Chiến lược cảm biến mầm bệnh bẩm sinh liên quan đến sự phổ biến của protein bề mặt vi khuẩn Phần 2

CUỘC THẢO LUẬN

Metazoans sử dụng sự phổ biến khắp nơi như một cơ chế linh hoạt để duy trì cân bằng nội môi tế bào, ngăn chặn sự tích tụ của các protein/bào quan bị hư hỏng và bảo vệ chống lại mầm bệnh xâm nhập (40, 41). Với sự đa dạng của mầm bệnh và các tập hợp protein bị hư hỏng đa dạng gặp phải, việc xác định các họa tiết phổ biến để nhận dạng cơ chất và phổ biến sau đó thể hiện một chiến lược thông minh để tối ưu hóa tài nguyên. Các protein trong các tế bào nhân chuẩn được dành cho quá trình phân giải protein thường được xác định bởi mô típ degron ba bên (24).

Miễn dịch là khả năng cơ thể chống lại bệnh tật, bao gồm phản ứng với vi khuẩn, vi rút và các chất có hại khác. Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể bị tổn hại sẽ không đủ mạnh để đối phó với sự tấn công của bệnh tật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng suy dinh dưỡng có tác động đến chức năng của hệ thống miễn dịch, khiến cơ thể dễ bị nhiễm trùng và bệnh tật. Protein là một trong những chất quan trọng để duy trì khả năng miễn dịch.

Protein được tạo thành từ các axit amin, một số trong đó được gọi là axit amin thiết yếu vì chúng phải được cung cấp bởi thực phẩm và cơ thể không thể tổng hợp được. Những axit amin thiết yếu này bao gồm tryptophan, leucine, phenylalanine, lysine, isoleucine, methionine, valine và histidine. Nếu cơ thể không được cung cấp đủ các axit amin thiết yếu sẽ dẫn đến suy giảm chuyển hóa protein, từ đó ảnh hưởng đến chức năng của hệ thống miễn dịch.

Ngoài ra, một lượng protein chất lượng cao giúp duy trì hệ thống miễn dịch bình thường và các chức năng của cơ thể. Khi cơ thể thiếu protein sẽ dẫn đến hệ thống miễn dịch bị suy giảm và cơ thể dễ mắc bệnh hơn. Nếu cơ thể con người thiếu chất đạm trong một thời gian dài, nó có thể gây ra thiệt hại lâu dài cho hệ thống miễn dịch, khiến con người dễ mắc các bệnh khác nhau.

Do đó, một chế độ ăn uống cân bằng và tập thể dục hợp lý là chìa khóa để duy trì lượng protein. Mọi người có thể đáp ứng nhu cầu protein của cơ thể bằng cách ăn nhiều thực phẩm giàu protein như thịt, gia cầm, cá, đậu, trứng, các sản phẩm từ sữa, ngũ cốc, quả hạch và hạt. Ngoài ra, tập thể dục vừa phải cũng có thể làm tăng nhu cầu của cơ thể đối với protein và hiệu quả hấp thụ. Một chế độ ăn uống cân bằng, đa dạng và lối sống lành mạnh là chìa khóa để duy trì khả năng miễn dịch, giúp cơ thể luôn khỏe mạnh và ổn định, chống lại sự xâm nhập của bệnh tật. Từ quan điểm này, chúng ta cần cải thiện khả năng miễn dịch của mình. Cistanche có thể cải thiện đáng kể khả năng miễn dịch vì polysacarit trong thịt có thể điều chỉnh phản ứng miễn dịch của hệ thống miễn dịch của con người, cải thiện khả năng căng thẳng của tế bào miễn dịch và tăng cường khả năng miễn dịch của tế bào miễn dịch. tác dụng diệt khuẩn.

Nhấp vào bổ sung cistanche Deserticola

Điều này thôi thúc chúng tôi khám phá xem liệu các họa tiết tương tự có thể được tìm thấy trên các bề mặt mầm bệnh hay không, nơi chúng có thể hoạt động như một đại diện để nhận dạng cơ chất. Ở đây, chúng tôi chứng minh rằng các dây chằng ubiquitin của vật chủ sử dụng các dấu hiệu phân tử tương tự để cảm nhận các mầm bệnh khác biệt về mặt phát sinh gen. Nhận dạng mầm bệnh thông qua các mẫu/mô-đun phân tử phổ biến (PAMPs) là một đặc điểm nổi bật của khả năng miễn dịch bẩm sinh (42). Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các trình tự giống như degron trong các protein bề mặt của vi khuẩn hoạt động theo cách tương đương với PAMPs, để thực hiện giám sát mầm bệnh nội bào. Toán hạng phương thức này có thể được vật chủ khai thác thêm để trình diện các kháng nguyên protein của vi sinh vật trên phức hợp tương hợp mô chính I để tạo ra phản ứng CD8 mạnh nhằm chống lại mầm bệnh nội bào.

