III, được tiết ra cùng với OMV (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu và cộng sự, 2008; Solé và cộng sự ., 2015) cho thấy OMV có thể có vai trò quan trọng trong độc lực của vi khuẩn. Sự phức tạp về mặt phân tử của OMV, cùng với các chức năng kép và có thể đối lập của nó trong vật chủ (tạo ra khả năng miễn dịch và thúc đẩy độc lực), thúc đẩy chúng tôi nghiên cứu phản ứng phiên mã rộng hơn của cây Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) đối với thách thức OMV và kiểm tra xem liệu sự thay đổi phiên mã này có xảy ra hay không. sẽ gây ra tình trạng kháng thuốc hoặc nhạy cảm với nhiễm trùng vi khuẩn tiếp theo.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu thực vật và điều kiện sinh trưởng

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) dòng Col-0 hoang dã cũng như các dòng đột biến sau: bak- (Schlesinger et al., 2011) và falls ever (Nekrasov et al., 2009) đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Hạt Arabidopsis được khử trùng bề mặt và gieo trên đĩa thạch Murashige và Skoog (MS) như mô tả (Bahar et al., 2016). Các đĩa được giữ ở nơi tối ở nhiệt độ 4◦C trong 2–4 ngày và sau đó chuyển đến 22◦C để nảy mầm trong 5–8 ngày. Cây con đã nảy mầm có kích thước tương tự được chuyển vào 24-đĩa giếng (mỗi giếng hai cây con) chứa 1 ml môi trường MS với 1% (w:v) sucrose (Duchefa Biochemie) và được trồng thêm 8–10 ngày nữa ở các điều kiện tương tự trước khi thử thách với chất kích thích như được mô tả dưới đây. Đối với các thử nghiệm mồi, hạt của dòng Col{17}} hoang dã Arabidopsis và các dòng đột biến (rơi liên tục và ngược-) được nảy mầm như mô tả ở trên và sau đó được cấy vào chậu 7 × 7 × 6 cm (1 cây con/chậu) chứa hỗn hợp đất Green #7611 (Evenari, Ashdod, Israel) và phát triển ở chu kỳ quang học 9,5 giờ ở 22–24˚C. Thực vật đã

2.2 Làm sạch túi màng ngoài vi khuẩn

Dự trữ glycerol của Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 được ria trên đĩa Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson, and Company) và phát triển trong 2-5 ngày ở 28˚C. Các khuẩn lạc đơn lẻ được thu thập và sử dụng để cấy vào môi trường ban đầu 3-mL YEB (nước chiết xuất từ ​​nấm men) có chứa 10 ephalexin hydrat (Cp, Sigma-Aldrich). Starter được nuôi qua đêm ở 28◦C với tốc độ lắc 185–200 vòng/phút và sau đó được sử dụng để cấy 500 ml môi trường PSB (nước canh peptone sucrose) với kháng sinh (như mô tả ở trên) trong Bình 2-L với tỷ lệ ∼1:1000 (v:v). Các mẫu cấy được nuôi cấy như mô tả ở trên đến OD600 là 0,6–0,8 và sau đó các tế bào vi khuẩn được tách ra và OMV được chiết xuất từ ​​​​phần nổi phía trên như mô tả (Mordukhovich & Bahar, 2017). Việc chuẩn bị OMV thô sau đó được tiến hành ly tâm gradient Optiprep để thu được OMV tinh khiết, như mô tả (Bahar và cộng sự, 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Mỗi lô OMV được tinh chế từ 1.{23}}L nuôi cấy vi khuẩn và cuối cùng được tạo huyền phù lại trong 1 ml PBS (pH 7,3). OMV tinh khiết được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ 4◦C tối đa 7 ngày trước khi sử dụng. Sự phân bố kích thước của OMV được đo bằng thiết bị tán xạ ánh sáng động (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) và có đường kính trung bình là 121,7 ± 55,43nm (SD). Nồng độ hạt được đo tương tự và được cung cấp trong mỗi mô tả thí nghiệm bên dưới.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

2.3 Thử thách cây giống Arabidopsis bằng OMV

Để kiểm tra phản ứng phiên mã của cây Arabidopsis đối với thử thách OMV, người ta đã sử dụng cây con Col-0 trồng trong các đĩa giếng 24-như mô tả ở trên. Một ngày trước thử thách OMV, môi trường MS được lấy ra khỏi các đĩa và thay thế bằng 250 ul dH2O vô trùng, và các đĩa được để trên băng ghế qua đêm. Sáng hôm sau, 20 ul OMV tinh khiết (30 ug mỗi ml tương ứng với 1,44 × 109 hạt mỗi giếng), hoặc dH2O vô trùng làm mẫu, được thêm vào từng giếng. Cây con được thu thập 2, 6 và 24 giờ sau thử thách, thấm khô trên giấy và đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng trong ống 2-mL Eppendorf Safe-Lock (Hamburg, Đức). Tại mỗi thời điểm, bốn giếng được xử lý bằng OMV và bốn giếng được xử lý giả đã được thu thập, đại diện cho bốn lần sao chép sinh học cho mỗi lần xử lý tại mỗi thời điểm.

2.4 Tinh chế RNA

RNA được chiết xuất từ ​​cây giống Arabidopsis bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được tinh chế thêm bằng cách sử dụng Bộ công cụ không chứa DNA Turbo (Ambion, Thermo Fisher Scientific) và Bộ làm sạch và cô đặc RNA (Norgen Biotek) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu RNA tinh khiết được phân tích nồng độ và chất lượng bằng máy TapeStation 2200 (Công nghệ Agilent), Băng màn hình RNA và Màn hình RNA

2.5 Xây dựng và giải trình tự thư viện RNA

Đối với mỗi lần xử lý và thời điểm, hai mẫu có độ tinh khiết cao nhất được chọn để phân tích. Các thư viện TruSeq mRNA (Illumina) với khả năng thu thập PolyA đã được chuẩn bị từ các mẫu RNA được chọn tại Viện Genomics Crown tại Viện Khoa học Weizmann (Rehovot, Israel). Mỗi mẫu được gắn thẻ và một nhóm được chuẩn bị từ các mẫu đó. Sau đó, nhóm này được tải bên trong hai làn NGS và chạy trong máy giải trình tự Illumina HiSeq, ở chế độ chạy đầu ra cao, đọc một lần (SR) 60 (v4).

2.6 Trình tự đọc quá trình xử lý ban đầu

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Bản thể gen và mô tả gen 

Bản thể gen (GO) đã được truy xuất bằng cách sử dụng Chú thích GO của TAIR (//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Các mô tả gen, theo các mô hình gen, có được bằng cách sử dụng tìm kiếm mô tả gen của TAIR (//www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). Làm giàu GO được tính toán bằng công cụ web AgriGO (//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) bằng cách sử dụng locus gen Arabidopsis (TAIR10) làm tài liệu tham khảo

2.8 Xác nhận định lượng-PCR và RNA-seq

Để xác thực dữ liệu RNA-seq, các mẫu RNA của cây giống thử thách và OMV đã được sử dụng để tổng hợp cDNA, sau đó là PCR định lượng (qPCR) bằng cách sử dụng các đoạn mồi dành riêng cho gen (Bảng bổ trợ S4), như được mô tả (Bahar et al. , 2016). Nhìn chung, 17 DEG từ bộ dữ liệu RNA-seq đã được thử nghiệm, sử dụng bốn bản sao sinh học RNA của cây con được xử lý bằng OMV hoặc mô hình. Biểu hiện tương đối của các gen được kiểm tra được so sánh với biểu hiện ubiquitin, sử dụng máy PCR thời gian thực nhanh 7500 (Hệ sinh học ứng dụng), như đã mô tả (Bahar et al., 2016).

