Những thay đổi trong cấu hình axit amin và hợp chất hoạt tính sinh học của kén tơ tằm Thái Lan khi bị ảnh hưởng bởi quá trình chiết xuất nước Phần 2

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

2.8. Tương quan

Một phân tích tương quan (thử nghiệm Pearson) được sử dụng để so sánh (dưới dạng hệ số tương quan, r) giữa và giữa các giá trị cho tổng hàm lượng phenolic, tổng hàm lượng flavonoid, hoạt động nhặt rác DPPHradical, ABTS cộng, xét nghiệm FRAP, anti - - amylase , chống - - glucosidase, và chống glycation SPE ở các chủng Nangsew và Eri (Bảng 5 và 6). Mỗi thông số thu được từ nghiên cứu đã chứng minh mối tương quan thuận chặt chẽ giữa TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP anti - - amylase, anti - - glucosidase và anti-glycation. Điều này có thể là do các hợp chất hoạt tính sinh học có trong chiết xuất tơ tằm có khả năng loại bỏ các gốc tự do khác nhau và chống lại - - amylase, anti - - glucosidase và chống glycation. Phát hiện của chúng tôi cũng đã chứng minh rằng có mối tương quan tuyến tính có ý nghĩa cao giữa các kết quả đối với hai chủng. Những kết quả này phù hợp với kết quả của Benzie và Stezo [29], những người đã tìm thấy mối tương quan thuận chặt chẽ giữa hàm lượng phenolic tổng số và xét nghiệm FRAP. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy giữa TPC và DPPH (R 2=0. 711) và FRAP (R 2=0. 948), tương ứng trong quả bầu đắng theo báo cáo của Kubola [30]. Kumar và cộng sự [31] đã tiến hành đánh giá hoạt động chống oxy hóa và tổng phenol trong các loại lá Lantana Camara khác nhau. Các chất chiết xuất cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng phenolic và các hoạt động nhặt rác DPPH, FRAP và ABTS. Mối tương quan cao nhất (r =0. 998, R 2=0. 997) được tìm thấy giữa tổng hàm lượng phenolic và xét nghiệm nhặt rác ABTS. Ngoài ra, mối tương quan thuận giữa ABTS và TPC (R 2=0. 885) và DPPH (R 2=0. 999), tương ứng, trong lá Gynura procumbens đã được báo cáo bởi Kaewseejan et al. [32].

Mối tương quan giữa các đặc tính sinh học và hoạt tính ức chế được tìm thấy trong nghiên cứu của Quan và cộng sự. [33] người đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và khả năng ức chế bệnh tiểu đường của các chất chiết xuất từ ​​vỏ cây C.tramden. Kết quả của họ cũng cho thấy rằngchất chống oxy hóacác xét nghiệm (bao gồm DPPH, ABTS, khử điện và oxit nitric) có tương quan chặt chẽ với xét nghiệm ức chế -amylase và -glucosidase ở p<>

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

3. Vật liệu và Phương pháp 3.1.Silk Cốc 00 ns

Nangsew và Eri chủng loại kén tơ Thái Lan đã được thu thập. CácNangsew căng thẳng(kén vàng) được lấy từ Baan Hua Saban, Huyện Phutthaisong, Tỉnh Buriram, Thái Lan. Dòng Eri (kén trắng) đến từ Cộng đồng Nong Ya Plong, Mancha Khiri, tỉnh Khon Kaen, Thái Lan.

3.2. Hóa chất và Thuốc thử

Tất cả các tiêu chuẩn được lấy từ Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ), bao gồm các axit amin thiết yếu: phenylalanin, valine,tryptophan, threonine, isoleucine, methionine, histidine, arginine, lysine và leucine. Các axit amin không thiết yếu được nghiên cứu là glycine, axit glutamic, axit aspartic, glutamine, serine, tyrosine, alanin và asparagin. Thuốc thử xác định hoạt tính chống oxy hóa thu được từ thuốc thử Sigma-Aldrich Co: Folin-Ciocalteu, 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH), 2,4, 6- tripiridyl-s-triazine (TPTZ), 2,2'-and-bis (3- thylbenzthiazoline -6- axit sulphonic) (ABTS). Các dung môi và thuốc thử được sử dụng trong phân tích HPLC được mua từ Merck (Darmstadt, Đức). -Amylase (từ Aspergillus oryzae), -Glucosidase (từ Bacillus stearothermophilus), p-nitrophenyl - - D-glucopyranoside (PNP-G), albumin huyết thanh bò (BSA) và natri azide được mua từ Sigma-Aldrich Co.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