Tầm quan trọng tiềm năng của việc phát hiện mầm bệnh qua trung gian ubiquitin đối với hệ thống phòng thủ của vật chủ được nhấn mạnh thêm bằng sự phổ biến đáng kể còn sót lại được phát hiện trong SPN đột biến thiếu cả BgaA và PspA. Điều này chỉ ra rằng còn có các chất nền khác, không xác định của bộ máy ubiquitin, với kết quả là sự dư thừa đảm bảo ngăn chặn mầm bệnh mạnh mẽ. Đáng chú ý, một số câu hỏi ngay lập tức về mô típ degron và tầm quan trọng của nó đối với vi khuẩn (ngoài việc là một đơn vị dễ nhận biết) cung cấp một góc độ tiến hóa thú vị.

Mô-đun degron có thể phân phối được trong cơ thể sống, và nếu có bất kỳ điều gì xảy ra, việc đột biến hoặc xóa mô-đun này đã cải thiện sự bền bỉ nội bào dẫn đến tăng độc lực. Điều này được chứng minh bằng kết quả của chúng tôi rằng đột biến trong mô-đun degron có thể được mầm bệnh sử dụng để thoát khỏi sự công nhận qua trung gian ubiquitin như đã thấy đối với kiểu huyết thanh SPN 19F. Tuy nhiên, bản chất được bảo tồn của mô-đun degron trong BgaA trên phần lớn các kiểu huyết thanh SPN có thể gợi ý về một chiến lược đối phó được vi khuẩn áp dụng để ít gây chết người hơn cho vật chủ.

Điều này có thể tạo cơ hội cho mầm bệnh tăng môi trường sống có sẵn của nó. Đồng thời, sự phổ biến của bề mặt vi khuẩn hoặc các protein được tiết ra ở mô-đun degron có thể điều chỉnh chức năng của chúng để làm giảm hoặc điều chỉnh lại phản ứng của vật chủ vì lợi ích cuối cùng (43). Do đó, sự hiện diện hay vắng mặt của các lĩnh vực hoặc mô típ chức năng giống như sinh vật nhân chuẩn (chẳng hạn như degron) có thể phụ thuộc vào một hốc gây bệnh và thích nghi để trốn tránh hoặc điều chỉnh các phản ứng miễn dịch của vật chủ.

Một cơ chế cảm biến mầm bệnh tương tự liên quan đến các protein liên kết với guanylate cũng có liên quan đến việc loại bỏ vi khuẩn; tuy nhiên, không giống như phổ biến, vai trò của chúng được báo cáo là bị hạn chế đối với mầm bệnh gram âm (44–47). Sự phổ biến nhắm vào mầm bệnh bất kể nguồn gốc Gram, ví dụ, RNF213 đã được ghi nhận để nhắm mục tiêu Listeria spp. bất kể sự vắng mặt của LPS (48). Do đó, chúng tôi cũng không loại bỏ khả năng hoạt động kháng khuẩn của nó đối với SPN.

Một bề mặt gây bệnh có thể được phổ biến với nhiều loại chuỗi bởi các dây chằng E3 khác nhau với các tương tác giữa các chuỗi (41). Đặc biệt, trong trường hợp Mtb, Smurf1 và Parkin đã được chứng minh là tạo thành các loại chuỗi K48 và K63 có chức năng hiệp đồng để làm suy giảm mầm bệnh (12). Việc hiểu vai trò cơ học của sự phổ biến K48 và các dây chằng E3 liên quan trong các tình huống lây nhiễm vẫn còn chưa được nghiên cứu kỹ. Trong trường hợp của STm, một E3 ligase ARIH1 duy nhất đã được mô tả để nhắm mục tiêu STm tế bào học với chuỗi K48 ubiquitin dẫn đến việc loại bỏ chúng khỏi hệ thống (15). Dựa trên phát hiện của chúng tôi và của những người khác, mầm bệnh được dán nhãn K48-Ub cuối cùng sẽ bị phân hủy khi được liên kết với bộ máy proteasomal.