2.9 So sánh phản ứng phiên mã của Arabidopsis với MAMP và OMV 

Tập dữ liệu do OMV tạo ra của chúng tôi được so sánh với các bản phiên mã có sẵn của cây Arabidopsis được thử thách với flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al. , 2017) và LPS (Livaja và cộng sự, 2008). Để so sánh dữ liệu, việc làm giàu thuật ngữ GO đã được thực hiện và các GO cảm ứng được hiển thị bằng sơ đồ Venn như mô tả ở trên.

2.10 Thí nghiệm mồi cây Arabidopsis

Để kiểm tra tác dụng mồi của Xcc OMV trên cây Arabidopsis bị nhiễm Pseudomonas syringae pv. cà chua DC3000 (Pst), chúng tôi đã làm theo quy trình được mô tả bởi Zipfel et al. (2004). Tóm lại, lá của cây Arabidopsis 6–8 tuần tuổi, được trồng như mô tả ở trên, được thấm 50–100 ul Xcc OMV tinh khiết (30 ug/ml, tương ứng với 3.6-7.2 × 109 hạt mỗi lá), 1 μM flg22 hoặc nước bằng ống tiêm không có kim. Đối với mỗi lần xử lý, sử dụng 5 lá/cây và ba cây lặp lại. Chất cấy Pst được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa môi trường King's B (20 g/L peptone, 1,5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L glycerol và 15 g/L agar) ở 28˚C trong 2–3 ngày, sau đó hòa lại khuẩn lạc bằng nước và điều chỉnh nồng độ chất cấy đến 105 CFU/ml. Chất cấy Pst được thấm vào các lá đã được sơn lót 24 giờ sau khi mồi, sử dụng ống tiêm không có kim (khoảng 100 ul được thấm vào mỗi lá). Sự phát triển của vi khuẩn được xác định ở thời điểm 0 (1 giờ sau khi cấy) và 2 ngày sau khi cấy (dpi) bằng cách thu thập và cân các lá đã được cấy, ngâm chúng trong 1 ml MgCl2 10 mM và đổ các dung dịch pha loãng nối tiếp gấp 10- lên King's Đĩa thạch B. Số lượng CFU trên mỗi đĩa được xác định 2 ngày sau đó và tính trên g lá.

HÌNH 1 Phản ứng phiên mã của Arabidopsis đối với OMV ở thời điểm 2, 6 và 24 sau thử thách. Phân tích thành phần chính (A) và ma trận tương quan mẫu (B) của phản ứng phiên mã của cây Arabidopsis với OMV, hoặc mô phỏng, vào lúc 2, 6 và 24 giờ sau thử thách

2.11 Xét nghiệm phát triển vi khuẩn in vitro 

Để đánh giá hiệu quả của Xcc OMV tinh khiết đối với sự phát triển của Pst trong ống nghiệm, Pststarter được nuôi cấy trong môi trường lỏng King's B trong 24 giờ ở 28˚C và sau đó được sử dụng để cấy vào ba môi trường nuôi cấy khác nhau chứa 12 ml môi trường King's B mỗi môi trường, trong {{3 }}mL ống Falcon với tỷ lệ 1:100. Nuôi cấy vi khuẩn đã được cải tiến bằng 30 OMV ug/ml (1:50 hoặc 1:100, tương ứng với 1,44 × 109 hoặc 7,2 × 108 hạt trên mỗi ml tương ứng), hoặc PBS làm đối chứng và ủ trong 20 giờ ở 28˚C. Sự tăng trưởng của vi khuẩn được đo bằng máy đo quang phổ (Amersham Bioscatics) ở mật độ quang (OD) là 600nm trong 22 giờ.

3. KẾT QUẢ

3.1 Phân tích RNA-seq cho thấy một tập hợp lớn các gen Arabidopsis được biểu hiện khác nhau để đáp ứng với thách thức OMV

Để nghiên cứu sự thay đổi phiên mã ở cây Arabidopsis sau thử thách OMV, chúng tôi đã xử lý cây giống cây Arabidopsis bằng OMV được tinh chế từ mầm bệnh vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) và thu thập RNA thực vật vào lúc 2, 6 và 24 giờ sau thử thách (hpc). RNA từ các mẫu được xử lý bằng OMV và mẫu sau đó được giải trình tự và phân tích như mô tả trong Vật liệu và Phương pháp. Mối tương quan chính (Hình 1A) và phân tích ma trận tương quan mẫu (Hình 1B) cho thấy các lần sao chép sinh học trong mỗi cụm xử lý gần nhau, một dấu hiệu cho thấy sự tương đồng về phản ứng phiên mã tổng thể giữa các lần sao chép sinh học. Các mẫu được xử lý OMV ở cụm 2 và 6 hpc cùng nhau, cho thấy rằng việc xử lý OMV có tác động lớn hơn đến phản ứng phiên mã so với thời gian lấy mẫu (Hình 1B). Mặt khác, các mẫu được xử lý bằng OMV tập hợp lại với phương pháp xử lý mô phỏng tương ứng ở mức 24 hpc, cho thấy rằng sự thay đổi phiên mã do OMV gây ra tại thời điểm này đã giảm và tương tự như ở các cây được xử lý mô phỏng.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Tại mỗi thời điểm được kiểm tra, cây con được xử lý bằng OMV được so sánh với cây con được xử lý mô phỏng và các gen biểu hiện khác nhau (DEG) được chiết xuất. Tại tất cả các thời điểm gộp lại, tổng số 984 và 175 gen được phát hiện là có ý nghĩa đáng kể (Nhật ký thay đổi lần > 1 hoặc ← 1, giá trị p và FDR < 0.05) được điều chỉnh tăng hoặc giảm tương ứng, để đối phó với thách thức OMV (Hình 2A; Bảng bổ sung S1). Biểu hiện gen Nhật ký thay đổi lần (LogFC) dao động từ mức tối đa là 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), tương ứng với 500-thay đổi lần gấp, đến -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). Số lượng DEG cao nhất được tìm thấy ở 2 và 6 hpc, trong đó tổng số 647 và 876 DEG tương ứng đã được xác định (kết hợp tăng và giảm quy định). Ở 24 hpc, 121 DEG đã được tìm thấy. Hơn 50% số gen được điều chỉnh tăng vào lúc 2 và 6 giờ sau thử thách OMV đã được chia sẻ giữa chúng (Hình 2B). Để kiểm tra sự thay đổi biểu hiện gen theo thời gian, chúng tôi đã trích xuất tất cả các DEG được điều chỉnh tăng được tìm thấy ở mọi thời điểm (37 gen) và so sánh sự thay đổi lần lượt của chúng theo thời gian (Hình 2C). Biểu hiện thay đổi nếp gấp của các gen này khác nhau đáng kể giữa các thời điểm khác nhau (ANOVA một chiều; F2,108=8.1633, p=0.0005). Một so sánh hậu kiểm bằng bài kiểm tra Tukey Kramer HSD đã chỉ ra rằng LogFC ở cả 2 (M=3.45, SD=1.72) và 6 hpc (M=3.87, SD=1.98) cao hơn đáng kể so với 24 mã lực (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 và p=0 0,0005 tương ứng) (Hình 2D). Mặc dù biểu thức LogFC trung bình ở mức 6 hpc cao hơn ở mức 2 hpc nhưng nó không khác biệt về mặt thống kê (p=0.5413). Do đó, khi xem xét số lượng DEG và gen LogFC tổng thể tại ba thời điểm được thử nghiệm, chúng tôi có thể kết luận rằng sự thay đổi phiên mã đáng kể nhất xảy ra vào lúc 2 và 6 giờ sau thử thách OMV. Để kiểm tra tính hợp lệ của các kết quả RNA-seq, sự biểu hiện của 17 gen điều hòa tăng được xác định bằng phương pháp PCR định lượng (qPCR) với các đoạn mồi cụ thể. Mười bốn gen được kiểm tra hiển thị kiểu mẫu giống như trong phân tích RNA-seq và được điều chỉnh tăng đáng kể so với mô hình. Ba trong số các gen được kiểm tra có biểu hiện tương đối cao hơn nhưng không khác biệt đáng kể so với mô hình bằng phương pháp này (Hình bổ sung S1).