3.3. Chiết xuất bằng nước cất

Việc chiết xuất được thực hiện bằng phương pháp củaSangwong et al. [34]. Kén tằm đã được cắt thành từng miếng nhỏ. Hai gam các mảnh này được chiết bằng 200 mL nước cất ở 100 độ trong thời gian chiết quy định. Các chất chiết xuất được ly tâm ở 5000 × g trong 10 phút bằng máy ly tâm (Universal 320 / 320R, Hettich, Boucherville, QC, Canada). Các chất chiết xuất được lọc qua giấy Whatman No.1 trong điều kiện chân không để loại bỏ chất không hòa tan, do đó tạo ra chiết xuất protein tơ tằm (SPE).

3.4. Xác định protein

Việc xác định protein được xác định bằng xét nghiệm Bradford [35]. SPE (0. 5 mL) được thêm vào 1. 0 mL dung dịch Bradford và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm protein tham chiếu tiêu chuẩn. Độ hấp thụ của các mẫu được đo ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ khả kiến ​​(Máy quang phổ xách tay DR 2700rM, Hach, Loveland, CO, USA).

3.5. Hàm lượng axit tối thiểu 0- theo LCMS / MS

Việc phân tích axit amin bao gồm máy đo khối phổ ba tứ cực LC-MS-MS (Shimadzu LCMS -8030), một chế độ ion hóa tia điện tử (ESI), tiếp theo là phân tích trong hệ thống Shimadzu HPLC (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) (Chumroenphat và cộng sự [36). Phân tích HPLC liên quan đến tốc độ dòng chảy 0. 2 mL / phút; nhiệt độ của lò cột là 38 độ và bộ lấy mẫu tự động là 4 độ. Pha động được chuẩn bị (A) axit formic trong nước {{1 0}}. 1 phần trăm (o / o) và (B) metanol-nước (50:50); sau đó máy trộn là axit formic 0,1 Phần trăm (o / v). Kim lấy mẫu tự động đã được tẩy rửa bằng metanol trước và sau khi hút mẫu. Các phân tích được thực hiện trong ba lần.

3.6. Tổng hàm lượng phenolic (TPC)

Tổng hàm lượng phenol trong dịch chiết protein tơ tằm được phân tích theo phương pháp Folin-Ciocalteu [3 0]. Một cách ngắn gọn, 0,3 mL SPE được trộn với 2,25 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% hòa tan trong nước cất. Sau khi ủ 5 phút, 2,25 mL dung dịch natri cacbonat (NazCO) 6 phần trăm được thêm vào và để hỗn hợp này để yên trong 90 phút ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ của các mẫu dung dịch được đo ở bước sóng 725 nm bằng máy quang phổ. TPC trong đậu được biểu thị bằng mg đương lượng axit gallic (GAE) trên g trọng lượng khô (mg GAE / g DW). Các phân tích được thực hiện trong ba lần.

3.7. Tổng hàm lượng Flavonoid (TFC)

Tổng hàm lượng flavonoid của SPE được xác định theo Kubota và [3 0], đã được sửa đổi. Nói một cách ngắn gọn, 0. 5 mL của mỗi dung dịch mẫu được trộn với 2,25 ml nước cất và 0. 15 ml NaNO 5%, dung dịch (w / v). Dung dịch được để yên trong 6 phút và sau đó 0. 3 mL AlCl3 10 phần trăm (w / v) được thêm vào dung dịch. Sau 5 phút, thêm 0,1 mL dung dịch NaOH 1 M và sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm bằng máy quang phổ. Kết quả được biểu thị bằng mg rutin đương lượng (RE) trên g trọng lượng khô (mg RE / g DW).

