Sự thiếu hụt calreticulin làm rối loạn sự hình thành sinh học của Ribosome và dẫn đến chậm phát triển thận ở phôi thai

edmund.chen@wecistanche.com

trừu tượng

Sự hình thành thận được thúc đẩy bởi các con đường tín hiệu phức tạp kiểm soát sự phát triển và biệt hóa của tế bào. Lưới nội chất chaperone calreticulin (Calr) nổi tiếng với chức năng lưu trữ canxi và gấp glycoprotein. Vai trò của nó trongquả thậnsự phát triển vẫn chưa được hiểu rõ. Chúng tôi cung cấp bằng chứng cho vai trò quan trọng của Calr đối với sự hình thành thận trong cuộc điều tra này. Chúng tôi chỉ ra rằng sự thiếu hụt Calr dẫn đến sự hình thành gián đoạn của một vùng thận nguyên vẹn và làm chậm quá trình hình thành thận, bằng chứng là sự xáo trộn trong việc hình thành các cơ thể hình dấu phẩy và hình chữ s. Sử dụng phương pháp tiếp cận proteomics và transcriptomics, chúng tôi đã chứng minh rằng ngoài sự thay đổi trong các protein quan trọng phát tín hiệu Wnt, phôithậntừ Calr // cho thấy sự suy giảm tổng thể trong sự biểu hiện của các protein ribosome, điều này cho thấy những rối loạn trong tổng hợp protein và sự hình thành thận. Loại trực tiếp qua trung gian CRISPR / cas9 xác nhận rằng sự thiếu hụt Calr có liên quan đến sự thiếu hụt một số protein ribosome và các protein quan trọng trong quá trình sinh ribosome. Dữ liệu của chúng tôi làm nổi bật mối liên hệ trực tiếp giữa biểu hiện Calr và quá trình tạo sinh ribosome.

Giới thiệu

Quả thậnsự phát sinh cơ quan được đặc trưng bởi sự liên tiếp của các sự kiện di truyền hình thái được thúc đẩy bởi sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào. Trong quá trình hình thành thận, chuyển tiếp trung mô-biểu mô (MET) và phân nhánh chồi niệu quản (UB), là kết quả của cảm ứng tương hỗ giữa UB và trung mô metanephric (MM) [1], là động lực cho sự hình thành nephron. Trong quá trình này, sự tương tác phức tạp và tương hỗ của các con đường tín hiệu khác nhau là cần thiết để điều hòa sự biệt hóa biểu mô và sự hình thành nephron [1–3]. Trong số các con đường quan trọng của quá trình này, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ glia (Gdnf) truyền tín hiệu thông qua thụ thể Ret của nó đóng vai trò trung tâm trong quá trình gọi là nảy chồi niệu quản. Sự gián đoạn của tín hiệu này có thể gây ra niệu quản ngoài tử cung hoặcthậntuổi phát sinh khi hoàn toàn không có tín hiệu [4]. Ngoài tín hiệu Gdnf / Ret, báo hiệu Wnt / -catenin chuẩn được biết là phối hợp nhiều khía cạnh củathậnsự phát triển trong cả MM và UB [5] và sự ức chế tín hiệu Wnt kinh điển trong dòng chồi niệu quản và progenitors nephron dẫn đếnthậntuổi thành niên [6]. Việc duy trì quá trình tái lập trình phiên mã trong quá trình hình thành thận phụ thuộc vào khả năng tiếp cận của chất nhiễm sắc [7]. Chúng tôi đã chứng minh rằng các protein dị nhiễm sắc, được biết là tham gia vào quá trình điều hòa biểu sinh của sự im lặng của gen, là yếu tố không thể thiếu để duy trì sự cân bằng giữa chất hoạt hóa phân nhánh và chất ức chế trong giai đoạn đầu của sự phát triển [7].

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL

Calreticulin (Calr) là một chaperone riêng lẻ của lưới nội chất (ER) với khả năng liên kết canxi cao và ái lực thấp, rất quan trọng đối với việc hấp thụ Ca2 cộng với ER và các quá trình tế bào khác nhau bao gồm truyền tín hiệu, biểu hiện gen và buôn bán protein. [8,9]. Các cơ chế giải quyết vai trò của Calr trong các bệnh chủ yếu dựa trên việc thải Ca2 cộng với vùng đầu C-gắn với Ca2 của Calr và vai trò của nó trong phản ứng protein mở ra (UPR) [10,11]. UPR có thể đóng một vai trò bảo vệ tế bào trong một thử thách với các protein bị gấp khúc sai hoặc có thể gây bất lợi cho các tế bào do quá trình apoptosis gây ra tín hiệu UPR kéo dài. Mặc dù có rất ít nghiên cứu đề cập đến vai trò tiềm ẩn của Calr trong các bệnh thông qua việc điều hòa phiên mã, chức năng ER chaperone của Calr vẫn là một trong những cơ chế quan trọng đối với số phận của tế bào [9,12]. Căng thẳng ER kéo dài và sự phân bố sai protein là những điểm nổi bật trong nhiềubệnh thậnchẳng hạn như bệnh cầu thận, cấp tínhchấn thương thận, bệnh thận tiểu đường,thậnxơ hóa và mãn tínhbệnh thận[13,14]. Vai trò của Calr đối với sự phát triển của phôi thai vẫn chưa rõ ràng. Calr knockout gây chết phôi trong giai đoạn phát triển E14.5 do suy giảm sự phát triển của tim [15]. Hậu quả của việc thiếu Calr đối với các cơ chế phân tử củaquả thậnTuy nhiên, sự phát triển của phôi thai vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện các phân tích so sánh phiên mã và protein của phôiquả thậntừ ba kiểu gen Calr plus / plus, Calr plus //, và Calr // và nêu bật tác động của Calr knockout đối với sự hình thành thận và sự biểu hiện của protein ribosome.

Từ khóa:thiếu hụt calreticulin; sinh thận; phát sinh sinh học ribosome, thận, thận

2. Kết quả

2.1. Calreticulin Knockout dẫn đến các bất thường về hình thái và mô học của thận và suy giảm chức năng phân nhánh của thận