Tuy nhiên, nghiên cứu này cho thấy K48-Ub trang trí các protein bề mặt vi khuẩn cụ thể. Một số mầm bệnh được biết là tích cực sửa đổi protein bề mặt của chúng, bảo vệ chúng khỏi sự phổ biến và tiêu diệt sau đó, do đó nhấn mạnh tầm quan trọng của việc định vị bề mặt của chất nền ubiquitin (10). Ngoài ra, nhiều mầm bệnh nội bào bắt buộc đã phát triển các chiến lược để tự khử phổ biến hoặc lưu trữ các thành phần điều tiết, để trốn tránh sự thanh thải qua trung gian ubiquitin (5). Cùng với nhau, những phát hiện này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kích thích báo động qua trung gian ubiquitin như một cơ chế cảm nhận mầm bệnh nội bào cơ bản là trung tâm để bảo vệ vật chủ.

Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh thêm vai trò trung tâm của ligase SCF E3, đặc biệt là với FBXW7, trong sự phổ biến của vi khuẩn làm tăng sự thoái hóa của mầm bệnh. Các đột biến dị hợp tử trong FBXW7, đặc biệt là biến thể R505C (dư lượng quan trọng trong túi nhận dạng cơ chất), kích hoạt nhiều ung thư biểu mô và bệnh bạch cầu lympho ở người (49, 50). Một nghiên cứu thuần tập gần đây chỉ ra rằng gần 43% bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mạn tính (CLL) không chống chọi được với viêm phổi do vi khuẩn và nhiễm trùng huyết, sau đó là nhiễm nấm (51).

Điều này chứng thực quan sát của chúng tôi về khả năng bị loại bỏ của các tế bào chủ mang đột biến FBXW7 để cảm nhận và loại bỏ mầm bệnh. Do đó, những phát hiện của chúng tôi cung cấp một lời giải thích phân tử bất ngờ về nguy cơ nhiễm trùng tăng cao ở những bệnh nhân mắc CLL. Mối liên hệ giữa tính đa hình di truyền trong gen ligase E3 và tính nhạy cảm với nhiễm trùng do vi khuẩn cũng được chứng minh bởi những bệnh nhân mắc bệnh Parkinson, những người dễ bị sốt thương hàn hoặc bệnh phong (14), cho thấy sự đóng góp đáng chú ý của các ligase E3 trong khả năng miễn dịch của vật chủ chống lại nhiễm trùng và duy trì vi khuẩn. trạng thái ổn định của tế bào.

Để kết luận, chúng tôi đã giải mã một ngôn ngữ phổ quát để cảm nhận mầm bệnh cư trú trong tế bào chất mà vật chủ có thể áp dụng một cách hiệu quả để nhận biết vi sinh vật để loại bỏ sau đó. Nói chung, những phát hiện này làm sáng tỏ sự hiểu biết về các quá trình miễn dịch tế bào thô sơ, có thể được khai thác để tăng cường khả năng miễn dịch kháng khuẩn.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nuôi cấy tế bào

Cả dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi người (tế bào phổi loại II) A549 [Bộ sưu tập Văn hóa Loại Mỹ (ATCC) số. CCL185)] và dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến cổ tử cung HeLa (ATCC số CRM-CCL-2) được nuôi cấy trong môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM; HiMedia) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Gibco) ở 37 độ và 5 phần trăm CO2.

Chủng và điều kiện tăng trưởng của vi khuẩn

SPN (R6, serotype 2, quà tặng từ Tim J. Mitchell, Đại học Birmingham, Vương quốc Anh) được trồng trong môi trường Todd-Hewitt có bổ sung 1,5% chiết xuất nấm men ở 37 độ trong 5% CO2. Các loại kháng sinh sau đây được sử dụng để nuôi cấy SPN khi cần: kanamycin (200 ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml) và chloramphenicol (4,5 ug/ml). Chín trăm microlit dung dịch nuôi cấy SPN 0,4 OD600 (mật độ quang học ở bước sóng 600 nm) được trộn với 600 ul 80% glycerol vô trùng (nồng độ glycerol cuối cùng là 32%) và được bảo quản trong tủ đông sâu -80 độ. Những dự trữ glycerol này đã được sử dụng làm chất cấy ban đầu cho tất cả các thí nghiệm.

Các chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5 và STm (ATCC 14028) được nuôi cấy trong canh thang Luria-Bertani (LB) ở 37 độ trong điều kiện lắc (200 vòng/phút) và khi cần thiết, các loại kháng sinh sau đây đã được sử dụng: kanamycin (50 ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml), chloramphenicol (20 ug/ml) và ampicillin (100 ug/ml). Đối với tất cả các xét nghiệm lây nhiễm, vi khuẩn đã được phát triển cho đến OD600 ~ 0,4, sau đó được nối lại trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) với mật độ tương tự trước khi lây nhiễm vào tế bào chủ.

