Rõ ràng là không có BMAL1-cơ xương phụ thuộc–Thận chéo ở chuột

CÔNG THỨC THẢO DƯỢC CHO BỆNH THẬN MẠN TÍNH

Từ khóa: gen đồng hồ sinh học; chức năng thận; sinh lý tích hợp

1. Giới thiệu

Nhịp sinh học là nổi bật trong hầu hết các quá trình sinh lý. Việc kiểm soát những nhịp điệu này một phần được trung gian bởi đồng hồ trung tâm nằm trong nhân siêu âm của não, nhưng đồng hồ sinh học ngoại vi cũng ảnh hưởng đến nhịp điệu trong chức năng sinh lý [1]. Đồng hồ phân tử bao gồm một vòng phản hồi phiên mã-dịch mã. Tóm lại, các protein cốt lõi giống như protein giống như chất chuyển vị hạt nhân aryl-hydrocarbon-thụ thể (ARNTL; hoặc BMAL1) và chu kỳ đầu ra vận động sinh học kaput (CLOCK) điều chỉnh tích cực quá trình phiên mã của các gen Thời kỳ và Cryptochrome; các protein Period (PER) và Cryptochrome (CRY) phản hồi và ức chế hoạt động của BMAL1/CLOCK (được xem xét trong [2,3]). Sự gián đoạn của các quá trình kiểm soát sinh học có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm cả bệnh tim mạch và thận [4,5]. Cho đến nay, sự trao đổi chéo giữa các hệ thống cơ quan khác nhau sau sự gián đoạn sinh học có chủ đích vẫn chưa được hiểu rõ. Nghiên cứu này tập trung vào việc loại bỏ protein đồng hồ cốt lõi BMAL1 trong cơ xương và những hậu quả tiềm tàng mà sự gián đoạn đồng hồ này gây ra đối với thận.

Mẫu chuột BMAL1-cảm ứng loại bỏ (iMS-BMAL1 KO) dành riêng cho cơ xương đã được mô tả là có các đặc điểm tương tự như những đặc điểm được thấy ở người già. Những con chuột này có dáng đi bị thay đổi, giảm khả năng vận động, yếu cơ và suy giảm khả năng hấp thu glucose [6,7]. Bệnh thận đồng nghĩa với lão hóa vì tỷ lệ mắc bệnh thận tăng theo tuổi tác [8]. Một đặc điểm khác được báo cáo ở chuột iMS-BMAL1 KO là chúng có biểu hiện tăng vôi hóa gân [6]. Vai trò của thận trong cân bằng axit-bazơ và cân bằng nội môi khoáng chất liên quan trực tiếp đến sức khỏe của xương với bệnh thận. Do đó, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng chuột iMS-BMAL1 KO có khả năng là mô hình cho bệnh thận.

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định xem liệu sự gián đoạn đồng hồ trong cơ xương có dẫn đến rối loạn chức năng thận hay không. Việc xóa BMAL1 trong cơ xương gây ra sự gia tăng các dấu hiệu viêm ở thận. Tuy nhiên, chức năng thận cũng như mô học thận dường như không bị ảnh hưởng bởi iMS-BMAL1 KO. Những dữ liệu này cho thấy hậu quả của sự gián đoạn đồng hồ trong cơ xương dẫn đến những thay đổi tối thiểu ở thận trong các điều kiện được thử nghiệm.

2. Vật liệu và phương pháp

Động vật. Mô hình chuột được sử dụng trong nghiên cứu này được tạo ra bằng cách sử dụng chuột BMAL1 exon 8 nổi [9] được lai với chuột Cre-recombinase dành riêng cho cơ xương (bộ xương người Actin–Cre). Cre được kích hoạt bằng cách tiêm tamoxifen (được làm bằng 15% ethanol trong dầu hạt hướng dương) 5 tuần trước khi nghiên cứu (2 mg/ngày; 5 ngày ip.) để tạo ra iMS BMAL1 KO. Chuột Cre + được tiêm phương tiện (15% ethanol trong dầu hạt hướng dương) được sử dụng làm đối chứng. Những con chuột đực còn trinh được nghiên cứu lúc 17–19 tuần và những con chuột già được nghiên cứu lúc 13–14 tháng. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện bởi Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia về Chăm sóc và Sử dụng Động vật trong Phòng thí nghiệm và được phê duyệt và giám sát bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Florida và Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Cơ quan Quản lý Cựu chiến binh Bắc Florida / Nam Georgia. Chuột được nhốt trong phòng có nhiệt độ (20–26 ◦C) và được kiểm soát độ ẩm, 12:12 giờ sáng-tối. Chuột được cung cấp quyền truy cập tự do vào nước và chow loài gặm nhấm protein 18% tiêu chuẩn (số 2918, Harlan Teklad / Envigo, Madison, WI, USA) trừ khi có ghi chú khác.

Nghiên cứu lồng trao đổi chất. Một nhóm chuột đực non (5 đối chứng và 5 KS-BMAL1 KO) được duy trì trong các lồng trao đổi chất để thu thập nước tiểu và theo dõi lượng thức ăn/nước uống [10]. Chế độ ăn dạng gel dạng bột (Envigo Teklad Custom Diet) chứa 1% agar đã được chuẩn bị và sử dụng trong suốt quá trình thu thập lồng trao đổi chất. Chuột được cho 3 ngày để thích nghi với các lồng trao đổi chất trước khi bắt đầu thu thập chế độ ăn đối chứng ({{10}},25% NaCl; 0,6% K; Envigo 99131). Sau một ngày ghi lại bằng chế độ ăn đối chứng, chuột được điều trị bằng chế độ ăn thiếu kali (0,25% NaCl; 0,0001% K; Envigo 99134) trong năm ngày. Các mẫu nước tiểu được thu thập 12 giờ một lần vào cuối thời gian ban ngày và ban đêm (thời gian Zeitgeber 0 và 12). Lượng nước tiểu, lượng thức ăn và lượng nước uống đều được ghi lại. Nồng độ chất điện giải trong nước tiểu được đo bằng quang kế ngọn lửa (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuột đã được phú dưỡng và mô được thu thập vào thời điểm Zeitgeber 6.

Thành phần cơ thể. Thành phần cơ thể đã được định lượng ở những con chuột đực còn tỉnh táo trước và năm ngày sau khi áp dụng chế độ ăn thiếu kali. Các phép đo được thực hiện vào thời điểm Zeitgeber 4–6 bằng cách sử dụng Máy phân tích thành phần cơ thể cộng hưởng từ định lượng EchoMRI (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Giao thức nâng cao giai đoạn. Một nhóm chuột đực già riêng biệt được nhốt riêng lẻ trong các lồng được trang bị bánh xe chạy với khả năng tiếp cận tự do với chow (số 2918, Harlan Teklad) và nước. Các lồng được bảo quản trong hộp điều khiển ánh sáng với sự trao đổi không khí liên tục (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). Lịch trình chiếu sáng được duy trì theo chu kỳ sáng-tối 12:12 giờ sử dụng nguồn sáng LED màu xanh lá cây (~200 lux). Sau một tuần ban đầu, chu kỳ tối tăng thêm 7 giờ và chuột được duy trì theo lịch trình chu kỳ sáng-tối mới 12:12 giờ này trong một tuần. Quá trình này được lặp lại lần thứ hai để tạo ra giai đoạn tăng tốc 14-h. Chuột đã được tiêu hủy vào thời điểm Zeitbeger 2 theo nhóm 2–3 và mô được thu thập 7–10 ngày sau tuần thứ hai của giai đoạn trước.

Tính đặc hiệu của sự tái tổ hợp Để xác nhận tính đặc hiệu của tái tổ hợp Bmal1, chúng tôi đã hoàn thành PCR bằng cách sử dụng 40 ng DNA bộ gen của cơ xương và các đoạn mồi cho các alen tái tổ hợp và không tái tổ hợp. (mồi fwd: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, mồi tái tổ hợp: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, mồi tái tổ hợp: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Các đoạn mồi tiến và lùi của alen Bmal1 nổi tạo ra sản phẩm 431-bp. Đoạn mồi chuyển tiếp thứ hai 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 được đưa vào để phát hiện sản phẩm tái tổ hợp, hiển thị dải tần ở 572 bp. Các sản phẩm phản ứng PCR được chạy trên gel agarose 1,7% và việc xác định dải gen và dải đặc hiệu tái tổ hợp đã xác nhận tất cả động vật được điều trị bằng tamoxifen đều là KO đặc hiệu mô như đã mô tả trước đây [7,12].

Hóa mô miễn dịch. Sau khi gây mê bằng isoflurane dạng hít, thận phải được thu thập và ngay lập tức cắt đôi theo chiều ngang sau đó được bảo quản trong Periodate-lysine-2% paraformaldehyde trong khoảng 48 giờ ở 4 ◦C. Chất lỏng sau đó được đổi thành PBS để chuẩn bị xử lý. Các mẫu thận của mỗi con vật được nhúng vào parafin và các phần dày 4-micromet được cắt và gắn trên các phiến kính. Các phần được nhuộm bằng hematoxylin và eosin hoặc được nhuộm bằng chất nền tạo màu 3,30 -diaminobenzidine (Vector) để nhắm mục tiêu BMAL1 (Tín hiệu tế bào D2L7G; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, Hoa Kỳ). Các phần được quan sát bằng kính hiển vi ánh sáng (Nikon E600 được trang bị máy ảnh kỹ thuật số Nikon DXM1200F, Melville, New York, NY, USA). Mã định danh nhómđã được loại bỏ khỏi mỗi slide và biểu hiện BMAL1 đã được kiểm tra hoặc các slide được tính điểm về tổn thương ống thận bằng cách sử dụng các tiêu chí sau: tỷ lệ phần trăm ống thận có dấu hiệu hoại tử ống thận, thiếu đường viền bàn chải, giãn ống thận và hình thành phôi protein.

được ủ với kháng thể thứ cấp kháng thỏ kết hợp với cải ngựa-peroxidase. Sau lần rửa bổ sung bằng TBS-T trong 30 phút, quá trình phát hiện được thực hiện bằng thuốc thử SignalFire ECL (Công nghệ tín hiệu tế bào) với thời gian phơi sáng 30 giây để chụp ảnh. Phép đo mật độ được thực hiện bằng cách sử dụng Fiji và lượng protein dồi dào đã được chuẩn hóa thành nhuộm Ponceau.

Xét nghiệm miễn dịch đa bội. Vùng vỏ và tủy được mổ xẻ từ nửa quả thận ở chuột đực già. Mô được đồng nhất hóa trong 300 µL (vỏ não) hoặc 250 µL (tủy) dung dịch đệm (hỗn hợp chất ức chế protease–phosphatase 1% (Thermo Scientific) 1% 1 M axit ethylenediaminetetraacetic, 0,1% Tween 20 trong phosphate- nước muối đệm). Nồng độ protein cho từng mẫu được xác định bằng BCA (Pierce, Thermo Scientific). Các chất đồng nhất được đo trùng lặp cho các chất phân tích đã chọn bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm miễn dịch ghép kênh thương mại (MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K của cat# và MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma) trên MILLIPLEX® Hệ thống phân tích 3.1 xPONENT (Luminex 200, Austin, TX, USA) với khả năng phân tích dữ liệu qua phần mềm MILLIPLEX Analyst. CV nội bộ trung bình là<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Phân lập ty thể thận và đo hô hấp. Mô vỏ thận tươi được mổ xẻ từ chuột sau giai đoạn trước. Ty thể được phân lập bằng cách sử dụng Bộ cách ly ty thể cho mô (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ protein của chế phẩm ty thể được xác định bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm protein BCA (Pierce, Thermo Scientific). Quá trình hô hấp của ty thể của chủng phân lập được xác định thành hai lần trong buồng xylograph đã hiệu chuẩn trước đó được duy trì ở 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Áo) có chứa đệm hô hấp (MiR05; 0.5 mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM axit lacto bionic, 20 mM taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sucrose và 1 g/L BSA về cơ bản không chứa axit béo, pH 7,1) [13]. Nồng độ oxy của đệm hô hấp được giữ ở mức bão hòa không khí (~200 µM) và 50 µM. Tốc độ tiêu thụ oxy (OCR; ρmol O2/s/mg protein ty thể) được đo bằng cách sử dụng giao thức chuẩn độ chất ức chế-tách-chất ức chế cơ chất (SUIT) sau đây (nồng độ của thuốc thử ghi trong ngoặc đơn là cuối cùng trong các buồng): (1) LEAK (L ) được đánh giá sau khi kích thích chu trình TCA với các chất nền được liên kết với NADH pyruvate (5 mM), malate (2 mM) và glutamate (10 mM) để hỗ trợ dòng điện tử qua phức hợp I (CI) của hệ thống vận chuyển điện tử (ETS; E ); (2) quá trình phosphoryl oxy hóa (OXPHOS; P) được kích thích bằng adenosine diphosphate (ADP; 2,5 mM) và được ghi là PCI; (3) bổ sung dòng điện tử hội tụ được hỗ trợ succinate (10 mM) qua các phức I và II của ETS (PCI+II); (4) chất lượng của việc chuẩn bị ty thể được đánh giá thông qua kiểm tra tính toàn vẹn màng ngoài của ty thể bằng cách thêm cytochrome c (10 µM); (5) carbonyl xyanua tách rời 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP; 0,5 µL bước của dung dịch gốc 0,1 mM) được chuẩn độ từng bước cho đến khi đạt được mức hô hấp tách rời tối đa và được ghi lại là công suất ETS tối đa (ECI+ II); (6) việc bổ sung phức hợp I bị ức chế rotenone (0,5 µM) của ETS và OCR còn lại được ghi nhận là công suất ETS tối đa được hỗ trợ bởi chất nền II phức hợp (ECII); (7) việc bổ sung antimycin A (2,5 µM) đã ức chế phức hợp III của ETS và do đó tất cả sự vận chuyển điện tử đến phức hợp IV, và OCR còn lại được ghi nhận là mức tiêu thụ oxy dư, không phải ty thể (ROX) và bị trừ khỏi tất cả các OCR trước đó ; (8) sự tiêu thụ oxy sau đó được kích thích trở lại bằng việc bổ sung N,N,N0 ,N0 -Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD; 0,5 mM; với sự có mặt của ascorbate (2 mM) để tránh quá trình tự oxy hóa không kiểm soát được của TMPD) làm chất nền nhân tạo để khử cytochrome c; (9) tốc độ oxy hóa nền hóa học khi có mặt TMPD/ascorbate được đánh giá bằng cách thêm chất ức chế IV phức tạp natri azide (100mM), và được trừ khỏi dòng trước đó, dẫn đến khả năng hoạt động của cytochrome c oxidase (ECIV) tối đa. Dữ liệu tiêu thụ oxy được thu thập và phân tích bằng DatLab so với 7.4 (Dụng cụ Oroboros). Tỷ lệ kiểm soát thông lượng (FCR) được tính bằng mức tiêu thụ oxy ở bất kỳ trạng thái hô hấp nhất định nào so với công suất ETS tối đa (ECI+II).

Dòng tế bào học. Mô phổi đã được tiêu hóa và phân tích tế bào học dòng chảy được thực hiện như mô tả trước đây [14].

Phân tích thống kê. Dữ liệu đồ họa được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. ANOVA hai chiều, với các biện pháp lặp đi lặp lại khi có thể, được sử dụng để phân tích sự khác biệt giữa bốn nhóm. Thử nghiệm so sánh nhiều lần của Sidak được sử dụng để so sánh các nhóm chuột với các nhóm điều trị. Bài kiểm tra t của sinh viên được sử dụng để so sánh hai nhóm. Phân tích được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 9.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Ý nghĩa thống kê được xác định là p < 0.05.

Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950