Hoạt động chống nhiễm trùng của Cistanche Salsa Stolons, phát triển ở Cộng hòa Kazakhstan

Nguyên liệu thực vật

salsa cá hồi(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,bia đá được thu thập tại sa mạc Moinkum, Làng Bakanas, vào tháng 7 năm 2014 tại Almaty. Nguyên liệu thực vật được xác định bởi Tiến sĩ G. Sitpayeva từ Viện Thực vật học và Thực vật học, Bộ Giáo dục và Khoa học của Cộng hòa Kazakhstan nơi nó được ký gửi theo số 01-04/306.

Phân tích hóa học

tấm bia củaC. salsa(2 g) đã được gửi đến một chiết xuất vi sóng. Ban đầu, vật liệu được nghiền thành 0.001–2.000 mm, sau đó được đặt trong bình kín để chiết trong 10 phút ở 100–1100 độ với etanol 80 phần trăm ( tỷ lệ 1:10). Dịch chiết hydroethanol (CSHE) được phân tích bằng HPLC-MS. Dịch chiết thô được hòa tan trong metanol (9,6 mg/ml) và lọc qua 0,45mm màng Teflon trước khi phân tích. Máy sắc ký lỏng kiểu HP 1100 Series (công ty Agilent Technologies, Inc., CA, USA), được trang bị bộ khử khí chân không dòng chảy, bơm gradien áp suất thấp bốn kênh và tự độngkim phun. Các hợp chất phenolic được phân tách bằng sắc ký bằng cột Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, chứa đầy polyme octadecylsilyl silica gel (1,8μ). Phân tích sắc ký được thực hiện với dòng pha động 0.2ml/phút, áp suất hoạt động rửa giải 175–200 kPa, nhiệt độ lò cột 30 độ , thể tích mẫu 2 ml, chế độ cấp dung môi rửa giải gradient: 0–36 phút 10 phần trăm A – 90 phần trăm B; 36 phút – 100 phần trăm B (dung dịch rửa giải A: metanol, dung dịch rửa giải B: dung dịch axit formic 0,2 phần trăm). Phát hiện được thực hiện bằng UV ở các bước sóng 254, 334, 350, 410, 450 và 550nm. So sánh thời gian lưu, phổ UV và phổ khối thu được với thời gian lưu của các hợp chất tham chiếu được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hóa học trong dịch chiết. Phân tích định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng verbascoside tiêu chuẩnvà echinacoside được phân tích trong cùng điều kiện sắc ký. Đường chuẩn của chúng cho phép tính toán lượng phenylpropanoid của nhauglycoside trong chiết xuất ethanol của cây này. Phương pháp này không được xác thực.

Loài vật

Chuột Webster Thụy Sĩ (20–25g, hai tháng tuổi) đã được sử dụng trong nghiên cứu này (do Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brazil tài trợ). Các con vật được giữ trong điều kiện tiêu chuẩn (chu kỳ sáng-tối là 12 giờ, 22 ± 2 độ và độ ẩm 70–80 phần trăm. Thức ăn và nước uốngtự do quảng cáo). Động vật chỉ nhận được nước để tránh thức ăn can thiệp vào sự hấp thụ chất 12h trước khi bắt đầu thí nghiệm. Thích nghi với các điều kiện phòng thí nghiệm đã xảy ra trong ít nhất 1 h trước mỗi lần kiểm tra. Tất cả các giao thức được thực hiện theo Hướng dẫn về Tiêu chuẩn Đạo đức để Điều tra Đau thử nghiệm ở Động vật và tuân theo các nguyên tắc và hướng dẫn được Hội đồng Quốc gia về Kiểm soátThử nghiệm trên động vật (CONCEA), được phê duyệt bởiViện Khoa học Y sinh/UFRJ, Ủy ban Đạo đức Nghiên cứu Động vật và đã nhận được số DFBCICB015-04/16. Tất cả các giao thức thử nghiệm đã được thực hiện trong giai đoạn ánh sáng. Số lượng động vật trong mỗi nhóm được giữ ở mức tối thiểu và tuân theo các quy tắc từ CONCEA. Vào cuối mỗi thí nghiệm, chuột bị giết do dùng quá liều ketamine/xylazine.