Loại bỏ di truyền của Calr ở chuột gây chết phôi sớm do dị tật thông liên thất [15]. Để điều tra xem liệu Calr loại trực tiếp có ảnh hưởng đếnquả thậnphát triển, phôi chuột ở giai đoạn E13.5 được chuẩn bị từ Calr plus // chuột mang thai (Hình 1A). Các phôi Calr // cho thấy sự thay đổi tăng trưởng đáng kể so với Calr plus / plus và Calr plus // và cho thấy sự suy giảm đáng kể trong sự phát triển của phôi. Hình thái tổng quát của phôi vàthậncho thấy sự giảm kích thước đáng kể giữa những con chuột Calr plus / plus và Calr - // với những con chuột Calr // cho thấy sự bất thường lớn nhất (Hình 1A). Để minh họa tác động của loại trực tiếp Calr đối vớiquả thậnphát triển và cấu trúc, phôi ở ba giai đoạn phát triển khác nhau (E13.5, E14.5, E16.5) và từ ba kiểu gen (Calr plus / plus, Calr plus // và Calr //) đã bị hy sinh vàthậnđã thu được. Các phần mô cho thấy các giai đoạn phát triển khác nhau củaquả thận,tiến triển thông qua các cấu trúc hình thái phức tạp được chứng minh bằng phương pháp nhuộm PAS và HE của các phần mô.Thậntừ cùng một giai đoạn phôi với các kiểu gen khác nhau cho thấy mức độ phát triển khác nhau (Hình 1B). Hơn nữa, sự khác biệt đáng kể trongquả thậncác cấu trúc được quan sát đặc biệt khi so sánh Calr // với Calr plus / plus và Calr plus //. Những khác biệt này cũng vẫn còn trong các giai đoạn nâng cao của quá trình hình thành thận (Hình 1B). Bình tĩnh //thậncho thấy sự suy giảm nghiêm trọng so với Calr plus / và Calr plus // (Hình 1B). Ở giai đoạn E13.5, kích thước của Calr //quả thậnnhỏ hơn và số lượng chồi niệu quản và cành chồi niệu quản thấp hơn đáng kể. Các quan sát tương tự cũng được thực hiện ở các giai đoạn E14.5 và E16.5. Nuôi cấy cơ quan của phôi thaithậntừ ba kiểu gen phôi đã tiết lộ rối loạn đáng kể trong phân nhánh UB vàquả thậnsự phát triển. Để hình dungthậncấu trúc, cấu trúc thô sơ nuôi cấy được nhuộm bằng laminin làm chất đánh dấu cho màng đáy và với Dolichos biflorus agglutinin (DBA) lectin để hình dung UB.

Nhuộm huỳnh quang FL kết hợp của vật nuôi cấyquả thậnsự thô sơ cho thấy sự suy giảm phân nhánh đáng kể kèm theo sự thiếu hụt Calr và dẫn đến sự chậm phát triển tổng thể ởquả thậnphát triển (Hình 2A, B). Vào thời điểm bị cô lập, Calr //quả thậnrudiments hiển thị 6–10 mẹo UB, trong khi Calr plus / plus và Calr plus // rudiments hiển thị 20–30 UB. Calr plus / plus và Calr plus // thô sơ được nuôi cấy phát triển bình thường trong thời gian nuôi cấy (72 giờ) và cho thấy UB phân nhánh tốt (85 ± 9, n=6 mỗi cái) cũng như các cấu trúc khác nhau đã biết từ trong thận đang phát triển vivo. Văn hóaquả thậncác tập hợp trước hình ống đã được chứng minh,thậnmụn nước và trung bì mũ (Hình 2A, B). Ngược lại, Calr // thô sơ không phát triển bình thường và cho thấy sự thay đổi đáng kể trong phân nhánh UB (15 ± 3 n=6) (Hình 2B).

Hình 2. Chuột Calr - / -quả thậnthô sơ cho thấy sự thay đổi nghiêm trọng trong tăng trưởng và phân nhánh UB. (MỘT):Quả thậncác mẫu thô sơ từ Calr plus / plus Calr plus / - và Calr - / - (E13.5) được phân lập và nuôi cấy ex vivo trong ba ngày. Bình tĩnh - / -quả thậnthô sơ cho thấy sự thay đổi tổng thể về tăng trưởng và sự thay đổi đáng kể trong phân nhánh chồi niệu quản. (B): Nhuộm huỳnh quang miễn dịch củaquả thậnthô sơ sau ba ngày nuôi cấy. Một quá trình đồng nhuộm laminin (đỏ) và DBA lectin (xanh lá cây) đã được thực hiện để hình dung các cấu trúc khác nhau của các vật liệu thô sơ. Định lượng nhánh đạt được bằng cách đếm số nhánh của chồi niệu quản. Định lượng được trình bày dưới dạng biểu đồ thanh với các thanh lỗi. Mỗi thanh đại diện cho số của chi nhánh có nghĩa là ± sd từ sáu mẫu thô sơ được nuôi cấy. Sự khác biệt đáng kể: (*) p <0. 0="" 5,="" (***)="" p=""><0,001. 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" int.="" j.="" mol.="" khoa="" học.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" of="" 21="" hình="" 2.="" các="" cấu="" trúc="" thô="" sơ="" của="" thận="" chuột="" calr="" 悆="" cho="" thấy="" sự="" thay="" đổi="" nghiêm="" trọng="" về="" tốc="" độ="" tăng="" trưởng="" và="" phân="" nhánh="" ub.="">Quả thậncác mẫu thô sơ từ Calr plus / plus Calr plus // và Calr / (E13.5) được phân lập và nuôi cấy ex vivo trong ba ngày. Bình tĩnh /quả thậnthô sơ cho thấy sự thay đổi tổng thể về tăng trưởng và sự thay đổi đáng kể trong phân nhánh chồi niệu quản. (B): Nhuộm huỳnh quang miễn dịch củaquả thậnthô sơ sau ba ngày nuôi cấy. Một quá trình đồng nhuộm laminin (đỏ) và DBA lectin (xanh lá cây) đã được thực hiện để hình dung các cấu trúc khác nhau của các vật liệu thô sơ. Định lượng nhánh đạt được bằng cách đếm số nhánh của chồi niệu quản. Định lượng được trình bày dưới dạng biểu đồ thanh với các thanh lỗi. Mỗi thanh đại diện cho số của chi nhánh có nghĩa là ± sd từ sáu mẫu thô sơ được nuôi cấy. Sự khác biệt đáng kể: (*) p <0. 0="" 5,="" (***)="" p=""><>

2.2. Sự thiếu hụt Calr liên quan đến những thay đổi lớn và đáng kể trong bảng điểm

Các cuộc điều tra về hình thái học và mô học cho thấy sự suy giảm trongquả thậnphát triển trong phôi Calr / chuột so với Calr cộng / cộng và Calr cộng //. Để điều tra xem liệu loại bỏ Calr có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các protein và con đường quan trọng của sự phát sinh thận hay không, toàn bộ phân tích bảng mã củaquả thậnthô sơ được thực hiện từ ba kiểu gen phôi. Để đánh giá các gen biểu hiện khác biệt giữa Calr plus / plus, Calr plus // và Calr /quả thậnmẫu, xét nghiệm định lượng dựa trên số lần đọc được thực hiện bằng phép thử chính xác của Fisher với sự điều chỉnh của Benjamini – Hochberg cho nhiều phép thử. Hình bổ sung S1 và S2 hiển thị bản đồ nhiệt của phân tích so sánh giữa các biểu hiện gen trongquả thậnthô sơ từ Calr plus / plus, Calr plus // và Calr /. Để có được cái nhìn tổng quan toàn diện về những thay đổi biểu hiện gen giữa Calr cộng / cộng và Calr / thận, một biểu đồ MA đã được tạo với sự thay đổi nếp gấp được biến đổi (FC) của biểu thức giữa Calr cộng / cộng và Calr / thành log2 của biến đổi mức độ biểu hiện trung bình cho mỗi gen trên tất cả các mẫu (Hình 3A, Hình S1 bổ sung). Biểu đồ MA cho thấy các gen được điều chỉnh khác biệt trong Calr plus / plus so với Calr /. Sự phân loại chức năng của các gen quy định theo quá trình sinh học cho thấy sự thay đổi của quá trình phát triển trong Calr /thận(Hình 3B, Bảng bổ sung S1). Một cuộc điều tra kỹ hơn về chú thích con đường của các gen điều chỉnh cho thấy sự sai lệch của hai quá trình chính: tín hiệu Wnt và sự gấp protein vì phần lớn các protein điều chỉnh được phát hiện có liên quan đến hai con đường chính này (Hình 3B). Phân cụm thứ bậc và phân cụm k-mean trên các cấu hình biểu hiện đã xác nhận rằng phôiquả thậntranscriptomes của Calr plus / plus và Calr plus // rất giống nhau nhưng khác biệt đáng kể so với transcriptomes của Calr / (Hình 3C, Hình bổ sung S1 và S2).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN NHIỄM SẮC KIDNEY / RENAL