HÌNH 2 Arabidopsis biểu hiện các gen khác nhau để đáp ứng với thách thức OMV. (A) Tổng số gen biểu hiện khác nhau (DEG) (điều chỉnh tăng hoặc giảm, LogFC > 1 hoặc ← 1, giá trị p và FDR < 0.05) tại 2, 6 và 24 giờ sau thử thách. (B) Sự chồng chéo giữa các DEG tại các thời điểm khác nhau (trái, điều chỉnh lên; phải, điều chỉnh xuống). (C) Các gen được điều chỉnh tăng được tìm thấy ở tất cả các điểm ba thời gian được vẽ trên biểu đồ biểu hiện LogFC, hiển thị biểu hiện gen theo thời gian. (D) LogFC trung bình của tất cả các DEG tại các thời điểm khác nhau. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt thống kê ở p < 0,05 theo bài kiểm tra Tukey-Kramer HSD

3.2 Arabidopsis phản ứng với OMV bằng sự thay đổi phiên mã theo hướng kích hoạt hệ thống miễn dịch

Để xác định các con đường của cây Arabidopsis bị ảnh hưởng đáng kể bởi thách thức OMV, chúng tôi đã sử dụng công cụ web AgriGO (Du và cộng sự, 2010; Tian và cộng sự, 2017). Chúng tôi đã xác định lần lượt 333 và 55 thuật ngữ bản thể gen (GO) được điều chỉnh tăng và giảm đáng kể (FDR <0, 05), tại mọi thời điểm được kết hợp để đáp ứng với thách thức OMV. Gần 25% GO được điều chỉnh tăng có liên quan đến phản ứng của thực vật với kích thích (Hình 3A). Trong danh mục 'phản ứng với kích thích', thuật ngữ GO chiếm ưu thế nhất có liên quan đến phản ứng căng thẳng, kích thích sinh học, hóa chất và kích thích nội sinh (Hình 3B; Bảng bổ sung S2). Công cụ AgriGO cũng xác định 103 chức năng phân tử được điều chỉnh tăng đáng kể bao gồm 'hoạt động transferase', hoạt động kinase', 'hoạt động của yếu tố phiên mã', 'liên kết ion và ion kim loại', 'liên kết carbohydrate', 'liên kết protein', 'hoạt động xúc tác' , 'Liên kết nucleotide Adenyl', 'hoạt động của thụ thể xuyên màng' và nhiều chức năng liên kết khác (Bảng bổ sung S2). Vị trí tế bào của các thuật ngữ quan trọng nằm ở các ngăn khác nhau của tế bào bao gồm nhân, không bào và hệ thống nội màng, nhưng đáng chú ý nhất là liên quan đến ngoại vi tế bào và bao gồm 'màng sinh chất', 'vùng ngoại bào', 'thành tế bào' và bản thể luận 'apoplast' (Bảng bổ sung S2). Mặt khác, các GO được điều chỉnh giảm đáng kể bao gồm các thuật ngữ 'quá trình trao đổi chất và dị hóa độc tố', 'phản ứng với tình trạng thiếu nước và thiếu nước', 'vận chuyển và nội địa hóa lipid' và các thuật ngữ khác (Bảng bổ trợ S2). GO liên quan đến phản ứng với kích thích sinh học không được làm phong phú trong các gen bị điều hòa xuống. Các chức năng phân tử được điều chỉnh giảm đáng kể bao gồm nhiều thuật ngữ oxy hóa khử như 'hoạt động oxyoreductase', 'liên kết heme', 'liên kết ion sắt', 'liên kết lipid', 'liên kết oxy' và nhiều chức năng liên quan đến oxy hơn (Bảng bổ trợ S2) . Các thuật ngữ được điều chỉnh xuống cũng nằm ở khu vực ngoại bào. Để xác định thuật ngữ GO nào DEG có biểu thức cao nhất thuộc về, chúng tôi đã lọc danh sách DEG ban đầu bằng cách chọn các gen có LogFC cao hơn 4 hoặc nhỏ hơn -4 (tương ứng với chênh lệch gấp 16-) . Chúng tôi đã xác định được 117 gen đáp ứng các tiêu chí này, trong đó có 115 gen được điều chỉnh tăng và 2 gen bị điều hòa xuống ở mọi thời điểm cộng lại. Do số lượng gen bị điều hòa giảm có LogFC nhỏ hơn -4 nên không xác định được GO bị ức chế đáng kể. Mặt khác, 72 GO được điều chỉnh tăng đáng kể đã được xác định, trong đó những GO quan trọng nhất có liên quan đến 'phản ứng với kích thích sinh học bên ngoài', 'phản ứng với các sinh vật khác', 'phản ứng của tế bào với nồng độ oxy', 'phản ứng phòng thủ' , 'phản ứng với căng thẳng' và nhiều GO liên quan đến miễn dịch hơn (Hình 3C).

HÌNH 3 Các thuật ngữ bản thể gen Arabidopsis (GO) được làm phong phú để đáp ứng thách thức Xcc OMV. Biểu diễn biểu đồ hình tròn về phân phối danh mục trong các điều khoản Quy trình sinh học (A) và Phản ứng với kích thích (B) GO được điều chỉnh tăng. (C) Danh sách các gen Arabidopsis có LogFC > 4 để đáp ứng với thách thức OMV. Các gen được lọc từ bộ dữ liệu DEG hoàn chỉnh và được sử dụng để xác định các thuật ngữ GO phong phú bằng cách sử dụng công cụ web AgriGo. Điểm cắt FDR < 0.05