phương pháp điều trị

Trong nghiên cứu này, CSHE được đánh giá ở mức 10, 30 và 100 mg/kg. Dịch chiết được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, Fisher Biotech) để chuẩn bị dung dịch gốc ở 100 mg/ml. PBS được sử dụng làm chất pha loãng để chuẩn bị các liều lượng khác nhau. Dung dịch chứa 10, 30 và 100mg/kg dịch chiết hydroethanol củaC. salsađã được chuẩn bị. Các loại thuốc tiêu chuẩn được sử dụng là morphin 2,5mg/kg (Merck, pha loãng trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS)), axit acetylsalicylic 200mg/kg (Sigma Aldrich, hòa tan với 5M của natri hydroxit(NaOH) trong nước muối 0.9 phần trăm) và capsazepine 10 nMol mỗi chân. Nước muối cộng với DMSO (ở cùng nồng độ như trong phương pháp điều trị cao nhất bằng chiết xuất) được dùng cho nhóm đối chứng âm tính. Tất cả các phương pháp điều trị (chiết xuất thử nghiệm và tiêu chuẩn) đã được quản lý bằng đường uống. Ngoại lệ duy nhất là capsazepine được dùng bằng cách tiêm vào cơ.

Đau cấp tính do formalin gây ra

Một dung dịch 2,5% formalin (37% formaldehyde) đã được tiêm (20ul) ở vùng lòng bàn chân sau bên phải của chuột nhắt 60phút sau khi xử lý (chiết xuất hydroethanol củaC. salsahoặc axit acetylsalicylic 200 mg/kg hoặc morphine 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Các con vật được đặt riêng trong một buồng kính trong suốt và khoảng thời gian tính bằng giây mà chúng liếm chân sau khi tiêm chính thức được ghi lại và phân tích trong hai giai đoạn riêng biệt, giai đoạn đầu của cơn đau thần kinh (0–5 phút sau khi tiêm) và đau do viêm giai đoạn muộn (15–30 phút sau khi tiêm).

Cảm giác buồn ngủ do capsaicin gây ra

Thử nghiệm này dựa trên phương pháp được mô tả bởi Sakurada et al. với một số sửa đổi (Sakurada et al., 1992). Capsaicin (20 ul) C18H27KHÔNG3(Galena, Campinas, SP) được tiêm vào vùng gan bàn chân sau bên phải của chuột (1,6 ug/paw) một giờ sau khi điều trị (chiết xuất hydroethanol củaC. salsahoặc capsazepine 10 nMol/chân). Các con vật được đặt riêng trong buồng kính và (các) thời gian liếm chân được ghi lại trong khoảng từ 0 đến 5phút sau khi tiêm capsaicin và sau đó được phân tích.

Cảm giác buồn ngủ do glutamate gây ra

Trong phương pháp được mô tả bởi Beirith et al. (2002), dung dịch glutamat trong PBS (20 ul) (l-axit glutamic, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/chân) được tiêm vào vùng gan bàn chân sau bên phải của chuột một giờ sau khi điều trị (chiết xuất hydroethanol củaC. salsahoặc morphin 2,5 mg/kg). Các con vật được đặt riêng lẻ trong buồng kính và thời gian liếm chân (giây) được ghi lại trong khoảng từ 0 đến 15 phút sau khi tiêm glutamate và sau đó được phân tích.

Phân tích thống kê

Dữ liệu hóa học được trình bày dưới dạng trung bình ± SD của năm thí nghiệm. Tất cả các nhóm thử nghiệm dược lý bao gồm tối thiểu sáu con chuột. Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) theo sau thử nghiệm của Dunnett cho phép hình dung ý nghĩa thống kê giữa các nhóm bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0.pcác giá trị được coi là đáng kể khi chúng nhỏ hơn 0.05 (p < 0.05).