Dữ liệu phân tích bảng điểm của chúng tôi cho thấy rằng việc loại bỏ Calr đi kèm với sự thay đổi trong biểu hiện của các protein quan trọng trongquả thậnphát triển (Hình 3C và 4A, Bảng bổ sung S2) cùng với các protein quan trọng trong tín hiệu Wnt và một số lượng lớn các gen gây thận đã bị điều hòa hoặc không được phát hiện trong Calr /quả thậnthô sơ (Hình 3C, Hình 4A). Trong số những yếu tố khác, các yếu tố phiên mã, chẳng hạn như Six1 và Six2, trước đây được báo cáo là hoạt động trong các giai đoạn khác nhau của quá trình hình thành thận đã được điều chỉnh giảm đáng kể ở Calr // thận phôi. Osr1 là một trong những gen có sự biểu hiện cần thiết cho Eya1, Pax2, Six2, Sall1 và GDNF và sự biểu hiện của gen này hầu như không có ở Calr /. Để điều tra tác động của sự thay đổi tín hiệu Wnt và các gen quan trọng của nephrogenic trênquả thậnphát triển ở chuột Calr knockout, nhuộm huỳnh quang miễn dịch với các dấu hiệu của sự phát triển phôi được thực hiện trongquả thậnmặt cắt từ phôi ở giai đoạn E14.5. Việc nhuộm xác nhận rõ ràng sự thay đổi của các gen được khảo sát trong Calr / (Hình 4B). Ngoài ra, khi so sánh với Calr plus / plus và Calr plus //, Calr /quả thậnthiếu vùng sinh thận rõ ràng (Hình 4B) bằng chứng là quá trình nhuộm màu và điều này khẳng định sự xáo trộn nghiêm trọng trongquả thậnphát triển ở Calr / phôi.

2.3. Phân tích Proteomic so sánh Đã xác định được Những thay đổi đáng kể trong Proteome của Calr / Thận phôi

Các phân tích hình thái học và mô học cho thấy rằng hạn chế của Calr là vấn đề đối với sự phát triển phôi thai củaquả thận. Để hiểu thêm về vai trò của Calr trongquả thậnsự phát triển của phôi thai, các phân tích proteome rộng được thực hiện trên phôithậnsử dụng hai chiến lược. Trong các thí nghiệm đầu tiên, chúng tôi sử dụng điện di 2D-gel để so sánh phôiquả thậnproteomes từ phôi chuột Calr plus / plus và Calr plus // từ giai đoạn E13.5. Mô hình 2D cho thấy một sự thay đổi đáng kể trong proteome của Calr plus //thận(p <0. 05)="" (hình="" bổ="" sung="" s3a).="" việc="" xác="" định="" các="" protein="" phong="" phú="" khác="" nhau="" cho="" thấy="" một="" sự="" thay="" đổi="" trong="" biểu="" hiện="" của="" các="" protein="" liên="" quan="" đến="" con="" đường="" căng="" thẳng="" và="" trong="" quá="" trình="" chuyển="" hóa="" rna="" ở="" calr="" cộng="" -="">quả thận(Hình phụ S3B, C). Để khám phá tốt hơn sự thay đổi proteome trong Calr plus // và Calr 悆 / so với Calr plus / plusquả thận, chúng tôi đã thực hiện lập hồ sơ proteome dựa trên phép đo khối phổ (Hình 5, Bảng bổ sung S3 – S8). Một phân tích chồng chéo cho thấy khả năng phát hiện protein giữa các kiểu gen được tái lập cao (Hình 5A). Phân tích thống kê cho thấy những thay đổi đáng kể trong biểu hiện protein giữa Calr cộng / cộng với Calr 悆 / (Hình 5A, Bảng bổ sung S3 và S4, Hình bổ sung S4A.), Calr cộng // so với Calr / (Hình 5A, Bảng bổ sung S5 và S6, Hình bổ sung S4B), và Calr cộng / cộng với Calr cộng // (Hình 5A, Bảng bổ sung S7 và S8, Hình bổ sung S4C). Nhuộm huỳnh quang miễn dịch ing xác nhận việc loại bỏ Calr ở Calr //thận. Ngoài ra, chúng tôi đã xác nhận các phát hiện về proteomics đối với hai loại protein được điều chỉnh giảm trong Calr /: Calbindin 1 (Calb -1) và Superoxide dismutase 1 (Sod1). Trong trường hợp của Sod1, cả dữ liệu về proteomic và dữ liệu phiên mã đều tiết lộ sự loại bỏ của Sod1 trong phôi thai Calr 悆 //quả thậnvà nhuộm huỳnh quang miễn dịch xác nhận sự thiếu hụt Sod1 trong Calr / phôiquả thận(Hình 5B). Sod1 là một metalloenzyme chống oxy hóa, đóng một vai trò quan trọng trong việc giải độc các loại oxy phản ứng (ROS) bằng cách chuyển đổi các gốc superoxide tự do thành hydrogen peroxide để giải độc thêm bằng xúc tác tế bào, do đó ngăn ngừa độc tính. Calb -1 là protein liên kết canxi nội bào chính trong ống lượn xa (DCT) và đóng một vai trò quan trọng trong tái hấp thu Ca2 cộng qua tế bào. Là một protein Ca2 cộng với -buffer và Ca2 cộng -transit nội bào, Calb -1 vận chuyển Ca2 cộng từ đỉnh đến mặt đáy mà không có sự thay đổi đáng kể trong sự tập trung Ca2 cộng trong nội bào. Mối liên hệ giữa loại bỏ Calr và sự thay đổi trong biểu hiện của cả hai protein là không rõ ràng và cần được nghiên cứu thêm.