3.2 Thử thách OMV dẫn đến tăng cường điều chỉnh các thụ thể miễn dịch

Cảm biến MAMP và phản ứng của thực vật đối với MAMP phần lớn được điều hòa bởi các PRR gắn màng giúp điều hòa nhận thức về mầm bệnh và giảm thiểu sự lây nhiễm một cách hiệu quả. PRR thường được phân loại thành hai nhóm kinase thụ thể (RK) và protein giống thụ thể (RLP) (Boutrot & Zipfel, 2017). Để xác định các PRR được biểu hiện khác biệt khi phản ứng với OMV, chúng tôi đã so sánh bộ DEG của chúng tôi với danh sách Arabidopsis RK đã được thiết lập trước đó (Kemmerling và cộng sự, 2011; Mott và cộng sự, 2016) và RLP (Wang và cộng sự, 2008). Chúng tôi đã xác định trong tập dữ liệu của mình lần lượt là 33 và 10 RK và RLP được điều chỉnh tăng tại mọi thời điểm cộng lại (Bảng 1). Không có RK hoặc RLP nào được tìm thấy trong danh sách 175 gen bị điều hòa giảm của chúng tôi. Kemmerling và cộng sự. (2011) đã xác định danh sách 49 RK có biểu hiện được gây ra đáng kể bởi các MAMP như flg22 và NLP (hoại tử và peptide tạo ra ethylene 1-như protein) hoặc xử lý mầm bệnh. Chúng tôi so sánh danh sách này với các RLK được điều chỉnh tăng từ thử nghiệm của chúng tôi và nhận thấy rằng 45% RK được xác định bởi Kemmerling et al. (2011) cũng được tạo ra để đáp ứng với OMV. Trong số đó, đáng chú ý là FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR và IOS1 (Bảng 1). Trong nhóm RK, FRK1 có biểu hiện cao nhất ở cả 2 và 6 hpc với LogFC lần lượt là 7,11 và 5,2, trong khi LogFC trung bình của tất cả các RK lần lượt là 2,11 và 2,13 ở 2 và 6 hpc. Trong khi các RK và RLP gắn màng chủ yếu làm trung gian cảm nhận ngoại bào của các vi khuẩn xâm nhập, thì các thụ thể lặp lại giàu leucine (LRR) (NLR) gắn với nucleotide, là các thụ thể miễn dịch nội bào. Chúng tôi đã tìm thấy 7 gen NLR khác nhau được điều chỉnh tăng để đáp ứng với thách thức OMV ở mức 2 và 6 hpc, không tìm thấy gen nào ở 24 hpc (danh sách NLR được trích xuất từ ​​TAIR, 102 gen) (Bảng 1).

lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch

3.3 OMV tạo ra sự biểu hiện của nhiều yếu tố phiên mã WRKY

Các yếu tố phiên mã WRKY (TF) đã được phát hiện có vai trò trong các phản ứng miễn dịch ở thực vật, tham gia vào cả phản ứng miễn dịch do MAMP kích hoạt (MTI) và miễn dịch do tác nhân kích hoạt (ETI) (Birkenbihl và cộng sự, 2018; Rushton và cộng sự, 2010). ). Thử thách OMV đã dẫn đến việc điều chỉnh tăng 20 TF WRKY khác nhau (danh sách được trích từ TAIR, 70 gen) chỉ ở 2 và 6 HPC (Bảng 1). TF WRKY không có trong bộ gen được điều chỉnh giảm của chúng tôi. Một họ TF khác bị ảnh hưởng bởi thách thức OMV là các protein chứa miền MYB (Tsuda & Somssich, 2015), được biết là có liên quan đến nhiều quá trình bao gồm các căng thẳng sinh học và phi sinh học (Ambawat và cộng sự, 2013). Nhìn chung, 9 TF MYB khác nhau (danh sách được trích từ TAIR, 211 gen) được biểu hiện khác nhau để đáp ứng với thách thức OMV, 5 điều chỉnh tăng và 4 điều chỉnh giảm (Bảng 1). Các lớp TF được biểu thị khác biệt đã được phát hiện được liệt kê trong Bảng 1.

3.4 So sánh phản ứng phiên mã của Arabidopsis với OMV với phản ứng với MAMP đã được tinh chế

Để tìm hiểu về sự khác biệt trong phản ứng của Arabidopsis với chất kích thích tinh khiết so với cấu trúc thô và phức tạp về mặt phân tử – OMV, chúng tôi đã so sánh dữ liệu RNA-seq của chúng tôi với dữ liệu phiên mã hiện có về phản ứng của Arabidopsis với các MAMP đã biết bao gồm flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel và cộng sự, 2006), PGN (Willmann và cộng sự, 2011), OGs (Davidsson và cộng sự, 2017) và LPS (Livaja và cộng sự, 2008). Các GO được làm giàu được trích xuất từ ​​các bộ dữ liệu nêu trên như được mô tả ở trên (Bảng bổ trợ S3) và được so sánh với các GO được làm giàu sau thử thách OMV. Nhìn chung, các thuật ngữ Arabidopsis GO do OMV tạo ra tương tự như các thuật ngữ do MAMP đơn, có protein và không có protein tạo ra, chia sẻ 56, 51 và 47% GO do OMV tạo ra với GO do flg22, elf26 và PGN tạo ra, tương ứng. Mặt khác, người ta thấy có sự trùng lặp thấp hơn trong các GO cảm ứng với LPS và OG, chia sẻ lần lượt 24 và 33% với GO do OMV tạo ra (Hình 4A). Đáng chú ý là gen 1 (PR1) liên quan đến sinh bệnh học (At2g14610), một dấu hiệu đặc trưng của phản ứng miễn dịch do LPS gây ra (Silipo và cộng sự, 2005, 2008), đều không có trong danh sách gen do OMV gây ra ở mọi thời điểm được thử nghiệm. Bốn mươi mốt GO được phát hiện là do OMV tạo ra chứ không phải do bất kỳ MAMP nào khác được thử nghiệm ở đây (Hình 4B). Danh sách này bao gồm các GO liên quan đến 'apoptosis', 'phản ứng với thuốc', 'vận chuyển thuốc và 'vận chuyển nhiều loại thuốc' và 'hoạt động lipase' (Bảng bổ sung S3, được biểu thị bằng dấu hoa thị và phông chữ đậm).

3.5 OMV gây ra khả năng kháng vi khuẩn của cây Arabidopsis

Ở đây và trước đó (Bahar và cộng sự, 2{26}}16), chúng tôi đã cung cấp bằng chứng chứng minh rằng hệ thống miễn dịch của cây Arabidopsis được tạo ra bởi thử thách OMV. Để kiểm tra xem liệu cảm ứng miễn dịch qua trung gian OMV này có được chuyển thành phản ứng miễn dịch hiệu quả hay không, chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm phát triển của vi khuẩn planta (Zipfel và cộng sự, 2004), trong đó cây Arabidopsis được xử lý trước bằng OMV sau đó là cấy vi khuẩn. Giảm đáng kể hơn 10-gấp ở Pseudomonas syringae pv. cà chua DC3000 (Pst) CFU/g lá đã được quan sát thấy ở cả cây được xử lý trước OMV- và flg22- so với xử lý trước giả, hai ngày sau khi tiêm chủng (Hình 5A). Sự tăng trưởng in vitro của Pst không bị ảnh hưởng tiêu cực khi bổ sung OMV vào môi trường, cho thấy rằng sự giảm tăng trưởng Pst ở cây trồng có liên quan đến tác dụng mồi của OMV và không phải là tác động trực tiếp của OMV lên vi khuẩn (Hình bổ sung). S2). Để kiểm tra xem tính kháng Pst do OMV gây ra có qua trung gian FLS2, EFR hoặc BAK1 hay không, chúng tôi đã lặp lại thử nghiệm này với Col-0, bak-mutable và dòng đột biến kép rơi vào efr. Với cả hai dòng đột biến, xử lý trước OMV dẫn đến giảm đáng kể Pst CFU/g lá so với các cây được xử lý mô hình (Hình 5B-C). Đúng như dự đoán, các dòng đột biến fls efr và bak- được xử lý bằng flg22 có hiệu giá Pst tương tự như các cây không được xử lý vì chúng được biết là không phản ứng với flg22. Để so sánh mức giảm tương đối của hiệu giá mầm bệnh ở Col-0 so với các dòng đột biến thụ thể miễn dịch rơi rụng và khô ở các cây đã được mồi, chúng tôi đã tính toán sự khác biệt về hiệu giá Pst ở các cây được xử lý bằng OMV và mô phỏng trong ba thí nghiệm độc lập (Supp . Hình S3). Mức giảm trung bình về hiệu giá Pst ở các cây sau được xử lý trước OMV nhỏ hơn mức giảm được quan sát thấy ở các cây Col-0 (lần lượt là 0,89 so với 1,14 Log CFU/gr mức giảm lá đối với bak và Col-0, một- cách ANOVA;F2,4=4.3781, p=0.0523). Chúng tôi không thấy mức giảm tương tự với dòng đột biến fls efr (giảm 1,26 so với 1,32 Log CFU cho fls efr và Col-0, tương ứng, ANOVA một chiều: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Hình 5D-E).

BẢNG 1 RK/RLP do OMV gây ra và các yếu tố phiên mã liên quan đến miễn dịch ở cây giống Arabidopsis

BẢNG 1 (Tiếp theo)

BẢNG 1 (Tiếp theo)

4. THẢO LUẬN

Các túi màng ngoài của vi khuẩn (OMV) là các cấu trúc nano phức tạp có nguồn gốc từ màng ngoài của vi khuẩn và bao gồm hàng trăm protein và các thành phần thành tế bào khác. Trước đây người ta đã chứng minh rằng cây Arabidopsis phản ứng với thách thức OMV bằng cách kích hoạt các phản ứng miễn dịch điển hình như bùng nổ ROS, biểu hiện gen đánh dấu miễn dịch và kiềm hóa môi trường (Bahar et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra phản ứng phiên mã rộng hơn của cây Arabidopsis đối với OMV của vi khuẩn và ảnh hưởng của nó đối với nhiễm trùng tiếp theo. Kết luận bao quát từ các phân tích dữ liệu RNA-seq được thực hiện trong nghiên cứu này là hệ thống miễn dịch của cây Arabidopsis được hình thành sau khi tiếp xúc với Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) OMV. Kết luận này được hỗ trợ bởi các phân tích riêng biệt và bổ sung. Đầu tiên, việc làm giàu bản thể gen (GO) ở thực vật tiếp xúc với Xcc OMV cho thấy rõ ràng rằng OMV được Arabidopsis coi là tác nhân gây căng thẳng. Vị trí tế bào của phản ứng của thực vật chủ yếu liên quan đến ngoại vi tế bào cho thấy nhận thức của tế bào bên ngoài về vật liệu thách thức, OMV. Điều này hỗ trợ thêm cho quan điểm cho rằng OMV và các thành phần của chúng được cảm nhận bởi các thụ thể ngoại bào, tương tự như nhiều MAMP đã biết. Thứ hai, chúng tôi nhận thấy một lượng lớn RK và RLP được điều chỉnh lại để đáp ứng thách thức OMV. Nhiều thụ thể trong số này được biết là có vai trò trung gian trong việc nhận biết mầm bệnh hoặc trước đây được chứng minh là có liên quan đến phản ứng miễn dịch của thực vật. FLG22-cảm ứng kinase giống thụ thể 1 (FRK1) là thụ thể được cảm ứng mạnh nhất. Điều này thật thú vị vì chúng tôi không thể phát hiện Flagellin trong phân tích protein Xcc OMV của chúng tôi (dữ liệu không được hiển thị). Người ta biết rằng FRK1 cũng được tạo ra bởi các chất kích thích miễn dịch khác, nhưng điều thú vị là tại sao biểu hiện của nó lại cao hơn nhiều so với các RK còn lại được điều chỉnh tăng ở đây. Mặt khác, biểu hiện thụ thể yếu tố kéo dài (EFR) chỉ được điều chỉnh tăng đáng kể ở thời điểm 2 giờ và có LogFC là 1,12, mặc dù EF-Tu được tìm thấy trong Xcc OMV (Bahar et al., 2016). ). Chúng tôi cũng tìm thấy một số gen NLR được điều chỉnh tăng để đáp ứng với thách thức OMV, một nửa trong số đó được chú thích là protein kháng bệnh, tuy nhiên chức năng của chúng trong khả năng miễn dịch thực vật vẫn chưa được mô tả. Mặc dù chúng tôi không đưa ra giả thuyết rằng NLR có liên quan trực tiếp đến nhận thức OMV, nhưng chúng có thể được tạo ra ở hạ lưu cảm biến RK/RLP của các phân tử OMV như cũng đã được quan sát thấy khi phản ứng với các MAMP tinh khiết như flg22, elf18 và LPS (Denoux và cộng sự, 2008). ; Livaja và cộng sự, 2008; Zipfel và cộng sự, 2006). Thứ ba, nhiều yếu tố phiên mã liên quan đến miễn dịch, WRKY, MYB và các yếu tố khác, đã được OMV điều chỉnh tăng đáng kể (Bjornson và cộng sự, 2021). Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự thay đổi phiên mã chính để đáp ứng với OMV xảy ra ở hai thời điểm đầu tiên (2 và 6 hpc). Điều này được minh họa bằng cả số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) lớn hơn đáng kể và thay đổi nếp gấp Log (LogFC) cao hơn đáng kể ở mức 2 và 6 hpc. Tuy nhiên, trong tổng số 121 DEG được tìm thấy ở tốc độ 24 hpc, gần một nửa (52) không được tìm thấy ở tốc độ 2 hoặc 6 hpc. Điều này cho thấy rằng một nửa số DEG ở 24 hpc là các gen được điều hòa muộn, có biểu hiện được điều chỉnh tăng hoặc giảm muộn hơn 6 hpc. Thật vậy, các gen Arabidopsis có động lực biểu hiện khác nhau sau các thử thách của chất kích thích đã được xác định trước đó (Bjornson và cộng sự, 2021).

HÌNH 4 So sánh các thuật ngữ bản thể gen (GO) được làm giàu để đáp ứng với OMV và với các MAMP đã được tinh chế đơn lẻ. Các bộ dữ liệu biểu hiện Arabidopsis để đáp ứng thách thức MAMP (elf26, flg22, OGs, PGN và LPS; xem phần Vật liệu và Phương pháp để tham khảo) đã được sử dụng để trích xuất các GO phong phú bằng công cụ web AgriGo. Các bộ GO phong phú của từng MAMP được so sánh với danh sách GO được làm phong phú để đáp ứng với OMV sử dụng Venny (A và Bảng bổ sung S3). Các thuật ngữ GO chỉ được làm giàu trong bộ dữ liệu OMV được hiển thị trong (B) được sắp xếp theo giá trị FDR của chúng.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự thay đổi phiên mã chính để đáp ứng với OMV xảy ra ở hai thời điểm đầu tiên (2 và 6 hpc). Điều này được minh họa bằng cả số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) lớn hơn đáng kể và sự thay đổi lần đăng nhập (LogFC) cao hơn đáng kể ở mức 2 và 6 hpc. Tuy nhiên, trong tổng số 121 DEG được tìm thấy ở tốc độ 24 hpc, gần một nửa (52) không được tìm thấy ở tốc độ 2 hoặc 6 hpc. Điều này cho thấy rằng một nửa số DEG ở 24 hpc là các gen được điều hòa muộn, có biểu hiện được điều chỉnh tăng hoặc giảm muộn hơn 6 hpc. Thật vậy, các gen Arabidopsis có động lực biểu hiện khác nhau theo sau các thử thách của chất kích thích đã được xác định trước đó (Bjornson và cộng sự, 2021). Kiểu biểu hiện gen nhanh chóng và chủ yếu là nhất thời mà chúng tôi thấy ở đây phù hợp với các nghiên cứu khác đã thử nghiệm phản ứng tạm thời của cây Arabidopsis đối với MAMP. Ví dụ, Denoux và cộng sự. (2008) và Bjornson và cộng sự. (2021) đã chỉ ra rằng sự thay đổi phiên mã ở cây Arabidopsis để phản ứng với các MAMP khác nhau xảy ra trong vòng vài phút đến vài giờ và trong hầu hết các trường hợp, DEG sẽ quay trở lại mức cơ bản ∼ trong vòng 24 giờ sau khi cây bị thử thách. Không giống như các tương tác giữa thực vật và mầm bệnh, trong đó tương tác diễn ra mạnh mẽ và liên tục khi được thử thách với mẫu không sống, chẳng hạn như MAMP tinh khiết hoặc với OMV - có thể dự đoán rằng phản ứng của thực vật, ít nhất là ở cấp độ phiên mã, sẽ nhất thời và không duy trì qua nhiều ngày. Nghiên cứu chuyên sâu trong ba thập kỷ qua đã tiết lộ nhiều thụ thể miễn dịch thực vật chịu trách nhiệm nhận biết vi khuẩn. Nhiều thụ thể trong số này có khả năng phát hiện các đặc điểm riêng lẻ của vi sinh vật và đang được nghiên cứu chi tiết để hiểu rõ hơn về nhận thức mầm bệnh, tín hiệu hệ thống miễn dịch và phản ứng của mô hình và cây trồng. Tuy nhiên, thực vật đồng thời tiếp xúc với nhiều đặc điểm của vi sinh vật từ các nguồn khác nhau, điều này làm tăng thêm sự phức tạp trong nhận thức và phản ứng miễn dịch. Chúng tôi quan tâm đến việc kiểm tra sự khác biệt trong phản ứng phiên mã của cây Arabidopsis với các MAMP tinh khiết đơn lẻ so với OMV, đại diện cho cấu trúc vi sinh vật tự nhiên và phức tạp hơn nhưng mức độ phức tạp đã được loại bỏ khỏi chính vi khuẩn. OMV mang các yếu tố độc lực, enzyme phân hủy, độc tố và các phân tử sinh học khác có thể có vai trò chức năng đối với sự phát triển của vi khuẩn ở thực vật, và do đó thật thú vị khi kiểm tra xem thử thách OMV có tạo ra GO duy nhất không được tạo ra bởi MAMP tổng hợp hay không.

HÌNH 5 Việc xử lý trước lá cây Arabidopsis bằng OMV sẽ tạo ra khả năng kháng lại sự lây nhiễm vi khuẩn sau đó. Thực vật Col-0 (A) đã được xử lý trước bằng OMV, nước (mô hình) hoặc flg22 làm đối chứng và 24 giờ sau đó được tiêm huyền phù 105 CFU/ml của Pst DC3000 bằng cách sử dụng phương pháp thấm qua ống tiêm không cần kim . Hiệu giá tế bào Pst DC3000 trong các lá được cấy được xác định 48 giờ sau khi cấy bằng các đĩa pha loãng nối tiếp. Cây Arabidopsis Col-0 và fls efr (B), hoặc bak (C) đã được thử nghiệm trong một thí nghiệm tương tự như được mô tả trong (A). Mức giảm trung bình của Log Pst DC3000 CFU/gr sau khi xử lý trước OMV (so với các cây chưa được xử lý) ở Col-0 và falls efr (D), Col-0 và ngược lại (E), được so sánh. Mỗi thanh biểu thị mức giảm trung bình Log Pst DC3000 CFU/gr từ ba thử nghiệm độc lập (dữ liệu của các thử nghiệm độc lập được trình bày trong Phụ lục. Hình S3). Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Giá trị t-test. p của học sinh hai đuôi được biểu thị phía trên các thanh biểu đồ). Các thí nghiệm A, B và C được tiến hành ít nhất ba lần với kết quả tương tự nhau (3 cây/lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm). Dấu hoa thị (**) biểu thị sự khác biệt đáng kể so với mô hình (kiểm tra của Dunnet p < 0,001)

Để so sánh phiên mã, chúng tôi đã tập hợp dữ liệu từ các nghiên cứu với điều kiện thí nghiệm tương tự, tức là ở thực vật và tại các thời điểm tương tự. Người ta thấy có sự trùng lặp đáng kể trong việc làm giàu GO trong phản ứng của cây Arabidopsis với OMV và với flg22, elf26 và PGN. Điều này không có gì bất ngờ vì người ta biết rằng nhiều con đường phòng vệ được kích hoạt khi cảm nhận mầm bệnh là tương tự nhau, bất kể chất kích thích cụ thể hay nguồn của nó (Bjornson và cộng sự, 2021; Zipfel và cộng sự, 2006). Tuy nhiên, một số GO duy nhất được phát hiện là được điều chỉnh bởi OMV chứ không phải bởi các MAMP khác mà chúng tôi đã khảo sát. Trong số này có các GO liên quan đến sự thoái hóa thành tế bào như 'hoạt động lipase' và 'hoạt động hydrolase tác động lên các liên kết glycosyl', điều này có thể chỉ ra rằng hệ thống phòng vệ thực vật đang nhắm mục tiêu thoái hóa OMV. Điều thú vị là ba GO liên quan đến vận chuyển ma túy cũng được phát hiện là được điều chỉnh duy nhất bởi thử thách OMV. Điều này có thể chỉ ra rằng thực vật đang phải đối mặt với việc các hợp chất độc hại được đưa vào tế bào của chúng, có lẽ bằng cách vận chuyển qua trung gian OMV. Không giống như phản ứng của Arabidopsis đối với các peptide kích thích miễn dịch và PGN, chúng tôi quan sát thấy có sự trùng lặp tương đối ít giữa phản ứng của Arabidopsis với OMV OG và LPS. Sự trùng lặp nhỏ này, đặc biệt là với LPS, có phần đáng ngạc nhiên, vì trong tế bào động vật có vú, LPS được thừa nhận là tác nhân đóng góp mạnh mẽ vào phản ứng miễn dịch của vật chủ do OMV gây ra (Ellis và cộng sự, 2010). Hơn nữa, thực tế là chúng tôi không thể tìm thấy sự điều hòa của dấu ấn miễn dịch LPS PR1 (Silipo và cộng sự, 2005), có thể gợi ý rằng LPS không phải là tác nhân chính gây ra tương tác miễn dịch thực vật với OMV của vi khuẩn. Tuy nhiên, điều này vẫn cần được xem xét kỹ lưỡng hơn. OMV đã được chứng minh là góp phần vào sự xâm chiếm của vi khuẩn đối với cả động vật có vú và vật chủ thực vật và trong một số trường hợp là độc lực của vi khuẩn. Mặt khác, OMV kích hoạt hệ thống miễn dịch của vật chủ, do đó hoạt động như một con dao hai lưỡi, một mặt thúc đẩy sự sống sót và độc lực của vi khuẩn, đồng thời cung cấp năng lượng cho hệ thống giám sát vật chủ và mặt khác kích hoạt khả năng miễn dịch của vật chủ (McMillan & Kuehn, 2021 ). Các thử nghiệm mồi của chúng tôi cho thấy thử thách OMV đã dẫn đến sự ức chế đáng kể Pseudomonas syringae pv. cà chua DC3000 (Pst) tăng trưởng ở cây trồng, tương tự như hiệu ứng mồi được thấy với MAMP tổng hợp (Jung và cộng sự, 2009). Do đó, trong trường hợp này, việc sử dụng trước OMV vào mô được tiêm chủng không thúc đẩy sự xâm nhập của vi khuẩn mà giúp cây tạo ra phản ứng miễn dịch hiệu quả nhằm ức chế sự phát triển của mầm bệnh. Kết quả này phù hợp với dữ liệu phiên mã của chúng tôi và với nghiên cứu trước đây của chúng tôi, ủng hộ quan điểm rằng OMV tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và hiệu quả ở cây Arabidopsis. Hai nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng tiền xử lý Arabidopsis bằng OMV từ một loài Pseudomonas gây bệnh hoặc hội sinh, đã ngăn chặn sự lây nhiễm Pst sau đó (Janda và cộng sự, 2021; McMillan và cộng sự, 2021). Những kết quả này chỉ ra rằng trong các điều kiện được thử nghiệm, sự xâm nhập của OMV không tạo điều kiện cho mầm bệnh lây nhiễm. Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng nhiều đột biến thụ thể miễn dịch duy trì khả năng đáp ứng WT với Xcc OMV. Những đột biến này bao gồm các PRR đã biết, nhận biết MAMP có protein (FLS2, EFR, RLPReMAX) hoặc MAMP không có protein (LYM1/LYM3) (Bahar et al., 2016). Điều thú vị là Janda và cộng sự. (2021) đã báo cáo rằng khi dòng đột biến thụ thể FLS2 của Arabidopsis (cúm) bị thử thách với OMV từ Pst, biểu hiện FRK1 không thay đổi và tương tự như các cây được xử lý mô phỏng, cho thấy FLS2 làm trung gian cho phản ứng với Pst OMV. Có thể là Flagellin có nhiều trong các chế phẩm Pst OMV hơn là trong Xcc 33913 OMV, và do đó việc loại bỏ thụ thể Flagellin có tác động rõ rệt hơn đến phản ứng của thực vật với Pst so với Xcc OMV.

lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Người ta đã chứng minh rằng các thử nghiệm miễn dịch thực vật khác nhau có thể mang lại những kết quả khác nhau, dẫn đến những kết luận được cho là trái ngược nhau. Ví dụ, chúng tôi đã chỉ ra rằng trong xét nghiệm bùng nổ ROS trên đĩa lá, phản ứng của Arabidopsis với OMV phụ thuộc vào thụ thể EFR, tuy nhiên, trong xét nghiệm biểu hiện gen đánh dấu miễn dịch với cây giống Arabidopsis, dòng đột biến nào cũng phản ứng với OMV như nhau. cái WT. McMillan và cộng sự. (2021) cho thấy rằng các phương pháp xử lý vật lý khác nhau áp dụng cho OMV đã loại bỏ một số hoạt động nhất định như ức chế sự phát triển của cây con. Tuy nhiên, nó không làm thay đổi các kết quả miễn dịch khác như mồi cây. Do đó, điều quan trọng là phải kết hợp nhiều xét nghiệm khác nhau để kiểm tra các kết quả miễn dịch khác nhau nhằm có được cái nhìn bao quát nhất có thể về phản ứng miễn dịch của thực vật đối với một chất kích thích nhất định. Để kiểm tra sâu hơn về sự liên quan của một số PRR và đồng thụ thể đã biết, chúng tôi đã thử nghiệm các dòng thác ever và dòng đột biến bak bằng cách sử dụng xét nghiệm mồi thực vật. Kết quả của chúng tôi cho thấy dòng thác đột biến kép Arabidopsis cũng được Xcc OMV tạo ra tương tự như các cây WT, ủng hộ quan điểm rằng các MAMP khác ngoài Flagellin và EF-Tu cũng có mặt trong Xcc 33913 OMV. Dựa trên các thử nghiệm biểu hiện gen đánh dấu miễn dịch, trước đây chúng tôi đã đề xuất rằng đồng thụ thể BAK1 có liên quan đến nhận thức và/hoặc phản ứng OMV (Bahar et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xem xét lại đề xuất này bằng cách sử dụng xét nghiệm mồi. Ở đây, dòng đột biến bak được tạo ra bằng quá trình tiền xử lý OMV, nhưng ở mức độ thấp hơn một chút so với thực vật WT Col-0. Mặc dù mức chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê nhưng nó lớn hơn mức chênh lệch được thấy ở dòng đột biến fls kép. Kết quả này cũng phù hợp với một nghiên cứu gần đây cho thấy dòng đột biến bak phản ứng với OMV dưới dạng thực vật WT trong các thí nghiệm mồi miễn dịch (Tran và cộng sự, 2021). Nhìn chung, điều này có thể gợi ý rằng mặc dù BAK1 có liên quan đến nhận thức OMV, nhưng các con đường truyền tín hiệu và nhận thức miễn dịch khác đều được OMV khởi xướng, dẫn đến phản ứng miễn dịch hiệu quả và ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh. Sự tham gia của các đồng thụ thể BAK1 và SOBIR1 trong phản ứng với OMV (Bahar và cộng sự, 2016) khiến chúng tôi cho rằng nhiều thụ thể miễn dịch, có thể là PRR, có liên quan đến nhận thức OMV. Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hoạt động miễn dịch thực vật bằng OMV có thể không phụ thuộc vào MAMP và là kết quả của những thay đổi lý hóa trong màng tế bào thực vật do tích hợp OMV (Tran và cộng sự, 2021). Đây là một giả thuyết hấp dẫn vẫn cần được giải quyết thêm. Điều thú vị là McMillan và cộng sự. (2021) đã báo cáo rằng OMV được xử lý bằng proteinase K vẫn giữ được khả năng mồi miễn dịch, cho thấy rằng hoạt động này có thể độc lập với hàng hóa protein OMV. Mặc dù kết quả này có thể hỗ trợ giả thuyết kích hoạt miễn dịch độc lập MAMP của Tran et al. (2021), các MAMP không chứa protein khác có trong OMV như LPS và PGN có thể kích hoạt MTI (Bahar và cộng sự, 2016; McMillan và cộng sự, 2021). Ngoài ra, OMV được xử lý bằng proteinase K vẫn giữ được khả năng gây ra sự ức chế tăng trưởng của cây con, cho thấy rằng sự ức chế tăng trưởng phụ thuộc vào lượng protein của OMV (McMillan và cộng sự, 2021). Nhìn chung, những kết quả này nhấn mạnh hơn nữa tính phức tạp của phản ứng của thực vật đối với OMV và tầm quan trọng của việc sử dụng nhiều kết quả đầu ra khác nhau để kiểm tra sự tham gia của một chất kích thích cụ thể trong các con đường cụ thể.

Trong năm 2021, bốn nghiên cứu độc lập bao gồm nghiên cứu này (có thể diễn ra đồng thời), đã báo cáo rằng OMV của vi khuẩn điều chỉnh hệ thống miễn dịch thực vật và tạo ra phản ứng hiệu quả chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh (Janda và cộng sự, 2021; McMillan và cộng sự, 2021; Trần và cộng sự, 2021). Những kết quả thú vị này định vị OMV như một nhân tố mới và quan trọng trong tương tác giữa thực vật và vi khuẩn, nơi vẫn còn nhiều điều cần tìm hiểu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp cái nhìn rộng hơn về phản ứng phiên mã của cây Arabidopsis đối với Xcc OMV. Sẽ cần có các phương pháp nghiên cứu bổ sung để hiểu rõ hơn về các thành phần và cơ chế liên quan đến nhận thức của thực vật về OMV.

NGƯỜI GIỚI THIỆU

Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR, & Yadav, RC (2013). Các gen yếu tố phiên mã MYB đóng vai trò điều chỉnh các phản ứng của thực vật: Tổng quan. Sinh lý học và sinh học phân tử của thực vật, 307–321.

Bahar, O. (2020). Các túi màng từ vi khuẩn gây bệnh thực vật và vai trò của chúng trong quá trình tương tác giữa mầm bệnh và thực vật. Trong: M. Kaparakis-Liaskos, & TA Kufer biên tập. Túi màng vi khuẩn - Sinh học, chức năng và ứng dụng. Nhà xuất bản Quốc tế Springer, Thụy Sĩ, 119–129.

Bahar, O., Mordukhovich, G., Lưu, DD, Schwessinger, B., Daudi, A., Jehle, AK, Felix, G., & Ronald, PC (2016). Các túi màng ngoài của vi khuẩn gây ra phản ứng miễn dịch thực vật. Tương tác phân tử thực vật-vi khuẩn, 374–384.

Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I., & Somssich, IE (2018). Các nguyên tắc và đặc điểm của mạng lưới quản lý Arabidopsis WRKY trong quá trình miễn dịch được kích hoạt MAMP sớm. Tạp chí Thực vật, , 487–502.

Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T., & Zipfel, C. (2021). Bối cảnh phiên mã của khả năng miễn dịch được kích hoạt theo mô hình Arabidopsis thaliana. Thực vật Thiên nhiên, 579–586.

Bolger, AM, Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Công cụ cắt linh hoạt cho dữ liệu chuỗi Illumina. Tin sinh học, 2114–2120.

Boutrot, F., & Zipfel, C. (2017). Chức năng, khám phá và khai thác các thụ thể nhận dạng mẫu thực vật để kháng bệnh phổ rộng. Đánh giá hàng năm về bệnh thực vật, 257–286.

Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G., & Boller, T. (2007). Phức hợp Flagellin của thụ thể FLS2 và BAK1 khởi động cơ chế phòng vệ của thực vật. Thiên nhiên, 497–500.

Chowdhury, C., & Jagannadham, M. v. (2013). Các yếu tố độc lực được giải phóng cùng với các túi màng ngoài của Pseudomonas syringae pv. cà chua T1 trong quá trình sinh trưởng bình thường. Biochimica Et Biophysical Acta-Proteins và Proteomics,(1), 231–239.

Cook, DE, Mesarich, CH, & Thomma, BPHJ (2015). Hiểu khả năng miễn dịch thực vật như một hệ thống giám sát để phát hiện sự xâm nhập. Đánh giá hàng năm về bệnh thực vật, 541–563.

Couto, D., & Zipfel, C. (2016). Điều chỉnh tín hiệu thụ thể nhận dạng mẫu ở thực vật. Tạp chí Tự nhiên Miễn dịch học, (9), 537–552.

Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M., & Palva, ET (2017). Các oligogalacturonides ngắn gây ra sự biểu hiện gen liên quan đến khả năng kháng mầm bệnh ở cây Arabidopsis thaliana. Sinh học thực vật BMC, 1–17.

Deatheragea, BL, & Cookson, BT (2012). Giải phóng túi màng ở vi khuẩn, sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ: Một khía cạnh được bảo tồn nhưng chưa được đánh giá cao của đời sống vi sinh vật. Nhiễm trùng và miễn dịch, 1948–1957.

Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM, & Dewdney, J. (2008). Kích hoạt các con đường phản ứng phòng thủ bằng các chất kích thích OG và Flg22 trong cây giống Arabidopsis. Thực vật phân tử, 423–445.

Dow, M., Newman, M.-A., & von Roepenack, E. (2000). Việc tạo ra và điều chế các phản ứng bảo vệ thực vật bằng lipopolysacarit vi khuẩn. Đánh giá hàng năm về bệnh thực vật, 241–261.

Du, Z., Chu, X., Ling, Y., Zhang, Z., & Su, Z. (2010). agriGO: Bộ công cụ phân tích GO dành cho cộng đồng nông nghiệp. Nghiên cứu Axit Nucleic, W64–W70.

Ellis, TN, & Kuehn, MJ (2010). Độc lực và vai trò điều hòa miễn dịch của các túi màng ngoài của vi khuẩn. Đánh giá về Vi sinh và Sinh học Phân tử, 81–94.

Ellis, TN, Leiman, SA, & Kuehn, MJ (2010). Các túi màng ngoài được sản xuất tự nhiên từ Pseudomonas aeruginosa tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh mạnh mẽ thông qua cảm biến kết hợp của cả thành phần lipopolysaccharide và protein. Nhiễm trùng và Miễn dịch, 3822–3831.

Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A., & Cooper, RM (2008). Peptidoglycan và muropeptide từ mầm bệnh Agrobacteria và Xanthomonas gợi ra khả năng miễn dịch bẩm sinh ở thực vật: Cấu trúc và hoạt động. Hóa học và Sinh học, 438–448.

Felix, G., Duran, JD, Volko, S., & Boller, T. (1999). Thực vật có một hệ thống nhận biết nhạy cảm đối với miền roi vi khuẩn được bảo tồn tốt nhất. Tạp chí Thực vật, 265–276.

Fesel, PH, & Zuccaro, A. (2016). -glucan: Thành phần quan trọng của thành tế bào nấm và MAMP khó nắm bắt ở thực vật. Di truyền và Sinh học Nấm, 53–60

Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA, & Nielsen, KM (2014). Khả năng chuyển gen của các túi màng ngoài của Acinetobacter baylyi và ảnh hưởng của stress lên mụn nước. Vi sinh ứng dụng và môi trường, 3469–3483.

Gómez-Gómez, L., & Boller, T. (2000). FLS2: Một kinase giống thụ thể LRR liên quan đến nhận thức về Flagellin kích thích vi khuẩn ở cây Arabidopsis. Tế bào phân tử, 1003–1011.

Gust, AA, Biswas, R., Lenz, HD, Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G., & Nürnberger , T. (2007). Các peptidoglycan có nguồn gốc từ vi khuẩn tạo thành các kiểu phân tử liên quan đến mầm bệnh kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh ở cây Arabidopsis. Tạp chí Hóa sinh học, 32338–32348.

Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM, & Lindow, SE (2014). Các túi màng ngoài của Xylella fastidiosa điều chỉnh sự xâm chiếm của thực vật bằng cách ngăn chặn sự bám dính vào bề mặt. Kỷ yếu của Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ, E3910–E3918.

Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A., & Robatzek, S. (2021). Các phân tích sinh lý và protein cho thấy chức năng của các túi ngoại bào Pseudomonas syringae pv cà chua DC3000 trong sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lây nhiễm thực vật. bioRxiv, 2021.02.08.430144.