Thảo luận

Tổng cộng có mười glucoside phenylpropanoid đã được xác định trongC. salsa(phát triển ở Kazakhstan) chiết xuất hydroethanol. Echinacoside (10,98 mg/g), acteoside (9,44 mg/g) và tubuloside B (7,94 mg/g) là những hợp chất chính được xác định. Dữ liệu thu được tương quan với các tài liệu hiện có về các loàinước tiểuđang phát triển ở các khu vực khác nhau của Châu Á (Zhou và cộng sự, 2014, Xie và cộng sự, 2005, Jiang và cộng sự, 2009). Echinacoside và acteoside là những thành phần chính, tạo cơ sở cho việc tiêu chuẩn hóa các loài chính thứcC. sa mạcvàC. tubulosa, được liệt kê trong Dược điển Trung Quốc năm 2005. Chúng tôi đề xuất rằng các hợp chất này cũng có thể được sử dụng để tiêu chuẩn hóaC. salsatấm bia từ Kazakhstan, vì chúng là những chất chính trong chiết xuất hydroethanol được nghiên cứu.

Theo kết quả dược lý của nghiên cứu này, có thể gợi ý rằng CSHE là một tác nhân hiệu quả chống lại chứng đau và viêm thần kinh như đã quan sát thấy trong thử nghiệm chính thức. Đến kiến ​​thức tốt nhất của chúng taC. salsachưa bao giờ được thử nghiệm liên quan đến các hành động chống nhiễm trùng của nó. Một nghiên cứu từ năm 2002 vớiC. sa mạc(Lin et al., 2002) đã chỉ ra rằng cây này thể hiện các hoạt động chống nhiễm trùng và chống viêm khi thử nghiệm trong các mô hình như quằn quại toàn thân, formalin và phù chân. Mặc dù không có nỗ lực điều tra các thành phần chính trong chất chiết xuất có hoạt tính, nhưng họ coi chất chiết xuất butanol và lớp nước là những chất hoạt tính. Không có gì đáng ngạc nhiên khi các dung môi này có mức độ phân cực phù hợp với phenylpropanoidglycoside được tìm thấy trongC. salsa. Hơn nữa, Lin và đồng nghiệp đã xác định rằng hành động chống nhiễm trùng củaC. sa mạcchiết xuất không phải do hoạt động của hợp chất trong thụ thể thuốc phiệnhoặc liên quan đến hệ thống miễn dịch. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chiết xuất giàu phenylpropanoid cho thấy hoạt động trong cả hai giai đoạn của thử nghiệm formalin. Hoạt động quan sát được trên thực tế là do mục tiêu dược lý được điều tra và không phải do bất kỳ sự thay đổi vận động nào có thể xảy ra như được chứng minh bằng thử nghiệm que rota. Kết quả xét nghiệm formalin cho thấy khả năng gây đau thần kinh cũng như đau doCác trung gian gây viêm. Ban đầu, chúng tôi quyết định điều tra con đường đau thần kinh. Vì các hợp chất tương tự từ các loài khác đã được nghiên cứu trước đây không cho thấy bất kỳ hoạt động nào của thụ thể thuốc phiện, nên chúng tôi đã quyết định thử nghiệm các mô hình khác, chẳng hạn như mô hình Glutamate và capsaicin.

Glutamate là một chất dẫn truyền thần kinh hưng phấncó vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cơn đau trong toàn bộ hệ thống thần kinh ngoại biên và trung ương. Hành động này được trung gian bởi các thụ thể glutamate ionotropic ligand-gated(iGluRs) và các thụ thể glutamate metabotropic. Các iGluR có thể được chia thànhN-metyl-d-aspartate (NMDA) và -amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-axit propionic (AMPA) (Kolber, 2015). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi đối kháng thụ thể NMDA và AMPA với ketamine vàkainate, tương ứng, một hiệu ứng chống hấp thu được quan sát thấy. Tuy nhiên, các chất đối kháng nhắm vào các thụ thể này cho đến nay đã gây ra tác dụng phụ đáng kể và vì lý do này, một nghiên cứu mới tập trung vào mGluRs với hy vọng rằng thuốc điều trị qua thụ thể này sẽ gây ra ít tác dụng phụ hơn đã được thực hiện (Palazzo và cộng sự, 2014). Kết quả thử nghiệm CSHE cho thấy phương pháp điều trị này có hiệu quả trong việc giảm đau do glutamate gây ra. Tuy nhiên, vẫn chưa biết liệu hiệu ứng này có được trung gian thông qua các thụ thể ionotropic và/hoặc metabotropic hay không. Morphine là một trong những loại thuốc hiện có có ảnh hưởng đến việc truyền glutamatergic (Deyama et al., 2007). Trong tài liệu đã báo cáo rằng kích hoạt thụ thể glutamate làm tăng phản ứng TRPV1 (Szteyn và cộng sự, 2015). Vì lý do đó, có thể hiệu ứng quan sát được đối với CSHE có thể là do hoạt động trên TRPV1 và không nhất thiết thông qua phản ứng trực tiếp trên các thụ thể glutamate.

Bước tiếp theo của nghiên cứu này là thực hiện thử nghiệm liếm chân bằng cách sử dụng capsaicin làm chất giảm đau, là chất chủ vận thụ thể TRPV1. Kết quả cho thấy CSHE thực sự giảm đau thông qua thụ thể TRPV1.

Trong trường hợp của CSHE, hầu như trong tất cả các phương pháp thử nghiệm, chúng tôi có thể nhận thấy rằng liều 30 mg/kg đạt kết quả tốt hơn so với liều 100 mg/kg. Điều này có thể là do độ bão hòa của dung dịch dẫn đến các hợp chất kết tủa và lượng thuốc sinh khả dụng ít hơn một cách hiệu quả.

Việc xác nhận thành phần hóa học đã thiết lập cho chiết xuất Kazakh CSHE là một bước quan trọng vì các thành phần chính có trong nó đã có tác dụng chống nhiễm trùng/chống nhiễm trùng bằng cách nào đó được xác nhận. Ví dụ, echinacoside được coi là một trong những nguyên tắc hoạt động chịu trách nhiệm cho hoạt động chống nhiễm trùng củaHọ Echinaceae(Hostettmann, 2003). Ngoài ra, một nghiên cứu trước đây của Schapoval và đồng nghiệp (Schapoval et al., 1998) đã chỉ ra rằng acteoside là một trong những nguyên tắc hoạt động chính trong chiết xuất ethanol được điều chế bằngStachytarpheta cayennensisđược đánh giá bằng mô hình phù chân và tấm nóng. Backhouse và đồng nghiệp (Backhouse et al., 2008) cũng coi acteoside là nguyên tắc hoạt động củabuddlejaquả cầusử dụng một số mô hình đánh giá đau, bao gồm cả thử nghiệm chính thức. Các công thức mới hiện đang được phát triển bằng cách sử dụng kiến ​​thức hiện đại nhất để tăng tính ổn định và kéo dài tác dụng chống nhiễm trùng của acteoside (Isacchi et al., 2016).

Phần kết luận

Mười chất có bản chất phenolic đã được xác định trong các tấm bia của người KazakhC. salsabằng phân tích HPLC/MS. Các hợp chất này có thể chịu trách nhiệm về hoạt tính chống hấp thu được quan sát thấy trong các mô hình thử nghiệm được thực hiện ở đây. Cân nhắc rằng trên lãnh thổ của Kazakhstan, chinước tiểuđược đại diện chủ yếu bởi các loàiC. salsa, chúng tôi có thể khuyến nghị thu hoạch và tiêu chuẩn hóa nó bằng cách sử dụng echinacoside và acteoside làm hợp chất tiêu chuẩn, để tạo nguồn nguyên liệu thô chất lượng tốt cho Y học cổ truyền Trung Quốc.