Phản ứng sinh hóa và mô bệnh học của Biomphalaria Alexandrina đối với RIPEX (Chất điều hòa sinh trưởng thực vật)Ⅰ

trừu tượng

Lý lịch

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để tăng tốc độ sinh trưởng và chín của thực vật, nhưng chúng gây nguy hiểm cho hệ sinh thái dưới nước. Nghiên cứu hiện tại đã đánh giá tác động của việc tiếp xúc dưới mức gây tử vong với nồng độ RIPEX 48 phần trăm EC (8 và 16 µL/L) đối với các thông số stress oxy hóa, hormone giới tính, các enzym có khả năng miễn dịch, số lượng tế bào máu khác nhau và mô bệnh học của các tuyến tiêu hóa và tinh hoàn ở Ốc sên Biomphalaria alexandrina.

Nhấn vào đây để cistanche herba cho testosterone

Kết quả

Phơi nhiễm RIPEX gây ra sự gia tăng tổng thể các hoạt động của Superoxide dismutase và Glutathione-S-Transferase ở B. Alexandrina. Tuy nhiên, việc tiếp xúc quá nhiều với RIPEX sẽ ức chế hoạt động SOD ở ốc sên. Hoạt động của malondialdehyd cho thấy sự gia tăng B. Alexandrina khi tiếp xúc với cả hai nồng độ sau tất cả các giai đoạn tiếp xúc. RIPEX cũng gây ra sự gia tăng đáng kể testosterone ở ốc sên tiếp xúc với 16 µL/L, tuy nhiên, nó đã làm giảm nồng độ hormone ở ốc sên tiếp xúc với 8 µL/L sau 7 ngày. Về estradiol, có sự gia tăng đáng kể sau 3 ngày tiếp xúc với 16 µl/L và 7 ngày tiếp xúc với 8 µL/L. Tiếp xúc với RIPEX cũng làm tăng hoạt động của các enzym Myeloperoxidase và Adenosine deaminase trong tuyến tiêu hóa của ốc sên. Nó làm tăng tổng số lượng tế bào máu của những con ốc sên bị phơi nhiễm cũng như số lượng bạch cầu hạt. Các tuyến tiêu hóa và tinh hoàn trứng của ốc sên cho thấy những thay đổi bệnh lý sau 7 ngày tiếp xúc với RIPEX.

kết luận

Những phát hiện này cho thấy rằng RIPEX gây độc đối với B. Alexandrina và loài ốc này có thể được sử dụng làm chất chỉ thị sinh học đối với ô nhiễm môi trường với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

từ khóa

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosterone, Estradiol, Myeloperoxidase, Adenosine deaminase, Mô bệnh học

1. Bối cảnh

Ô nhiễm hóa chất nông nghiệp của nước mặt là mối quan tâm môi trường toàn cầu ngày càng tăng, đặc biệt là ở những khu vực nơi nông nghiệp đang mở rộng và tăng cường nhanh chóng. Nhiều hóa chất tổng hợp khác nhau, chẳng hạn như thuốc trừ sâu hoặc phân bón, được sử dụng để thay đổi số lượng và chất lượng cây trồng nhằm đáp ứng nhu cầu của khách hàng [7, 40]. Chất kích thích tăng trưởng thực vật là hóa chất nông nghiệp phổ biến ở nhiều quốc gia [18].

Khi các hóa chất này được hít trực tiếp hoặc tiêu thụ cùng với rau bị ô nhiễm, chúng sẽ gây hại cho sức khỏe con người [39]. Thuốc trừ sâu phốt pho hữu cơ, ethephon (2-axit chloroethyl phosphonic) là một hóa chất tổng hợp giải phóng ethylene thường được sử dụng làm chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) để thúc đẩy quá trình ra hoa, làm chín trái cây và các phản ứng sinh lý khác. Nó được phê duyệt để sử dụng trên nhiều loại thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, phi thực phẩm, vườn ươm nhà kính và cây cảnh trồng ngoài trời [3, 50]. Đánh giá trong phòng thí nghiệm về độc tính của ethephon đã chứng minh rằng ethephon gây ra các dị tật về hình thái của râu thứ hai, lông cảm giác, gai đuôi và mào của Daphnia magna dẫn đến mất chức năng và tử vong [54].

Abd-El Azeem [1] đã ghi nhận sự giảm tốc độ tăng trưởng, tổn thương DNA và tác động chết theo chương trình trong các tế bào tuyến tiêu hóa của sên Deroceras reticulatum sau khi tiếp xúc với ethephon. Nhiều tác giả đã công nhận độc tính của Ethephon trên chuột và chim [2, 17, 55]. Hơn nữa, việc tiếp xúc với ethephon gây ra nhiễm độc gen, stress oxy hóa và độc tính sinh sản ở chuột [16]. Tính sinh quái thai và rối loạn chức năng hệ sinh dục ở chuột cũng có liên quan đến việc tiếp xúc với ethephon [2, 16]. Ethephon cũng đã được chứng minh là gây độc miễn dịch, có tác dụng gây đột biến [26], làm tăng căng thẳng oxy hóa và làm giảm nồng độ axit deoxyribonucleic và axit Ribonucleic [4].

Ethephon trong các vùng nước có thể gây nguy hiểm cho hệ động vật thủy sinh; tuy nhiên, dữ liệu về tác động của nó đối với các sinh vật dưới nước rất khan hiếm. Một số loài thủy sinh đã được sử dụng để phát hiện hormone tăng trưởng thực vật trong các hệ thống thủy sinh. Tuy nhiên, một số sinh vật này rất khó thao tác và duy trì trong phòng thí nghiệm, khiến chúng khó sử dụng hơn trong các đánh giá độc tính sinh thái [54]. Các loài nhuyễn thể thủy sinh, bao gồm cả ốc sên, gần đây đã được chú ý như những sinh vật thử nghiệm do nhu cầu phát triển các mô hình động vật không xương sống để giám sát môi trường các chất gây ô nhiễm thủy sinh [21, 45]. Ốc sên là nhóm động vật thân mềm phong phú nhất trong các hệ thủy sinh. Ốc sên là một chất thay thế ít mang tính bóc lột hơn so với các động vật có xương sống bậc cao như là chất chỉ thị sinh học vì chúng có thể được sử dụng trong nhiều thí nghiệm mà không cần sự chấp thuận về mặt đạo đức, đồng thời việc mua và bảo trì chúng không tốn kém [13].

Về mặt này, ốc Biomphalaria alexandrina đã được sử dụng rộng rãi như một sinh vật chỉ thị ô nhiễm nước ngọt do thuốc trừ sâu [29, 30]. Ngoài tiềm năng là một chất chỉ thị sinh học, loài ốc này đóng vai trò là vật chủ trung gian để truyền Schistosoma mansoni [35]. Do đó, nồng độ hóa chất nông nghiệp trong môi trường có thể ảnh hưởng đến sự lây truyền bệnh sán máng thông qua các tác động trực tiếp và gián tiếp lên vật chủ trung gian và mật độ ký sinh trùng [27]. Cuộc điều tra hiện tại nhằm mục đích điều tra tác động của việc tiếp xúc dưới mức gây tử vong với chất điều hòa sinh trưởng thực vật, RIPEX 48% EC (tên thương mại của ethephon, 2-axit chloroethyl phosphonic) đối với các khía cạnh sinh hóa, miễn dịch và mô học khác nhau của B. alexandrina ốc như một sinh vật chỉ thị sinh học.

2 phương pháp

2.1 Sinh vật thử nghiệm

Ốc sên Biomphalaria alexandrina được thu thập từ Hồ Manzalah nằm ở El-Matareya, Tỉnh Dakahlia, Ai Cập (31 độ 11′ N 32 độ 2′ E) và được duy trì trong nước máy được sục khí tốt ở nhiệt độ không đổi 20 độ. Họ được cho ăn lá rau diếp tươi hàng ngày. Sau khi duy trì 4 tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm, những con ốc trưởng thành khỏe mạnh (đường kính vỏ 10–12 mm) đã được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

2.2 Vật liệu thí nghiệm và điều kiện tiếp xúc

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật, RIPEX (dạng dung dịch chứa 48% ethephon [2- chloroethyl phosphonic acid (C2H6ClO3P)] và 52% thành phần trơ) được mua từ Chema Industries (thành phố New Nubaria, Behira, Ai Cập; giấy phép đăng ký số .1840). Một loạt các nồng độ đã được chuẩn bị. Bản sao cây với mười con ốc sên đã được phơi bày. Sau 1-ngày tiếp xúc, số ốc chết được đếm và loại bỏ, LC50 và LC90 được tính toán bằng phần mềm thống kê của khoa học xã hội (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Thiết kế thí nghiệm

Hai nồng độ dưới mức gây chết đại diện cho LC10 và LC20 đã được sử dụng (8 và 16 µL/L). 90 con ốc sên được chia thành ba nhóm, mỗi nhóm có ba lần lặp lại (mười con ốc sên/lần lặp lại): nhóm đối chứng, nhóm tiếp xúc với 8 µL/L và nhóm tiếp xúc với 16 µL/L. Vào các khoảng thời gian 1-, 3- và 7-ngày, các dấu ấn sinh học do stress oxy hóa và các enzym có khả năng miễn dịch được đánh giá trong tuyến tiêu hóa. hormone steroid đã được đánh giá trong Ovotestis. Số lượng tế bào máu khác biệt, và mô học của các tuyến tiêu hóa và buồng trứng đã được đánh giá. Đối với các nghiên cứu sinh hóa, 0,5 g mô (tuyến tiêu hóa hoặc tinh hoàn) từ mỗi nhóm được đồng nhất hóa trong 0,5 mL dung dịch đệm phốt phát (pH 6,5) bằng thiết bị đồng nhất thủy tinh và ly tâm ở 10,000×g, 4 độ trong 10 phút . Các chất nổi trên bề mặt thu được đã được sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.

2.4 Xác định các dấu hiệu stress oxy hóa

2.4.1 Superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1)

Hoạt động SOD được xác định bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm EnzyChrom™ Superoxide Dismutase (Cat. No: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dịch đồng nhất của mô sử dụng dung dịch đệm ly giải lạnh (50 mM kali photphat, 0,1 mM EDTA và 0,5% Triton X-100) được ly tâm ở 12,000g trong 5 phút ở 4 độ , và phần nổi phía trên được thu thập để xác định SOD [43]. Hoạt tính của SOD được đo ở mật độ quang (OD) ở 440nm.

2.4.2 Glutathione‑S‑Transferase (GST, EC 2.5.1.18)

Enzyme này xúc tác sự liên hợp GSH với {{0}}chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Nó được đo quang phổ ở bước sóng 340 nm. Hỗn hợp phản ứng chứa dung dịch đệm Kali photphat 0,1 M, pH 6,5, GSH được hòa tan trong dung dịch đệm kali photphat (140 mg/100 mL) và CDNB 4 mg/ml trong rượu etylic. Một đơn vị hoạt động của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác cho sự hình thành 1 μmole S-liên hợp mỗi phút [11].

2.4.3 Malondialdehyde (MDA)

Malondialdehyd trong toàn bộ chất đồng nhất được xác định là chất phản ứng axit thiobarbituric (TBARS) theo phương pháp tiêu chuẩn của Ohkawa et al. [37]. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0.1 mL chất đồng nhất của mô, một thể tích tương đương dung dịch Natri Dodecyl Sulfate, 0.75 mL axit axetic, 0.75 mL axit thiobarbituric, và 0.3 mL nước cất. Các thành phần này được trộn trong một máy xoáy và ủ trong bể nước sôi trong 1 giờ sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Mười 0.5 mL nước cất và 2,5 mL n-butanol được thêm vào mỗi ống và trộn mạnh bằng máy xoáy sau đó quay trong máy ly tâm ở 2.500 × g trong 10 phút. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 532 nm.

2.5 Xác định nội tiết tố

2.5.1 Testosterone

Testosterone được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme (ELISA) testosterone (Cat. No: ADI-900-065; Enzo Life Science, NY, USA), Testosterone là androgen chính ảnh hưởng đến cả sự phát triển tình dục sơ cấp và thứ cấp như ham muốn tình dục. 100 µL chất pha loãng tiêu chuẩn (đệm xét nghiệm 3 hoặc môi trường nuôi cấy mô) được hút vào các giếng gắn kết không đặc hiệu và giếng gắn kết tối đa (tiêu chuẩn 0 pg/mL). Sau đó, 100 µL chất chuẩn #1 đến #5 vào các giếng thích hợp. Mẫu (100 µL) được hút vào các giếng thích hợp và 50 µL dung dịch đệm xét nghiệm 3 vào các giếng liên kết không đặc hiệu. Ngoài ra, 50 µL kháng thể màu vàng cũng được thêm vào mỗi giếng, ngoại trừ giếng trống, hoạt tính toàn phần và giếng liên kết không đặc hiệu. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trên máy lắc đĩa trong 1 giờ với tốc độ 500 vòng / phút. Sau đó, 50 µL chất liên hợp màu xanh lam được thêm vào mỗi giếng, ngoại trừ hoạt độ toàn phần và các giếng trống. Sau khi làm rỗng các giếng khỏi nội dung, quá trình rửa được thực hiện bằng cách thêm 400 µL dung dịch rửa vào mỗi giếng 3 lần. Chất liên hợp màu xanh lam (5 µL) được bổ sung vào tổng số giếng hoạt động và 200 µL dung dịch p-nitrophenyl phosphate được bổ sung vào mỗi giếng và ủ ở 37 độ trong 1 giờ mà không lắc. Việc đọc bản ở bước sóng 405 nm được thực hiện sau khi thêm 50 µL dung dịch dừng vào mỗi giếng [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol được xác định bằng cách sử dụng bộ estradiol ELIZA (Cat. No: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) theo các giao thức của nhà sản xuất. Nguyên tắc của phản ứng này dựa trên nồng độ của chất đánh dấu estradiol acetylcholinesterase (AChE) là không đổi, nhưng nồng độ estradiol tự nhiên thay đổi, do đó lượng chất đánh dấu estradiol acetylcholinesterase (AChE) liên kết với kháng huyết thanh estradiol tỷ lệ nghịch với nồng độ của estradiol tự nhiên trong giếng. Bộ đệm ELISA 100 µL đã được thêm vào các giếng gắn kết không đặc hiệu và giếng gắn kết tối đa. Thêm 50 µL từ ống số 8 vào cả hai giếng tiêu chuẩn thấp nhất (Tiêu chuẩn 8) và 50 µL từ ống số 7 vào mỗi giếng tiêu chuẩn tiếp theo (Tiêu chuẩn 7). Một mẫu (50 µL) được thêm vào từng giếng. Chất đánh dấu Estradiol AChE (50 µL) đã được thêm vào mỗi hoạt tính tổng và các giếng trống. Sau đó, kháng huyết thanh Estradiol ELISA (50 µL) được thêm vào từng giếng ngoại trừ tổng hoạt tính, liên kết không đặc hiệu và giếng trống. Sau khi ủ trong máy lắc quỹ đạo (2 giờ ở nhiệt độ phòng), độ hấp thụ được đo ở bước sóng 414 nm [52].

2.6 Xác định enzym tiềm năng miễn dịch

2.6.1 Myeloperoxidase (MPO, EC 1.11.2.2)

Một đơn vị hoạt động MPO được định nghĩa là lượng enzyme thủy phân chất nền và tạo ra taurine chloramine để tiêu thụ 1.0 μmole TNB mỗi phút ở 25 độ . MPO được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm hoạt động đo màu myeloperoxidase (Cat. No: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 412 nm.

2.6.2 Adenosine deaminase (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA là một enzyme xúc tác quá trình chuyển đổi adenosine và 2'-deoxyadenosine thành inosine và 2'-deoxyinosine. ADA được xác định theo các nguyên tắc của bộ xét nghiệm hoạt tính adenosine deaminase trong bản tin kỹ thuật (Mã số: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Đức). Một đơn vị adenosine deaminase là lượng enzyme thủy phân adenosine để tạo ra 1,0 μmol inosine mỗi phút ở 37 độ. Thuốc thử là dung dịch đệm xét nghiệm 1×ADA (41 μL), Bộ chuyển đổi ADA (2 μL), chất phát triển ADA (2 μL) và chất nền ADA (5 μL).

2.7 Số lượng tế bào máu chênh lệch

Hemolymph được thu thập từ ốc sên (đối chứng, phơi nhiễm) theo Sminia [47]. Sau khi bị pipet Pasteur chạm vào đầu và chân, con ốc sên buộc phải rút sâu vào trong vỏ của nó và tống máu ra ngoài, chất này được thu thập để phân tích số lượng tế bào máu. Hemolymph được bôi trên phiến kính hiển vi để lây lan. Sau khi cố định trong metanol 99,8% trong 5 phút, phiến kính được xoay ở góc 45 độ để làm khô ở nhiệt độ phòng và nhuộm bằng vết Giemsa trong 20 phút. Sự biệt hóa của các tế bào máu được xác định tỷ lệ thuận với việc đếm 100.

2.8 Điều tra mô học

Kiểm tra mô học được thực hiện sau 7 ngày tiếp xúc với 8 và 16 µL/L RIPEX. Các tuyến tiêu hóa và ovotestis đã được mổ xẻ và ngay lập tức cố định trong chất lỏng Bouin᾿s. Sau 1 ngày cố định, các mẫu sau đó được khử nước thông qua một loạt rượu và được làm sạch trong xylene. Khối sáp paraffin đã được thực hiện [42]. Mười giáo phái. (độ dày 5–7 μm) được cắt và nhuộm bằng hematoxylin và eosin (Mayer's H và E). Việc nhuộm màu được thực hiện bằng cách rửa kỹ bằng nước máy. Các phần mô học được chụp bằng máy ảnh tự động chụp ảnh (Optika, Ý).

2.9 Phân tích thống kê

Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn và được phân tích bằng phần mềm thống kê của khoa học xã hội (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Phân tích phương sai ANOVA hai chiều được sử dụng để xác định sự khác biệt giữa nhóm đối chứng và nhóm tiếp xúc, giữa các nồng độ khác nhau và thời điểm tiếp xúc. Mức ý nghĩa được đặt ở p Nhỏ hơn hoặc bằng 0.05.

Cơ chế của Cistanche tăng tác dụng testosterone

Cistanche đã được tìm thấy để tăng mức testosterone theo nhiều cách. Đầu tiên, nó chứa các hợp chất được gọi là echinacoside và acteoside, đã được chứng minh là giúp tăng cường sản xuất hormone luteinizing (LH) trong tuyến yên. LH kích thích các tế bào Leydig trong tinh hoàn sản xuất testosterone. Cistanche cũng chứa polysacarit và phenylethanoid glycoside, đã được chứng minh là có đặc tính chống oxy hóa và chống viêm. Điều này có thể giúp giảm căng thẳng oxy hóa và viêm ở tinh hoàn, vốn có thể làm giảm sản xuất testosterone Ngoài ra, Cistanche đã được phát hiện là làm tăng sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tổng hợp testosterone và giảm hoạt động của các enzym phân hủy testosterone, chẳng hạn như {{1} }alpha-reductase. Nhìn chung, sự kết hợp của các cơ chế này được cho là góp phần vào tác dụng tăng cường testosterone của Cistanche.

Hoda H. Abdel‑Azeem1*, Azza H. Mohamed1 và Mohamed R. Habib2