Sàng lọc các protein mục tiêu ubiquitin giả định

Tất cả các protein bề mặt có trong hệ protein STm và SPN lần đầu tiên được xác định từ các tài liệu đã xuất bản. Trình tự protein hoàn chỉnh của protein bề mặt được lấy từ UniProt, sau đó được sử dụng để xác định sự hiện diện của họa tiết degron. Một bộ gồm 29 họa tiết degron giả định đã được tuyển chọn từ các tài liệu đã xuất bản (24, 52, 53) và cơ sở dữ liệu Mô-típ tuyến tính Eukaryotic. Mô-đun biểu thức chính quy của Python được sử dụng để xác định vị trí của tất cả các họa tiết được sắp xếp như vậy trong chuỗi protein bề mặt. Một tìm kiếm tuyến tính đã được thực hiện thêm để xác định sự hiện diện của dư lượng lysine gần đó (8 đến 14 dư lượng axit amin) đối với mọi họa tiết degron đã xác định. Dư lượng lysine này được cho là đóng vai trò là vị trí đính kèm cho nửa ubiquitin. Cuối cùng, các trình tự protein trong danh sách rút gọn đã được đưa vào IUPred (54), một công cụ dự đoán cấu trúc protein, để xác định sự hiện diện của một vùng bị rối loạn ở giữa mô-đun degron và lysine gần nhất. Các protein kết quả (BgaA và PspA cho SPN và RlpA cho STm) đã được chọn để đánh giá làm mục tiêu phổ biến và giải mã vai trò của chúng trong việc loại bỏ mầm bệnh.

Xây dựng chủng vi khuẩn

Trao đổi alen bằng cách tái tổ hợp tương đồng được thực hiện bằng cách sử dụng các vùng sườn gen mang băng kháng sinh được chèn vào để tạo ra các chủng đột biến ở cả SPN và STm (bảng S2).

Đối với SPN, 500-bp vùng ngược dòng và xuôi dòng của bgaA, pspA và các gen của anh ta được khuếch đại từ bộ gen bằng các đoạn mồi thích hợp (bảng S3) và được lắp ráp trong vectơ pBKS. Sau khi nhân bản các đoạn này, một băng kháng kháng sinh (spectinomycin cho túi cũng như pspA và chloramphenicol cho hysA) đã được đưa vào cấu trúc này. Các plasmid tái tổ hợp được tuyến tính hóa sau đó được chuyển thành WT SPN bằng cách sử dụng peptide kích thích năng lực 1 (GenPro Biotech), các chất tái tổ hợp được chọn bằng cách sử dụng kháng sinh tương ứng và sự thay thế gen được xác nhận bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và giải trình tự các locus gen tương ứng. Đối với STm, phương pháp λ-red recombinase được sử dụng để tạo ra các đột biến xóa gen (55).

Tóm lại, các trình tự tương đồng với các đầu của gen dây được thêm vào các trình tự mồi được sử dụng để khuếch đại băng kháng kanamycin. Sau đó, băng cassette được điện hóa thành chủng WT STm và các loại trực tiếp được tạo ra bởi sự tái hợp tương đồng đã được chọn dựa trên tính kháng kanamycin. Việc xóa gen đã được xác nhận bằng PCR và giải trình tự locus gen. PspA, hysA, và bgaA-T có độ dài đầy đủ (1 đến 3168 bp) được sao chép dưới trình tự khởi đầu P23 trong vectơ con thoi pIB166 (56) và được sử dụng để bổ sung.

Các plasmid tái tổ hợp này cũng được sử dụng để gây đột biến tại chỗ nhằm tạo ra các biến thể khác nhau của bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R và bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R và pspAΔDegron ) và của anh ấy (hysADegron-BgaA và hysADegron-PspA) bằng cách sử dụng các bộ mồi thích hợp (bảng S3) và biến đổi thành các thể đột biến ΔbgaA và ΔpspA. Tất cả các dòng vô tính đã được xác minh bằng trình tự DNA. Biểu hiện của các biến thể khác nhau của BgaA, PspA và HysA đã được Western blot xác nhận bằng cách sử dụng các kháng thể thích hợp.