3.8. Hoạt động nhặt rác triệt để của DPPH

Theo Brand-Williams và cộng sự, các hoạt động chống oxy hóa của SPE được xác định là hoạt động thu gom của gốc tự do ổn định 1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) theo Brand-Williams và cộng sự [37]. Chiết xuất protein tơ tằm 0. 1 mL được thêm vào 3 ml metanol 0. 001 M DPPHin. Hỗn hợp được giữ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ. Phương trình tính toán sự ức chế DPPH như sau:

(1) Ức chế (phần trăm)=[(Kiểm soát áp dụng- Ví dụ.) / Áp lực kiểm soát] × 100)

trong đó Abs. mẫu là độ hấp thụ của mẫu và Abs. kiểm soát là độ hấp thụ của kiểm soát.

3.9. Hoạt động chống oxy hóa bằng xét nghiệm ABTS

Phương pháp cation gốc ABTS của Re et al. (1999) [22] đã được sửa đổi để đánh giá tác dụng thu dọn gốc tự do. Dung dịch làm việc ATBS được chuẩn bị bằng cách kết hợp 7,4 mM ABTS và 2,6 mM kali persulfat theo tỷ lệ 1: 1 (v / v), cho phép nó phản ứng trong bóng tối trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng, và sau đó pha loãng nó với nước khử ion . Độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 734 nm bằng máy quang phổ cho đến khi đạt 1,1 ± 0. 02. Sau đó, 150 μL SPE và 2850 μL dung dịch làm việc ATBS được phản ứng trong bóng tối trong 2 giờ sau khi trộn và độ hấp thụ ở bước sóng 734 nm sử dụng máy quang phổ; 100% metanol được sử dụng làm đối chứng. Phương trình tính toán sự ức chế là Công thức (1).

3.10. Thử nghiệm năng lượng chống oxy hóa / khử sắt (FRAP)

Khả năng khử của các chất chiết xuất dựa trên xét nghiệm FRAP [23]. Thuốc thử FRAP mới được chuẩn bị bằng cách trộn 1 0 0 mL đệm axetat (0,3 mol LI, pH 3,6), 10 mL TPTZsolution hòa tan trong 10 mL 40 mmol L -1 HCland 10 mL 20mmolL -1 FeCl; theo tỷ lệ 10∶1∶1 và 120 ml nước cất ở 37 độ. Một cách ngắn gọn, 60 μL SPE và 180uL nước khử ion được thêm vào 1,8 mL thuốc thử FRAP. Dung dịch được lắc bằng cách trộn xoáy. Sau khi dung dịch được ủ trong nồi cách thủy ở 37 độ trong 4 phút, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 593 nm so với đối chứng. Giá trị FRAP được hiển thị dưới dạng mg FeSO4 trên mỗi g chất khô (mg FeSO4 / g DW).

3.11 Hoạt động ức chế chống lại Enzyme -Amylase

Hoạt động ức chế enzym -Amylase được đo bằng phương pháp của Xiao et al. (2 0 06) [38] với các sửa đổi nhỏ. Chất nền được chuẩn bị bằng cách đun sôi 100 mg tinh bột khoai tây trong 5 mL đệm phosphat (pH 7,0) trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. SPE （50μL）, chất nền （300μL） và dung dịch -amylase 5ug / mL （20μL） được trộn và dung dịch được ủ ở 37 độ trong 15 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 50 μL HCl 1 M, và sau đó thêm dung dịch iốt 50μL. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 650nm bằng đầu đọc vi tấm. Acarbose được sử dụng như một đối chứng tích cực. Phần trăm ức chế của x-amylase được đánh giá theo Công thức (1).

3.12 Hoạt động ức chế chống lại Enzyme -Glucosidase

Thử nghiệm ức chế enzym -glucosidase được thực hiện theo phương pháp của Wang và Zhao [39] .SPE (2mL hòa tan trong dimethylsulfoxide; DMSO) và 0. 5 U / mL a-glucosidase (4 0 mL) được trộn trong 12 0 mL dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 7,0). Sau khi ủ trước 5 phút, dung dịch 5 mM p-nitrophenyl - - D-glucopyranoside (40 mL) được thêm vào và dung dịch này được ủ ở 37 độ trong 30 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 405 nm bằng đầu đọc vi tấm quang phổ kế hấp thụ UV / Vis. Tỷ lệ ức chế -glucosidase được đánh giá theo Công thức (1).