Hình 3. Phân tích biểu hiện gen so sánh của chuột loại bỏ calreticulin. (A): Biểu đồ MA cho thấy các gen điều hòa tăng và điều chỉnh giảm trên diện rộng ở chuột Calr plus / plus so với Calr /. Các phép thử định lượng về sự thay đổi nếp gấp (dựa trên số lần đọc được biến đổi nhật ký chuẩn hóa) được thực hiện bằng phép thử chính xác của Fisher với hiệu chỉnh Benjamini – Hochberg (p <0. 05)="" và="" các="" gen="" không="" quan="" trọng="" được="" biểu="" thị="" bằng="" màu="" xám.="" biểu="" đồ="" ma="" được="" sử="" dụng="" để="" hiển="" thị="" các="" gen="" biểu="" hiện="" khác="" biệt="" trong="" calr="" plus="" plus="" so="" với="" calr="" (b):="" sự="" phân="" bố="" các="" quá="" trình="" sinh="" học="" của="" các="" gen="" quy="" định="" giảm="" trong="" calr="" so="" với="" calr="" cộng="" với="" cộng="" -.="" việc="" phân="" loại="" các="" gen="" đã="" xác="" định="" được="" thực="" hiện="" bằng="" công="" cụ="" tin="" sinh="" học="" david.="" ký="" hiệu="" gen="" được="" sử="" dụng="" để="" phân="" loại="" các="" chú="" thích="" bản="" thể="" học="" gen,="" ví="" dụ,="" các="" quá="" trình="" sinh="" học.="" (c):="" phân="" tích="" mức="" độ="" phong="" phú="" của="" các="" gen="" hàng="" đầu="" được="" tìm="" thấy="" được="" quy="" định="" đáng="" kể="" giữa="" ba="" kiểu="" gen="" (calr="" cộng="" cộng,="" calr="" cộng="" và="" calr="" .="" phân="" tích="" so="" sánh="" được="" biểu="" diễn="" dưới="" dạng="" bản="" đồ="" nhiệt="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Phân loại bản thể học gen và phân tích mạng lưới tương tác protein-protein

Các biểu đồ núi lửa và phân tích biểu đồ hình tròn cho thấy rằng sự thay đổi biểu hiện Calr dẫn đến những thay đổi toàn cầu trong phôiquả thậnproteome (Hình S4 bổ sung). Để có thêm thông tin về các cơ chế sinh học liên quan đến phôi thaiquả thậnthay đổi sự phát triển ở Calr / chuột, chúng tôi đã kết hợp tin sinh học DAVID với thông tin về chức năng giả định của các protein được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu UniProt và GenBank. Việc phân loại các protein được xác định theo sự tham gia của chúng trong các quá trình sinh học dẫn đến hai mươi loại, với chín loại được đại diện cao (Hình S4D bổ sung). Một trong những loại chính là quá trình phát triển, với hơn 1000 loại protein được xác định thuộc nhóm này. Vì tương tác protein-protein là cơ chế quan trọng của hầu hết các quá trình sinh học bao gồm cả sự phát triển, việc trích xuất thông tin về các tương tác protein-protein có thể xảy ra và cơ chế điều hòa con đường kết nối các protein được điều chỉnh trong Calr plus // và Calr / phôiquả thậncó thể cung cấp thông tin quan trọng về các quá trình bị suy giảm trong điều kiện thiếu Calr. Vì mục đích này, chúng tôi đã điều tra mạng tương tác giữa các protein được điều chỉnh bằng cách sử dụng STRING 11. 0 (http://string.embl.de, truy cập vào ngày 24 tháng 3 năm 2021). Phân tích sâu hơn về các protein chỉ được thể hiện trong Calr plus / plus và Calr plus // cho thấy hai nút tương tác mạnh từ các protein liên quan đến hai quá trình chính, đó là chuyển hóa RNA và phosphoryl oxy hóa (Hình bổ sung S5A). Điều này cho thấy rằng Calr / phôi thaiquả thậncó thể bị bất thường trong chuyển hóa RNA và thiếu hụt năng lượng. Việc khảo sát mạng lưới tương tác giữa các protein được biểu hiện quá mức trong Calr plus / plus và Calr plus // so với Calr / ủng hộ mạnh mẽ giả định của chúng tôi vì các mạng hiển thị ba nút tương tác mạnh. Hai trong số các nút tích lũy protein liên quan đến quá trình chuyển hóa RNA và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, trong khi nút thứ ba liên quan đến protein ribosome và cho thấy sự xáo trộn trong quá trình hình thành ribosome và chu chuyển protein (Hình bổ sung S5B). Một cuộc kiểm tra chặt chẽ các protein ribosom được tìm thấy để điều chỉnh cho thấy sự thay đổi đáng kể của protein từ cả tiểu đơn vị lớn và nhỏ của ribosom và điều này cho thấy sự xáo trộn nghiêm trọng trong quá trình sinh sinh ribosom và tổng hợp protein (Hình 6A – D).

2.5. Calr Knockout dẫn đến sự thay đổi trong sự biểu hiện của protein Ribosome 

Các phân tích dữ liệu phiên mã và protein cho thấy có sự thay đổi đáng kể trong sự biểu hiện của protein ribosome ở phôi chuột Calr / chuột.thận. Phân tích Western blot và định lượng phôi bằng MSquả thậnchiết xuất protein từ ba kiểu gen đã xác nhận quy định giảm đáng kể của Rps10, Rps19 và Rps26thận(Hình 7A) và Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 và Rps19 (Hình bổ sung S6A, B) trong Calr /. Hơn nữa, sự nhuộm màu của phôiquả thậncác phần đã xác nhận mức độ thay đổi trong biểu hiện của các protein ribosom; không có Rps10 hoặc Rps6 có thể được phát hiện trong Calr / phôi thaiquả thậncác phần (Hình 7B). Để điều tra mối liên hệ giữa loại bỏ Calr và sự biểu hiện của protein ribosome, chúng tôi đã thiết lập một mô hình loại bỏ Calr trong ống nghiệm ở MDCKthậntế bào ống sử dụng hệ thống endonuclease CRISPR / cas9. Western blot phân tích đã xác nhận sự điều hòa giảm phụ thuộc vào liều lượng của biểu hiện Calr trong tế bào MDCK và chứng minh sự suy giảm đáng kể của các protein mã hóa tiểu đơn vị 40S ribosome Rps10 và Rps19, điều này cho thấy có sự xáo trộn trong quá trình sinh sinh ribosome. Hơn nữa, sự biểu hiện của các thành phần thiết yếu cho quá trình tổng hợp protein, ví dụ, sự kéo dài, cho thấy yếu tố bắt đầu eEIF5a giảm đáng kể trong các tế bào MDCK loại bỏ Calr (Hình 7C). Loại bỏ Calr đi kèm với những thay đổi đáng kể về hình thái, protein và phiên mã. Các cuộc điều tra in vivo và in vitro của chúng tôi đã nhấn mạnh thêm rằng những sai lệch này đi kèm với sự sụt giảm đáng kể trong quá trình sinh ribosome. Sự giảm biểu hiện protein ribosome trong loại bỏ Calrquả thậnkhông giới hạn ở các giai đoạn phôi mà còn có thể được chứng minh trong các tế bào có nguồn gốc từ trưởng thànhthận, cho thấy vai trò tiềm năng của Calr trong quá trình sinh sinh ribosome.

Hình 7. Sự thiếu hụt calr có liên quan đến sự điều hòa giảm trong biểu hiện protein của ribosome. (A): Western blot phân tích protein ribosome Rps10, Rps19 và Rps26 trong chiết xuất protein từ Calr plus / plus, Calr plus // và Calr // phôi thaithận. Thận phôi được thu hoạch từ ba con chuột Calr plus / - mang thai khác nhau. Sau khi phân loại kiểu gen, các phôi từ cùng một mẹ và cùng kiểu gen được nhóm lại với nhau và phôi của chúngquả thậnchiết xuất protein được gộp lại với nhau. Sau khi ước lượng protein, các phân tích Western blot được thực hiện ba lần cho mỗi protein được khảo sát. Để phân tích so sánh các mẫu, ANOVA một chiều đã được sử dụng. Các kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sd từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p <0. 0="" 5.="" (b):="" nhuộm="" huỳnh="" quang="" miễn="" dịch="" chống="" lại="" rps1="" 0="" và="" rps6="" trong="" phần="" mô="" thận="" calr="" plus="" plus="" và="" calr="" 悆="" phôi="" với="" độ="" phóng="" đại="" 2="" 0="" ×.="" (c):="" phân="" tích="" western="" blot="" chiết="" xuất="" protein="" từ="" tế="" bào="" mdck="" (trái)="" và="" định="" lượng="" mrna="" sau="" khi="" loại="" bỏ="" calr="" trong="" tế="" bào="" mdck="" (phải).="" calr="" đã="" bị="" loại="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" hệ="" thống="" crispr="" cas9="" với="" hai="" sgrna="" khác="" nhau.="" western="" blots="" được="" thăm="" dò="" bằng="" các="" kháng="" thể="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" và="" eif5a.="" định="" lượng="" mrna="" calr="" và="" rps10="" trong="" mẫu="" sgcalr="" -2="" được="" thực="" hiện="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" qpcr.="" điều="" chỉnh="" giảm="" calr="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" hệ="" thống="" crispr="" cas9="" cho="" thấy="" mối="" liên="" quan="" giữa="" sự="" thiếu="" hụt="" calr="" và="" sự="" thay="" đổi="" trong="" biểu="" hiện="" protein="" ribosom.="" sự="" khác="" biệt="" đáng="" kể:="" (**)="" p=""><0,01, (***)="" p=""><0,001, (****)="" p=""><>

3. Thảo luận

Cácthậnphát triển thông qua hình thái phân nhánh là một quá trình bao gồm các quá trình tăng trưởng và biệt hóa phức tạp và được thúc đẩy bởi các tín hiệu đến từ các tế bào xung quanh trong khoang trung mô non trẻ [16]. Trong những năm qua, một số gen và con đường quan trọng trongquả thậnsự phát triển đã được xác định. Các yếu tố dinh dưỡng, đặc biệt là GDNF, protein di truyền hình thái xương (BMP) và các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGFs) có liên quan đếnthậntăng trưởng và khác biệt hóa. Chúng chi phối tín hiệu liên quan đến sự hình thành phân nhánh UB cũng như trong việc duy trì và biệt hóa của trung mô thận trong phôi.quả thận[17]. Calr knockout gây chết phôi do rối loạn chức năng phát triển của tim [15]. Cần tăng nồng độ Ca2 trong tế bào chất cộng với tế bào cơ tim bình thường để thúc đẩy quá trình tạo myofibrillogenesis ở tim. Sự thay đổi tất yếu này trong nồng độ Ca2 cộng phụ thuộc vào Calr và không có trong điều kiện thiếu Calr [18]. Vai trò chức năng của chaperone ER và protein liên kết canxi Calr trong quá trình hình thành thận vẫn chưa được khám phá. Để điều tra vai trò tiềm năng của Calr trong phôi thaiquả thậnsự phát triển và tác động của thiếu Calr đối với sự hình thành thận, chúng tôi đã thực hiện một phân tích so sánh phiên mã và protein. Nhìn chung, sự thiếu hụt Calr dẫn đến sự chậm phát triển của thận và những thay đổi không đáng kể về transcriptome và proteome. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi cho thấy sự thiếu hụt Calr gây ra các rối loạn nghiêm trọng trong các con đường hình thành thận khi những thay đổi biểu hiện đáng kể của các protein chủ chốt truyền tín hiệu Wnt (ví dụ, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq và Kremen2) đã được xác định. Tín hiệu cảm ứng giữa biểu mô chồi niệu quản và trung bì metanephric chủ yếu được điều chỉnh bởi tín hiệu phản hồi Wnt [19,20]. Trong khi Calr là một phần chính của cân bằng nội môi canxi tế bào, nó đồng thời là một chaperone ER thiết yếu cho quá trình gấp và vận chuyển glycoprotein và protein liên quan đến tín hiệu tế bào và biểu hiện gen [21]. Việc loại bỏ Calr có thể dẫn đến sự gián đoạn của quá trình gấp protein và ứng suất ER, gây ra sự xáo trộn trong cơ chế tịnh tiến. Điều này có thể giải thích sự chậm phát triển thận được quan sát thấy ở chuột đồng hợp tử.

Một trong những khía cạnh đáng ngạc nhiên và thú vị được làm nổi bật bởi dữ liệu của chúng tôi là sự thay đổi trong biểu hiện của protein ribosom. Chúng tôi đã chứng minh sự cạn kiệt gần như hoàn toàn một số protein của các tiểu đơn vị ribosom 40S và 60S. Hơn nữa, các thí nghiệm trong ống nghiệm của chúng tôi đã xác nhận mối tương quan giữa sự điều chỉnh giảm của Calr và sự suy giảm biểu hiện của protein ribosome. Quá trình tạo sinh Ribosome được tổ chức tốt và trải qua các quy định nghiêm ngặt. Các nghiên cứu mới nổi đã chứng minh rằng ribosome đóng một vai trò quan trọng không chỉ trong sinh lý tế bào bình thường mà còn trong phản ứng với các kích thích và cơ chế bệnh sinh. Hơn nữa, quá trình sinh sinh ribosome kiểm soát sự phát triển của tế bào, và sự tăng sinh và thay đổi trong ribosome được phản ánh trong sự sai lệch của sự tăng sinh tế bào, bắt giữ chu kỳ tế bào, apoptosis và biểu hiện bệnh lý [22,23].

Ngoài vai trò của chúng trong quá trình sinh học ribosome, các protein ribosome còn được phát hiện thực hiện các chức năng phụ đa dạng của ribosome, ví dụ, trong quá trình phát triển và tăng sinh tế bào, sửa chữa DNA, trong quá trình biệt hóa và phát triển tế bào [24-31]. Suy giảm các chức năng của protein ribosome có liên quan đến rối loạn huyết học và chuyển hóa và có thể dẫn đến các bệnh tim mạch và ung thư [32–36]. Đột biến gen mã hóa protein ribosome có liên quan đến bất thường tạo hồng cầu dẫn đến các hội chứng lâm sàng, ví dụ, thiếu máu Diamond-Blackfan (DBA) [37] và hội chứng 5q [38]. Các đột biến trong RPS10 có liên quan đến bệnh thiếu máu Diamond-Blackfan và 30% trong số những bệnh nhân này có móng ngựa hoặc sigmoidthận[39]. Điều thú vị là các bệnh nhân Diamond-Blackfan có nguy cơ cao mắc hội chứng loạn sản tủy, có liên quan đến đột biến gen Calr exon 9 [40–42]. Việc tu sửa lại bộ máy dịch mã này gây ra những sai lệch lớn trong quá trình phát triển và không chỉ ảnh hưởng đến niệu sinh dục mà còn ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn và sinh sản, cuối cùng gây chết phôi khi thiếu calreticulin. Dữ liệu của chúng tôi tiết lộ quá trình tạo sinh ribosome đáng lo ngại ở Calr / phôi thaiquả thậnvà nhấn mạnh vai trò quan trọng của Calr trong quá trình sinh học protein. Chúng tôi tin rằng sự hiểu biết tốt hơn về các mối quan hệ giữa sự thiếu hụt Calr và sự thay đổi sự biểu hiện của protein ribosom sẽ cung cấp những hiểu biết mới để hiểu được Calr tác động như thế nào đến sự hình thành sinh học của ribosome và phôi thaiquả thậnphát triển và cho phép các quan điểm mới về các quá trình điều chỉnh sự phát triển của cơ quan.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Loài vật

Những con chuột cùng lứa với Calreticulin dị hợp tử (Calr plus //) và hoang dại (Calr plus / plus) có nguồn gốc di truyền C57BL / 6J giống hệt nhau được lấy từ Giáo sư Marek Michalak, Đại học Alberta, Edmonton, Alberta, Canada. Chuột được lai tạo trong các điều kiện chuồng trại không có mầm bệnh cụ thể và được định dạng gen như đã mô tả trước đây trong Michalak và cộng sự. [15]. Đối với nghiên cứu của chúng tôi, chuột Calr cộng với // mang thai đã được hy sinh ở các giai đoạn phát triển phôi khác nhau (ngày phôi 13,5: E13,5; 14,5: E14,5; và 16,5: E16,5), phôi được thu hoạch, vàthậnđã được mổ xẻ. Để xác định kiểu gen, một đoạn của đuôi phôi được sử dụng. Cácthậnđã được chuẩn bị thêm để nhuộm mô hóa hoặc phân tích phiên mã hoặc phân tích protein. Tất cả các quy trình thử nghiệm đều được thực hiện theo luật đạo đức và chăm sóc động vật của Đức (tiêu chuẩn NIH) và đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức địa phương của Trung tâm Y tế Đại học Göttingen, Đức (33. {1}} / 0598).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL

4.2. Nhuộm mô hóa

Đối với nhuộm mô học của phôithận, người bị cắt giảmthậnđược cố định qua đêm trong dung dịch formaldehyde đệm 4% và sau đó được nhúng vào các khối parafin. Các phần nhúng parafin đã được khử muối và bù nước và nhuộm bằng dung dịch hematoxylin Gill III và dung dịch eosin Y (Merck, Darmstadt, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

4.3. Nuôi cấy cơ quan Ex-Vivo của thận phôi

Nuôi cấy cơ quan ex vivo được thực hiện theo Davies et.al [43]. Những con chuột mang thai được hiến tế ở giai đoạn E13.5 của quá trình phát triển phôi, phôi được thu hoạch, vàthậnđã được mổ xẻ. Sau khi phân loại kiểu gen, 6quả thậnthô sơ từ mọi kiểu gen (Calr plus / plus, Calr plus // và Calr /) được mạ trên màng PET trong suốt với kích thước lỗ chân lông 0. 4 µM (24 well, BD Falcon). Màng được đặt trong một giếng của đĩa 24 giếng, chứa 400 µLquả thậnmôi trường nuôi cấy (KCM, DMEM, 10% FCS bất hoạt). Điều này cho phépquả thậnđể tiếp xúc với phương tiện mà không làm nó chết chìm. Trong những điều kiện này, có thể giữquả thậnđược nuôi cấy ở 37 ◦C và 5% CO2 trong ít nhất 144 h.

4.4. Nhuộm huỳnh quang miễn dịch của thận nuôi cấy và phân tích mô học miễn dịch của các bộ phận của thận

Phôi thaithậnđược nuôi cấy ex vivo trong 72 giờ, sau đó,quả thậncác sản phẩm thô sơ được cố định trong metanol lạnh ở nhiệt độ 20 ◦C trong 30 phút. Bước cố định được theo sau bởi 3 bước giặt, mỗi bước trong 5 phút trong PBS. Kháng thể chính kháng thể kháng laminin của thỏ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) được pha loãng trong PBS và ủ ở 4 ◦C qua đêm. Văn hóaquả thậnvật liệu thô sơ được rửa trong PBS trong 4 giờ và kháng thể thứ cấp (Đầu dò phân tử Alexa Fluor 555 IgG dê chống thỏ (1: 500)) được bổ sung qua đêm ở 4 ◦C. UB được nhuộm bằng lectin Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) trong ít nhất 3 giờ. Sau khi ủ,thậnđược rửa trong PBS trong 3 giờ và được nhúng để phân tích bằng kính hiển vi. Nhuộm miễn dịch của phôi thai đã khử nước và khử nướcquả thậncác phần được thực hiện để phát hiện sự biểu hiện và phân bố của một số protein. Các phần được xử lý bằng dung dịch thu hồi kháng nguyên (1,8 µM axit xitric và 8,2 µM natri xitrat) được làm ấm trước trong tủ hấp thực phẩm trong 25 phút. Các phần được chặn bằng 10% huyết thanh dê trong PBS trong 1 giờ ủ qua đêm ở 4 ◦C với các kháng thể chính (Các kháng thể chính sau đây đã được sử dụng: thỏ đơn dòng anti-Calbindin -1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), thỏ đơn dòng kháng Rps6, antiRps10 (Invitrogen) và kháng thể đơn dòng kháng Sod1 cho thỏ (Abnova, Đài Bắc, Đài Loan). Các kháng thể chính được phát hiện bằng huỳnh quang các kháng thể thứ cấp được đánh dấu (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kháng thể IgG chống chuột và IgG dê Alexa Fluor 555) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Đối với các đối chứng âm tính, các phần mô chỉ được ủ với kháng thể thứ cấp. Các phiến kính đã được gắn vào với các tấm phủ trong môi trường gắn Vectashield với DAPI để chống lại các hạt nhân (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA, Hoa Kỳ).

4.5. Nuôi cấy tế bào

Chó Madin – Darbyquả thậnTế bào (MDCK) được lấy từ Bộ sưu tập nuôi cấy loại Mỹ (ATCC) và được nhân giống trong Phương tiện đại bàng cải tiến (DMEM) của Dulbecco, 10% huyết thanh bò thai (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin và 1% L-Glutamine ở 37 ◦C trong bầu khí quyển 5 phần trăm CO 2-. Tế bào được nuôi cấy trong bình T25 và được tách hai lần trong một tuần. Đối với quá trình truyền tế bào, tế bào MDCK được trypsinized trong một khoảng thời gian ngắn để tránh thay đổi cấu trúc tế bào.

4.6. Tạo ra các tế bào Knockout

Trình tự sgRNA của Calr (XM 8622117) cho loài canis lupus được thiết kế bằng công cụ trực tuyến BlueHeronBio (Origene, Herford, Đức). Trình tự sgRNA 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 được chèn vào plasmid pLenti-Cas-Guide (Addgene plasmid # 3931646) với các enzym giới hạn BamHI và BsmBI để tạo ra cấu trúc Calr pLenti-Cas 9- sau đó đã được xác nhận bởi trình tự Sanger. Để loại bỏ Carl trong các ô MDCK, quá trình chuyển đổi thoáng qua pLenti-Cas 9- đã được thực hiện. Một ngày trước khi truyền nhiễm, 200, 000 tế bào / mL đã được cấy vào 6 đĩa giếng với môi trường MEM. Trước khi chuyển giao, môi trường nuôi cấy đã được thay đổi thành môi trường Opti-MEM không có FCS. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) được sử dụng để lây nhiễm tế bào. Hỗn hợp DNA plasmid lipofectamine được chuẩn bị với OptiMEM dựa trên giao thức của người hướng dẫn. Đối với chuyển nạp đĩa 6 giếng, 4 µg DNA plasmid được thêm vào môi trường 250 µL Opti-MEM riêng biệt và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, hỗn hợp DNA được thêm vào hỗn hợp Lipofectamine 2000 và ủ trong 30 phút trước khi được thêm vào các tế bào. Sự thành công của quá trình chuyển nạp được đánh giá bằng cách sử dụng Western blot.

4.7. Phân tích bảng điểm

Đối với điều tra phiên mã, 3 con chuột Calr cộng với // mang thai đã được sử dụng. Phôi (8–10 con chuột chửa) đã được thu hoạch vàthậnđã bị cô lập. Sau khi xác định kiểu gen,thậntừ cùng một kiểu gen và cùng một mẹ được gộp lại với nhau và được xử lý để tách chiết RNA. Tổng số RNA được phân lập từ Calr plus / plus, Calr plus // và Calr / phôithậnsử dụng phương pháp Trizol (Invitrogen) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Sau đó, các mẫu được xử lý bằng DNAse I (Sigma) để loại bỏ sự nhiễm bẩn DNA. Chất lượng của RNA được xác định bằng cách sử dụng máy phân tích sinh học Agilent 21 {{1 0}} 0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Để giải trình tự, các mẫu RNA được chuẩn bị bằng cách sử dụng "TruSeq RNA Sample Prep Kit" theo quy trình của nhà sản xuất (Illumina, San Diego, CA, USA). Giải trình tự đọc một lần (5 0 bp) được tiến hành bằng HiSeq 2 0 00 (Illumina, San Diego, CA, Hoa Kỳ). Các trình tự được căn chỉnh theo trình tự tham chiếu bộ gen của Mus Muscullus (lắp ráp bộ gen Ensembl 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, truy cập vào ngày 24 tháng 3 năm 2021) bằng cách sử dụng căn chỉnh STAR phần mềm (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbour, USA) (phiên bản 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, truy cập ngày 24 tháng 3 năm 2021) [44] cho phép có 2 điểm không khớp trong 50 cơ sở. Gói SAMtools (phiên bản 0.1.18) và HTSeq (phiên bản 0.6.1p1) được sử dụng để lọc và đếm số lần truy cập duy nhất [45,46]. Các gen của ứng viên đã được lọc với mức thay đổi tối thiểu 2- lần và giá trị p hiệu chỉnh FDR <0,05. chú="" thích="" gen="" được="" thực="" hiện="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" mus="" muscullus="" từ="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" truy="" cập="" vào="" ngày="" 1="" tháng="" 3="" năm="" 2019)="" thông="" qua="" gói="" biomart="" (phiên="" bản="" 2.24.0)="" [47].="" phân="" tích="" làm="" giàu="" go="" cho="" các="" gen="" ứng="" viên="" được="" thực="" hiện="" với="" gói="" goseq="" (phiên="" bản="" 1.2)="" [48]="" sử="" dụng="" các="" thông="" số="" tiêu="">

4.8. Lọc thận, tách chiết protein và điện di trên gel hai chiều (2- DE)

Đối với điện di trên gel 2D, phôi từ 6 con Calr mang thai cộng với // con cái (8–10 phôi / con cái) được sử dụng. Để chiết xuất protein cho điện di trên gel 2D (2- DE),thậntừ các phôi ở cùng giai đoạn phôi và từ cùng một kiểu gen và giống cái (8–10 phôi / con cái mang thai) được gộp chung lại, phá vỡ với chất đệm ly giải (9,5 M urê, 2 phần trăm CHAPS (w / v), 2 phần trăm ampholyte (w / v), 1 phần trăm DTT), và bị xoáy. Sau khi thêm đệm phân giải, các mẫu được ủ ở 4 ◦C trong 30 phút. Để loại bỏ các mảnh vụn tế bào, ly tâm được thực hiện ở 13, 000 × g và 4 ◦C trong 30 phút. Phần nổi phía trên gần đây đã được ly tâm thêm 30 phút ở 13, 000 × g và 4 ◦C để có được độ tinh khiết tối đa. Phần nổi phía trên được thu thập và loại bỏ các viên và các mẫu thu được được sử dụng ngay lập tức hoặc được bảo quản ở –80 ◦C cho đến khi sử dụng. Để giảm ô nhiễm muối và làm giàu protein, kết tủa metanol - cloroform theo Wessel và Flügge [49] đã được thực hiện. Viên nén được làm khô và hòa tan trong dung dịch đệm ly giải. Theo Bradford, tổng nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). BSA (Sigma, Steinheim, Đức) đã được sử dụng làm tiêu chuẩn. Để đảm bảo khả năng tái tạo thử nghiệm, chúng tôi đã tạo ra các loại gel ba lần từ mỗiquả thậnhồ bơi. Việc tách protein 2D được thực hiện như đã mô tả trước đây [50]. Gel 2- DE được nhuộm bằng vết gel huỳnh quang Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi nhuộm, gel được quét ở độ phân giải 50 µm trên máy quét Fuji FLA -5100. Các hình ảnh số hóa được phân tích bằng cách sử dụng Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Đức). Để hình dung protein, gel 2- DE cũng được nhuộm qua đêm với màu xanh lam Coomassie dạng keo, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Đức).

4.9. Phân tích khối phổ và xác định protein

Các điểm được điều chỉnh đáng kể đã được loại bỏ khỏi gel và quá trình phân hủy trong gel bằng tryptic và chiết xuất peptit được thực hiện như đã được Dihazi et al mô tả trước đây. [51]. Tóm lại, các vết gel được rửa hai lần trong 25 mM amoni bicacbonat (amBic) và một lần trong nước, thu nhỏ lại với 1 0 0 phần trăm acetonitril (ACN) trong 15 phút và được làm khô trong SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) trong 20–30 phút. Tất cả các điểm đã cắt bỏ được ủ với 12,5 ng / µL trypsin cấp trình tự (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) trong 25 mM amBic qua đêm ở 37 ◦C. Quá trình chiết xuất peptit được thực hiện hai lần bằng cách lần đầu tiên sử dụng 50% ACN / 1% axit trifluoroacetic (TFA) và sau đó là 100% ACN. Tất cả các phần trích xuất được gộp lại và giảm âm lượng khi sử dụng SpeedVac. Các peptit thử nghiệm được xác định trình tự khối phổ bằng cách sử dụng máy đo khối phổ Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manchester, Vương quốc Anh) được trang bị phun nanoflflow ESI Z. Việc xác định protein được thực hiện với công cụ tìm kiếm Mascot dựa trên cơ sở dữ liệu MSDB và Swissprot bằng cách sử dụng dung sai khối lượng peptit và dung sai phân đoạn là 0,5 Da.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI

4.10. Chiết xuất protein, SDS-PAGE, trong tiêu hóa thử bằng gel và phân tích khối phổ

Để định lượng khối phổ của sự thay đổi protein trong Calr /quả thận, các mẫu từ cùng kiểu gen và cùng mẹ được gộp lại với nhau. Để tạo đủ hồ và đảm bảo sự nhân lên sinh học và thử nghiệm, chúng tôi đã sử dụng 6 Cal mang thai khác nhau cộng // với 8–10 phôi / chuột. Phôi thaithậntừ ba kiểu gen được thu hoạch từ phôi và việc chiết tách protein được thực hiện bằng cách sử dụng đệm ly giải như đã mô tả ở trên. Chiết xuất protein được tách bằng SDS-PAGE, gel được nhuộm bằng Coomassie Blue, mỗi làn được cắt bỏ và cắt thành 2 0 lát có kích thước bằng nhau và các lát được phân hủy trong gel với trypsin. Đối với phân tích khối phổ, các mẫu được làm giàu trên cột trước pha-C18 đảo ngược tự đóng gói (0. 15 mm ID × 2 0 mm, Reprosil-Pur12 0 C {{11} } AQ 5 µm, Tiến sĩ Maisch, Ammerbuch-Entringen, Đức) và được phân tách trên cột phân tích pha-C18 đảo ngược (0. 0 75 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C { {21}} AQ, 3 µm, Tiến sĩ Maisch) sử dụng gradient tuyến tính 30 phút của 5–35 phần trăm acetonitrile / 0,1 phần trăm axit formic (v: v) ở 300 nl phút -1). Chất rửa giải được phân tích trên máy quang phổ khối tứ cực / quỹ đạo lai Q Exactive (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Đức) được trang bị nguồn FlexIon nanoSpray và hoạt động theo phần mềm Excalibur 2.4 sử dụng phương pháp thu thập phụ thuộc vào dữ liệu. Mỗi chu kỳ thử nghiệm có dạng sau: một lần quét MS đầy đủ trên phạm vi 350–1600 m / z được thực hiện ở cài đặt độ phân giải 70, mục tiêu 000 FWHM và AGC là 106 và thời gian lấp đầy tối đa là 60 mili giây . Lên đến 12 tiền chất peptit phong phú nhất có trạng thái điện tích từ 2 đến 5 trên ngưỡng cường độ 2 × 104 sau đó được phân lập tuần tự ở độ rộng cách ly 2,0 FWHM, được phân mảnh bằng nitơ ở cài đặt năng lượng va chạm chuẩn hóa là 25 phần trăm và tạo ra phổ ion sản phẩm. được ghi lại ở cài đặt độ phân giải 17.500 FWHM và có mục tiêu AGC là 2 × 105 và thời gian lấp đầy tối đa là 60 ms. Sau đó, các giá trị m / z tiền chất đã chọn bị loại trừ trong 15 s tiếp theo. Hai lần lặp lại kỹ thuật cho mỗi mẫu đã được thu thập. Danh sách cao điểm được trích xuất từ ​​dữ liệu thô bằng phần mềm Raw2MSMS v1.17 (Viện Hóa sinh Max Planck, Martinsried, Đức). Việc xác định protein đã được thực hiện bằng phần mềm MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, London, UK). Protein được xác định dựa trên proteome tham chiếu chuột UniProtKB v2017.09 (16930 mục nhập protein) cùng với một bộ 51 chất gây ô nhiễm thường được xác định trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Việc tìm kiếm được thực hiện với trypsin là enzym và iodoacetamide là tác nhân ngăn chặn cysteine. Cho phép có tối đa hai lần phân cắt tryptic bị bỏ lỡ và quá trình oxy hóa methionine như một biến đổi thay đổi được phép. Dung sai tìm kiếm được đặt thành 10 ppm cho khối lượng tiền chất và 0,05 Da cho khối lượng mảnh và ESI-QUAD-TOF được chỉ định làm loại thiết bị. Phiên bản phần mềm Scaffold 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) đã được sử dụng để xác thực thông tin nhận dạng peptide và protein dựa trên MS / MS. Các nhận dạng peptit được chấp nhận nếu chúng có thể được thiết lập ở xác suất lớn hơn 95,0 phần trăm bằng thuật toán Percolator. Việc nhận dạng protein đã bị cắt ngắn thành tỷ lệ phát hiện sai là 1 phần trăm với tối thiểu 2 peptit được xác định một cách tự tin. Các thành phần protein có chứa các peptit tương tự và hơn nữa, không thể phân biệt được chỉ dựa trên phân tích MS / MS đã được nhóm lại để đáp ứng các nguyên tắc của parsimon. Các protein chia sẻ bằng chứng peptit quan trọng được nhóm thành các cụm. Sự phong phú của protein được ước tính bằng Số lượng phổ của chúng sau khi chuẩn hóa tổng số giữa tất cả các lần sao chép.

4.11. Phân tích Western Blot

Phân tích Western blot được thực hiện theo Towbin et al. [52]. Một lượng bằng nhau của protein (5 0 - 75 µg) được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) và được chuyển trên màng nitrocellulose (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Vương quốc Anh). Các màng được chặn trong sữa khô không béo 5% trong dung dịch đệm TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7. 4 150 mM NaCl 0,1% Tween 20) và được ủ với các kháng thể chính (anti-Calr, anti -Rps10, chống Rps19, chống Rps26 và chống eIF5A) qua đêm ở 4 ◦C. Để hình dung các dải protein, các kháng thể thứ cấp được đánh dấu huỳnh quang đã được sử dụng. Để xác nhận lượng protein bằng nhau, các đốm màu được xử lý bằng kháng thể kháng Actb hoặc kháng GAPDH (Sigma, Taufkirchen, Đức).

4.12. Tin sinh học

Việc phân loại các protein được xác định theo các chức năng chủ yếu đã biết và đã được công nhận của chúng được thực hiện bằng cách sử dụng tin sinh học DAVID (http: //david.abcc. Ncifcrf.gov, truy cập ngày 21 tháng 2 năm 2019) [53,54]. Các ký hiệu gen được sử dụng để điều tra và phân loại các chú thích bản thể học gen (GO) (các quá trình sinh học và chức năng phân tử). Phân tích mạng lưới các tương tác protein-protein đã biết và dự đoán của các protein đã xác định được thực hiện bằng cách sử dụng STRING (công cụ tìm kiếm cho việc Truy xuất các gen / protein tương tác) [55].

4.13. Phân tích thống kê

Đối với {{0}} DE, các hình ảnh số hóa được phân tích và đối sánh vị trí trên các gel và quá trình chuẩn hóa được thực hiện bằng cách sử dụng Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Đức). Delta2D tính giá trị "chất lượng điểm" cho mọi điểm được phát hiện. Giá trị này cho thấy một điểm thể hiện hình dạng chuông Gaussian 3D "lý tưởng" gần như thế nào. Dựa trên tỷ lệ thể tích đốm trung bình, các đốm có biểu hiện tương đối bị thay đổi ít nhất 2- lần (tăng hoặc giảm) gấp ba lần giữa các mẫu được so sánh được coi là có ý nghĩa. Để phân tích tầm quan trọng của việc điều hòa protein, thử nghiệm t của Student đã được thực hiện và giá trị thống kê được giả định cho các giá trị P nhỏ hơn 0. 05. Tất cả các khối được định lượng bằng phần mềm ImageJ. Dữ liệu được biên dịch bằng gói phần mềm GraphPad Prism, phiên bản 8 (San Diego, CA, Hoa Kỳ). Phần mềm được sử dụng để trình bày và phân tích đồ họa bằng phân phối t của Student hoặc ANOVA một chiều. Các kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sd từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p <0,05. các="" mẹo="" và="" nephron="" niệu="" quản="" được="" đếm="" thủ="" công="" và="" dữ="" liệu="" được="" biên="" dịch="" bằng="" gói="" phần="" mềm="" graphpad="" prism,="" phiên="" bản="">