Kháng thể và thuốc thử

Huyết thanh chống Enolase và chống PspA (S. Hammerschmidt, Đại học Greifswald, Đức); huyết thanh kháng BgaA (S. King, The Ohio State University, USA); và các kháng thể đặc hiệu cho liên kết His6 (Invitrogen, MA1-21315), liên kết K48-Ub (Millipore, 05-1307), liên kết K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Công nghệ sinh học Santa Cruz, sc-80500), FBXW7 (Phòng thí nghiệm Bethyl, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], phosphothreonine (CST, 9381S), IgA, Kappa từ u tủy ở chuột, nhân bản TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) và PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) đã được mua. Các kháng thể thứ cấp sau đây đã được sử dụng: horseradish peroxidase (HRP)–được gắn thẻ kháng thỏ (BioLegend, 406401), kháng chuột được gắn thẻ HRP (BioLegend 405306), kháng thỏ Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), kháng thỏ Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), globulin miễn dịch A chống chuột kết hợp với biotin (Life Technologies, M31115), Alexa Fluor chống chuột (Invitrogen, A31570), Alexa Fluor 488 chống chuột (Invitrogen, A21202), Alexa chống dê Fluor 633 (Invitrogen, A21082) và FM4-64 (Thermo Fisher Khoa học, T13320).

Biểu hiện và thanh lọc protein

BgaA-T và các biến thể của nó đã được nhân bản trong pET28 bằng cách sử dụng các trang web hạn chế Xba I/Not I. Các plasmid tái tổ hợp mã hóa BgaA-T với đầu cuối N Thẻ của anh ấy đã được biến đổi thành các tế bào E. coli BL21 (DE3) để biểu hiện protein. Các khuẩn lạc mới biến nạp được nuôi cấy trong LB có chứa kanamycin (50 ug/ml) ở 37 độ trong tủ ấm có máy lắc trong 12 giờ. Một phần trăm dịch cấy ban đầu được thêm vào 1 lít canh thang LB và ủ ở 37 độ trên tủ ấm có máy lắc cho đến khi OD600nm đạt từ 0,6 đến 0,8. Sự biểu hiện protein được tạo ra bằng cách bổ sung 100 μM isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) và nuôi cấy thêm ở 37 độ trong 5 đến 6 giờ với sự khuấy trộn ở tốc độ 150 vòng/phút.

Các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 độ . Các viên tế bào đã được nối lại trong dung dịch đệm A [25 mM tris (pH 8,0) và 300 mM NaCl] và được ly giải bằng cách siêu âm. Các mảnh vụn của tế bào được tách ra bằng cách ly tâm (14,000 vòng/phút, 50 phút, 4 độ) và phần nổi phía trên được đưa lên cột Ni-NTA, được cân bằng với dung dịch đệm A. Cột được rửa bằng 10 thể tích dung dịch đệm A, và các protein được gắn thẻ His đã được tách rửa bằng imidazole (250 mM) trong dung dịch đệm A. Tất cả các biến thể của BgaA-T đều được biểu thị và tinh chế bằng cách sử dụng cùng một quy trình. FBXW7 đã được đăng ký trong vectơ pGEX-4 T-1 có thẻ N-terminal glutathione S-transferase (GST) từ vectơ pCMV6-Entry-FBXW7 bằng cách sử dụng enzym giới hạn Eco RI.

FBXW7 được gắn thẻ GST được thể hiện trong các tế bào E. coli BL21 (DE3) sau khi kích thích biểu hiện protein với 0.1 mM IPTG và tăng trưởng ở 30 độ trong 4 giờ. GST-FBXW7 từ chiết xuất thô của E. coli đã được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột Glutathione-Sepharose (GE HealthCare). Các phần chứa protein tinh khiết được gộp lại và cô đặc đến 0,5 mg/ml bằng cách sử dụng bộ lọc cắt khối lượng phân tử 10-kDa (Amicon) bằng cách ly tâm ở tốc độ 4700 vòng/phút ở 4 độ . Độ tinh khiết của protein đã được kiểm tra trên điện di gel polyacrylamide SDS (SDS-PAGE), sau đó nhuộm bằng màu xanh Coomassie.

Truyền tế bào chủ

BgaA-T đã được nhân bản trong vector cảm ứng doxycycline pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene số 130261) bằng cách sử dụng bộ nhân bản tiêm truyền (Takara). Một bản sao tích cực đã được xác nhận bằng trình tự Sanger. Đột biến FBXW7R505C được thực hiện bằng phương pháp gây đột biến tại chỗ bằng cách sử dụng pMRX-GFP-FBXW7 làm mẫu và được xác nhận bằng trình tự Sanger. Tất cả các lần truyền được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Khoa học) và các lựa chọn được thực hiện với sự có mặt của blasticidin hydrochloride (2 ug/ml; HiMedia).

loại bỏ gen định hướng siRNA

Để loại bỏ các gen cụ thể qua trung gian can thiệp RNA, các siRNA sau đã được sử dụng: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) và siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Tóm lại, các tế bào A549 phát triển trong đĩa giếng 24-được thay thế tạm thời bằng siRNA dành riêng cho gen hoặc xáo trộn (siControl) (150 pmol) bằng cách sử dụng Lipofectamine 3000 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ba mươi sáu giờ sau khi truyền máu, các tế bào đã được xử lý để thử nghiệm phương pháp làm mờ và miễn dịch huỳnh quang hoặc thử nghiệm bảo vệ penicillin-gentamycin của phương Tây.

Dự đoán cấu trúc và mô hình hóa

Tất cả các cấu trúc đã được dự đoán bởi AlphaFold (Công cụ nhận dạng tương đồng/tương tự protein V 2.0) (57) và được trực quan hóa bằng PyMOL (Hệ thống đồ họa phân tử PyMOL, phiên bản 2.0 Schrödinger, LLC). Các cấu trúc được mã hóa màu trong PyMol dựa trên điểm số IUPred (54) từ có thứ tự (màu xanh) đến mất trật tự (màu đỏ) đến màu trắng.

phương Tây

Các nền văn hóa SPN đã phát triển thành {{0}}.4 OD600nm được ly giải bằng cách siêu âm và các chất chiết xuất thô được thu thập sau quá trình ly tâm (15,000 vòng/phút, 30 phút, 4 độ). Đối với A549, các lớp đơn lớp được rửa nhiều lần bằng PBS và được ly giải trong dung dịch đệm xét nghiệm ức chế miễn dịch phóng xạ (RIPA) làm lạnh bằng đá [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natri deoxycholate và 1 phần trăm SDS] có chứa cocktail ức chế protease (Promega), natri florua (10 mM) và EDTA (5 mM). Huyền phù tế bào được sonicated một thời gian ngắn và ly tâm để thu thập các dung dịch tế bào. Các protein có trong dung dịch ly giải của vi khuẩn hoặc tế bào A549 (10 hoặc 20 ug) được phân tách trên gel SDS-PAGE 12% và được chuyển vào màng polyvinylidene Difluoride đã hoạt hóa. Sau khi ngăn chặn trong sữa tách kem 5 phần trăm, các màng này đã được thử nghiệm với các kháng thể sơ cấp và thứ cấp được gắn thẻ HRP thích hợp. Các đốm màu cuối cùng đã được phát triển bằng cách sử dụng chất nền phát quang hóa học nâng cao (Bio-Rad).
Xét nghiệm bảo vệ penicillin-gentamicin

Các chủng SPN đã phát triển cho đến khi OD600nm 0.4 trong canh thang Todd-Hewitt được bổ sung 0.2% chiết xuất men (THY) được tạo thành dạng viên, được tái tạo huyền phù trong PBS ( pH 7,4) và được pha loãng trong môi trường xét nghiệm để lây nhiễm các đơn lớp A549 có bội số lây nhiễm (MOI) là 10. Sau 1 giờ lây nhiễm, các đơn lớp này được rửa bằng DMEM và được ủ với môi trường xét nghiệm có chứa penicillin (10 ug/ml ) và gentamicin (400 ug/ml) trong 2 giờ để tiêu diệt SPN ngoại bào. Sau đó, các tế bào được ly giải bằng 0,025 phần trăm Triton X-100 và dịch ly giải được mạ trên các đĩa thạch Brain Heart Infusion để liệt kê SPN khả thi. Tỷ lệ phần trăm xâm lấn được tính là [đơn vị tạo khuẩn lạc (CFU) trong lysate/CFU được sử dụng để lây nhiễm] × 100. Để đánh giá sự sống sót của tế bào, vào lúc 9 giờ sau khi lây nhiễm (kể từ khi bắt đầu điều trị bằng penicillin-gentamycin), các tế bào ly giải đã được chuẩn bị như đã đề cập ở trên, và vi khuẩn lây lan và vi khuẩn sống sót đã được liệt kê. Hiệu quả sống sót ( phần trăm ) được thể hiện dưới dạng thay đổi lần về tỷ lệ phần trăm sống sót so với kiểm soát tại thời điểm được chỉ định (chuẩn hóa thành 0 giờ).

miễn dịch huỳnh quang

Đối với xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang, các tế bào A549 hoặc HeLa được nuôi cấy trên nắp đậy thủy tinh và bị nhiễm các chủng SPN hoặc STm ở MOI ~ 25 trong 1 giờ sau đó điều trị bằng kháng sinh trong 2 giờ. Tại các thời điểm mong muốn sau khi lây nhiễm (9 giờ đối với nhiễm SPN ở A549 và 3 giờ đối với nhiễm STm ở HeLa), các tế bào được rửa bằng DMEM và cố định bằng metanol làm lạnh bằng nước đá ở −20 độ trong 10 phút. Hơn nữa, các nắp trượt được chặn bằng 3% albumin huyết thanh bò (BSA) trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng (RT). Sau đó, các tế bào được xử lý bằng kháng thể sơ cấp thích hợp trong 1% BSA trong PBS qua đêm ở 4 độ C, rửa bằng PBS và ủ với kháng thể thứ cấp phù hợp trong 1% BSA trong PBS trong 1 giờ ở RT. Cuối cùng, các nắp trượt được rửa bằng PBS và gắn trên các phiến kính cùng với VECTASHIELD có hoặc không có 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Phòng thí nghiệm Vector) để hiển thị bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laze (LSM 780, Carl Zeiss ) dưới vật kính dầu 40× hoặc 63×. Các hình ảnh được thu thập sau khi phân chia quang học và sau đó được xử lý bằng phần mềm ZEN lite (phiên bản 5.0). Kính hiển vi siêu phân giải được thực hiện tương tự bằng cách sử dụng Elyra 7 (Carl Zeiss) ở chế độ SIM. Đối với phân tích colocalization, vi khuẩn được tính điểm bằng cách đếm trực quan n > 100 vi khuẩn trên mỗi lần sao chép.

Kính hiển vi điện tử

Sau khi nhiễm SPN và STm, các tế bào được rửa sạch bằng dung dịch đệm natri cacodylat {{0}}.1 M, được cố định bằng 2,5% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) trong dung dịch đệm natri cacodylat 0.1 M ( Sigma-Aldrich) trong 3 giờ ở 4 độ. Sau khi cố định, các tế bào được thu thập thông qua một máy cạo tế bào và được tạo thành viên ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút. Các tế bào sau đó được rửa bằng dung dịch đệm natri cacodylate 0,1 M và được cố định sau với 1% osmium tetroxide trong dung dịch đệm natri cacodylate 0,1 M trong 20 phút ở 4 độ. Sau các lần rửa tiếp theo với dung dịch đệm cacodylate và nước cất, các tế bào sau đó được khử nước theo nồng độ ngày càng tăng của etanol (50, 70, 95 và 100 phần trăm ) và propylen oxit trong 30 phút và cuối cùng được nhúng vào nhựa epoxy (Khoa học kính hiển vi điện tử, 14300) bằng trùng hợp ở 75 độ trong 45 phút. Sau đó, các viên nang được chuyển đến lò nướng 95 độ trong 45 phút. Các phần siêu mỏng (70 nm) được cắt bằng dao kim cương trên máy Leica EM UC7 Ultramicrotome và nhuộm với 2% uranyl axetat và 1% chì citrate và quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (Talos L120 C, Thermo Fisher Khoa học) ở 120 KV.

Sự phổ biến của ex vivo

A549-biểu hiện BgaA-T và các biến thể của nó được xử lý bằng MG132 (5 μM) và các biểu hiện protein được tạo ra bằng doxycycline (100 ug/ml) trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được ly giải trong bộ đệm RIPA và các mẫu được điện di bằng SDS-PAGE (8 phần trăm). Xác nhận về sự biểu hiện protein và sự phổ biến của BgaA-T và các biến thể của nó đã được Western blot chứng minh sau khi thử nghiệm với các kháng thể kháng BgaA và kháng K48-Ub tương ứng.

Phổ biến trong ống nghiệm

Đối với các thử nghiệm phổ biến trong ống nghiệm, protein tái tổ hợp đã được tinh chế như mô tả trước đó (58). Phức hợp ligase SCFFBW7 E3 được ủ với chất tái tổ hợp 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) và ubiquitin (2,5 ug/ml; Boston Biochem) với sự có mặt của BgaA-T tinh khiết và các biến thể của nó. Phản ứng đồng vị được thực hiện trong dung dịch đệm xét nghiệm [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosine triphosphate (ATP), 1 mM -mercaptoethanol và 0,1 phần trăm Tween 20] trong 2 giờ ở 25 độ . Các phản ứng đã được dừng lại với dung dịch đệm 5× Laemmli, được phân giải trên gel SDS-PAGE và được phân tích bằng phương pháp hấp thụ miễn dịch bằng cách sử dụng kháng thể kháng BgaA.

Xét nghiệm in vitro kinase

Để thực hiện xét nghiệm in vitro kinase, hệ thống enzyme GSK3 kinase (Promega) đã được sử dụng theo giao thức của nhà sản xuất với các sửa đổi sau. Tóm lại, 3 ug BgaA-T tái tổ hợp đã được thêm vào 0.5 ug GSK3 đang hoạt động với 400 μM ATP trong dung dịch đệm phản ứng bao gồm 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) và 50 μM dithiothreitol. Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 30 độ và dừng lại bằng cách thêm dung dịch đệm Laemmli 1 ×. Các mẫu sau đó được đun sôi và điện di để làm mờ phương Tây như đã đề cập trước đây. Phosphoryl hóa BgaA-T được phát hiện với kháng thể kháng phosphothreonine.

mô hình trong cơ thể sống

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 phần trăm trọng lượng cơ thể bắt đầu, và chảy nước mũi hoặc mắt rõ rệt. Các mẫu máu được lấy bằng cách chọc thủng tim dưới gây mê giai đoạn cuối, và lá lách được cắt bỏ sau khi chết để đếm vi khuẩn. Các mẫu mô được xử lý bằng máy đồng nhất mô cầm tay và các chất đồng nhất được pha loãng huyết thanh trong PBS trước khi phát hiện trên các đĩa thạch máu. Các đĩa được ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 độ C, 5% CO2 và số lượng khuẩn lạc được đánh giá vào ngày hôm sau.

Phân tích thống kê

GraphPad Prism phiên bản 5 đã được sử dụng để phân tích thống kê. Các thử nghiệm thống kê được thực hiện cho các thí nghiệm riêng lẻ được đề cập trong các chú thích hình tương ứng. P < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Dữ liệu đã được kiểm tra tính quy phạm và để xác định phương sai của từng nhóm được kiểm tra. Tất cả các phân tích đa thông số bao gồm hiệu chỉnh cho nhiều phép so sánh và dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± SD trừ khi có quy định khác.

THAM KHẢO VÀ LƯU Ý

TÔI Bianchi, DAMPs, PAMPs và báo động: Tất cả những gì chúng ta cần biết về nguy hiểm. J. Leukoc. sinh học. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Nhận dạng mầm bệnh và truyền tín hiệu viêm trong cơ chế phòng vệ miễn dịch bẩm sinh. lâm sàng. vi sinh vật. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Cuộc sống bên trong: Lối sống nội bào của vi khuẩn tế bào. tự nhiên Linh mục Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Vai trò của sự phổ biến trong bảo vệ miễn dịch và trốn tránh mầm bệnh. tự nhiên Mục sư Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Hệ thống phổ biến trong các tương tác giữa vi khuẩn và mầm bệnh. Vi sinh vật 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Phân tích toàn cầu về vật chủ và vi khuẩn có mặt khắp nơi trong phản ứng với nhiễm khuẩn salmonella typhimurium. mol. Ô 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Một protein bề mặt của vi khuẩn lao mycobacterium tuyển dụng ubiquitin để kích hoạt sự bài ngoại của vật chủ. tự nhiên cộng đồng. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Sự phổ biến của lipopolysacarit bởi RNF213 trong quá trình nhiễm vi khuẩn. Thiên nhiên 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF phức hợp ubiquitin ligase chỉ đạo sự bài ngoại thông qua việc nhận ra glycan trên bề mặt vi khuẩn. Đại diện EMBO 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Quá trình methyl hóa Lysine bảo vệ mầm bệnh nội bào khỏi sự phổ biến và tự thực. Khoa học. quảng cáo 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, một ligase E3 ubiquitin có khả năng cảm nhận vi khuẩn. Vi khuẩn chủ tế bào 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Chức năng của ubiquitin ligase Smurf1 trong quá trình tự thực có chọn lọc đối với bệnh lao mycobacterium và bảo vệ vật chủ chống lao. Vi khuẩn chủ tế bào 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, chuỗi ubiquitin tuyến tính được tổng hợp LUBAC hạn chế vi khuẩn xâm nhập tế bào chất bằng cách kích hoạt autophagy và NF-κB. tự nhiên vi sinh vật. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Parkin ubiquitin ligase làm trung gian kháng mầm bệnh nội bào. Thiên nhiên 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Mở rộng bộ máy phổ biến tế bào chủ nhắm vào Salmonella tế bào học. Đại diện EMBO 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com