3.13.Đánh giá hoạt động hình thành chống AGEs

Khả năng ức chế sự hình thành AGEs của protein tơ và các phân đoạn của nó được đo bằng phương pháp của Vinson và Howard [4 0]. Tổng thể tích của dung dịch phản ứng glycation （2,5 mL） được chuẩn bị bằng cách trộn 5 {{1 0}} 0 μL SPE, 500 μL 20 mg / mL BSA trong đệm phốt phát, 500 μL 0,5 M glucose trong đệm photphat và 1mL dung dịch đệm photphat 0,1 M ở pH 7,4 chứa 0,02 phần trăm (w / v) natri azit. Hỗn hợp này được ủ ở 37 độ trong 5 ngày trong bóng tối và sau đó số lượng AGE huỳnh quang hình thành được xác định bằng cách sử dụng máy đo phổ huỳnh quang có bước sóng kích thích là 330 nm và bước sóng phát xạ là 410 nm. Phần trăm hình thành chất chống AGEs được tính toán dựa trên cường độ huỳnh quang (FI) thu được bằng cách sử dụng công thức sau: (2) n=[1- (FIsample - FIsample blank) / (control-control blank )] × 100 trong đó Flsample là cường độ huỳnh quang của mẫu, mẫu trắng là cường độ huỳnh quang của mẫu trắng, đối chứng là cường độ huỳnh quang của mẫu đối chứng và mẫu trắng FIcontrol là cường độ huỳnh quang của mẫu trắng đối chứng.

3,14. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). Kết quả được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của ba lần lặp lại và dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) với kiểm định sai khác có ý nghĩa nhỏ nhất (LSD) để xác định ý nghĩa so với đối chứng và mối tương quan của Pearson kiểm tra để đánh giá mối tương quan giữa các phương tiện. Trong mọi trường hợp, p<0.05 was="" considered="">

4.Kết luận

Nghiên cứu của chúng tôi về tác dụng của chiết xuất protein tơ tằm liên quan đến chiết xuất bằng nước cất ở 100 độ trong sáu giờ; quy trình này đã cung cấp các giá trị cao nhất về hàm lượng protein, axit amin, tổng hàm lượng phenol (TPC), tổng hàm lượng flavonoid (TFC), hoạt động loại bỏ gốc DPPH, thử nghiệm khả năng loại bỏ gốc ABTS, thử nghiệm FRAP, chống - - amylase, chống a-glucosidase, và chống glycation khi so sánh với thời gian chiết xuất khác. Ngoài ra, SPE của các chủng Nangsew cung cấp hàm lượng cao hơn của tất cả các chất có lợi về mặt dinh dưỡng này, khi so sánh với chiết xuất của các chủng Eri. Kết quả cho thấy Nangsew sẽ là dòng được ưa thích cho các kế hoạch liên tục của chúng tôi để phát triển một chất phụ gia tự nhiên cho thực phẩm chức năng, dựa trên sericin chiết xuất trong quá trình xử lý kén, mang lại cơ hội thay thế trong sản xuất đồ uống chức năng.

Sự đóng góp của tác giả:Khái niệm hóa, CBand SS; Phương pháp luận, CBand SS; Xác thực, CBand SS; Phân tích chính thức, CBand SS; Điều tra, CBand SS; Viết — Chuẩn bị Bản thảo gốc, CBand SS; Viết — Đánh giá và Biên tập, CBand SS; Hình ảnh hóa, CBandS.S. Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản bản thảo đã được xuất bản.

Kinh phí:Nghiên cứu này được tài trợ bởi Công ty TNHH Nghiên cứu và Đổi mới Khoa học Thái Lan (TSRI) và Siam Natural Products Co., Ltd.

Tuyên bố của Hội đồng Rà soát Thể chế:Không áp dụng.

Tuyên bố đồng ý được thông báo:Không áp dụng. Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu: Không áp dụng.

Sự nhìn nhận:Trung tâm Thiết bị Phòng thí nghiệm của Đại học Mahasarakham để hợp tác và cung cấp các hỗ trợ khoa học. Cũng xin cảm ơn Colin Wrigley, Đại học Queensland, Úc, đã hiệu đính tiếng Anh.

Xung đột lợi ích:Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Bài viết này được trích từ Molecules 2021, 26, 2033. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules