Tác dụng miễn dịch của Cistanche Polysaccharides đối với bệnh bạch cầu

Tác giả:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Nội Mông, Trung Quốc

Để điều tra hiệu ứng apoptotic củaCistanche polysaccharides( CDP) trên con ngườiBệnh bạch cầu cấp tínhdòng tế bào Jurkat tế bào．Phương phápThử nghiệm MTT đã được áp dụng để phát hiện ảnh hưởng của CDP đối với sự tăng sinh tế bào, Western blotting được sử dụng để phát hiện sự kích hoạt của caspase -9 và caspase -3, và các phân tử tín hiệu apoptotic cũng được thử nghiệm．Kết quảSự tăng sinh tế bào T bị ức chế bởi 1 mg / ml và 2 mg / ml CDP, Quá trình tự chết của tế bào T được gây ra bởi 5 mg / ml CDP, vàbiểu thức của pro-caspase -9 và pro-caspase -3 đã giảm đáng kể． Sự biểu hiện của các thụ thể bề mặt tế bào CD45 và CD71 bị ức chế đáng kể bởi CDP 5 mg / ml, Quá trình phosphoryl hóa EＲK được tạo ra, và quá trình phosphoryl hóa JNK bị ức chế．

Kết luận

【Từ khóa】Cistanche polysaccharides; Sự chết tế bào; Ｒeceptor; caspase -9; caspase -3

Bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (ALL) là một bệnh vô tính ác tính của hệ bạch huyết với mức độ không đồng nhất kiểu miễn dịch cao. , dễ tái phát, vân vân. Hiện nay, các phương pháp điều trị thường được áp dụng bao gồm ghép tủy xương, liệu pháp cảm ứng, liệu pháp miễn dịch, hóa trị kết hợp, ... Do khả năng tiêu diệt khối u của hầu hết các loại thuốc hóa trị còn hạn chế nên chúng có thể gây tổn thương nghiêm trọng đến hệ tiêu hóa, hệ thống máu, tim mạch và mạch máu não, vv Trong khi điều trị, nó thường đi kèm với các phản ứng phụ nghiêm trọng, một số trong số đó thậm chí gây tử vong. Khi quá trình hóa trị tiến triển, cơ thể có xu hướng phát triển khả năng dung nạp với các loại thuốc hóa trị, làm tăng nguy cơ tái phát bệnh.

Do đó, việc tìm kiếm liệu pháp điều trị bệnh bạch cầu hiệu quả cao, ít độc tính và có mục tiêu cao hoặc liệu pháp bổ trợ đã trở thành tâm điểm của sự chú ý hiện nay.Cistancheđược gọi là Chagangaoya trong tiếng Mông Cổ. Nó thuộc về họ Ledangaceae và chi Cistanche. Nó ký sinh trên rễ của cây sa mạc và có tiếng là "nhân sâm sa mạc".

Các thành phần hoạt chất chính của Cistanche bao gồm glycosides phenylethanoid, lignans, betaines, sterol, axit amin và polysaccharides. Chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và các tác dụng khác.

Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằngCistanche polysaccharide (CDP),là một trong những thành phần hoạt động chính của nó,có tác dụng chống khối u và điều hòa miễn dịch.Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng CDP có tác dụng tiêu diệt đáng kể đối với các tế bào bệnh bạch cầu K562 và THP -1, và cho rằng CDP có một vai trò nhất định trongphòng ngừa hoặc điều trị bệnh bạch cầu. Ngoài ra, trong hợp chất y học cổ truyền Trung Quốc, cistanche, để điều trị cấp tínhbệnh bạch cầu, Cistanchecũng đóng vai trò là một trong những thành phần quan trọng. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động cụ thể củaCistanchekhông được biết đến. Trong bài báo này, việc cô lập và thanh lọcCistanche CDPđã được nghiên cứu, và tác động tiêu diệt và cơ chế liên quan của CDP trên dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính ở người Jurkat đã được nghiên cứu.

1.1 Thuốc thử và dụng cụ chính

Bột Cistanche được mua từ Tứ Xuyên WecistancheGroup Co, Ltd., dòng tế bào bạch cầu cấp tính ở người Jurkat được mua từ ngân hàng tế bào của Viện Sinh học Tế bào Thượng Hải, thiazole blue (MTT) và sodium dodecyl sulfate (SDS) được mua từ Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., huyết thanh bò thai (FBS) được mua từ Công ty TNHH Vật liệu kỹ thuật sinh học Hàng Châu Sijiqing, caspase chứa cysteine ​​-3, caspase -9, CD71, CD45, kinase đầu cuối amino-end kinase c-Jun được phosphoryl hóa (p -JNK) và kháng thể kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào được phosphoryl hóa (p-ERK) được mua từ Công nghệ tín hiệu tế bào, Hoa Kỳ và kháng thể actin được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Biyuntian Thượng Hải. Điện hóa Chất nền phát quang (ECL) được mua từ Thermo Công ty Khoa học của Hoa Kỳ, và các thuốc thử khác thuộc loại phân tích trong nước. Máy trạm hình ảnh thông minh Gel-View 6000 plus (sản phẩm của Công ty TNHH Công nghệ sinh học Quảng Châu Boluteng), kính hiển vi huỳnh quang lộn ngược Revolve FL (sản phẩm của Phòng thí nghiệm Echo, Hoa Kỳ), đầu đọc vi tấm EPOCH (sản phẩm của Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Tách và tinh chế CDP Lấy 500 gBột chiết xuất Cistanche, ngâm trong ethanol 95% qua đêm, dùng gạc lọc, lấy bã lọc, đun với nước nóng 60 độ trong 2 h / lần, tổng cộng 3 lần. Sau khi kết thúc, dịch lọc được kết hợp ba lần, cô đặc dưới áp suất giảm đến 2/3 thể tích ban đầu, thêm 3 lần thể tích etanol 95%, và để yên ở 4 độ qua đêm. Ngày hôm sau, ly tâm ở 4 000 vòng / phút trong 10 phút, thu kết tủa, loại bỏ protein bằng phương pháp Sevag, kết tủa bằng etanol tuyệt đối, đông khô để thu được CDP.

1.3 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính ở người được bảo quản trong nitơ lỏng trong phòng thí nghiệm Jurkat. Khi được sử dụng, các tế bào được phục hồi nhanh chóng trong bể nước 37 độ và được nuôi cấy trong môi trường RPMI1640 (chứa 100 U / ml penicillin và 100 U / ml streptomycins) với 10% FBS. Các tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm tế bào 37 độ, 5% CO2, được cấy chuyền 2 đến 3 ngày một lần, và các thí nghiệm được thực hiện khi tế bào bước vào giai đoạn tăng trưởng logarit.

1.4 Thí nghiệm MTT Các tế bào Jurkat trong giai đoạn tăng trưởng logarit được lấy, ly tâm để thu được viên tế bào và được đếm ở 5 × 105 tế bào / ml. Lấy đĩa nuôi cấy tế bào 96- giếng, cấy 100 tế bào ul vào mỗi giếng, sau đó thêm môi trường hoàn chỉnh 100 ul RP-MI1640 làm nhóm đối chứng; nhóm thí nghiệm được chia thành 3 nhóm, trước hết sử dụng môi trường RPMI1640 để chuẩn bị các nồng độ CDP khác nhau, sau đó thêm 100 ul môi trường RP-MI1640 vào mỗi giếng. Tế bào ul Jurkat và dung dịch 100 ul CDP được sử dụng để tạo ra nồng độ cuối cùng của CDP lần lượt là 1, 2 và 5 mg / ml. Mỗi nhóm được thiết lập với 5 giếng nhân đôi và được ủ trong tủ ấm tế bào 37 độ trong 48 giờ. Sau khi ủ, thêm 20 ul MTT (nồng độ của dung dịch gốc là 5 mg / ml) vào mỗi giếng, đưa trở lại tủ ấm tế bào, và tiếp tục ủ trong 4 giờ, và cuối cùng thêm 100 ul 20%. SDS để hòa tan formazan ở 37 độ qua đêm, và sử dụng vào ngày hôm sau. Độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm của mỗi nhóm được phát hiện bằng đầu đọc vi tấm, và tỷ lệ ức chế của các nồng độ khác nhau của CDP đối với sự tăng sinh tế bào Jurkat được tính theo công thức.

1.5 Tế bào Jurkat thấm Western trong giai đoạn tăng trưởng logarit được lấy và gieo hạt trong 6- đĩa giếng ở mật độ 2 × 105 tế bào / ml, 500 ul / giếng và môi trường hoàn chỉnh 500 ul RPMI1640 đã được thêm vào đối chứng tập đoàn. Thiết lập 3 nhóm thí nghiệm, nhóm xử lý polysaccharide 1, 2 và 5 mg / ml, CDP

Được hòa tan trước trong môi trường hoàn chỉnh RPMI164 0, 500 ul tế bào và 500 ul dung dịch CDP có nồng độ khác nhau được thêm vào đĩa 6- giếng và ủ ở 37 độ trong 48 giờ. Sau khi nuôi cấy, huyền phù tế bào của mỗi nhóm được thu thập, ly tâm ở 1 500 r / min trong 5 phút để thu được các viên tế bào và được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat đã làm lạnh trước (PBS). Sau khi rửa, 20 ul dung dịch đệm ly giải tế bào được thêm vào mỗi nhóm, và các tế bào được ly giải trên đá trong 30 phút. Tổng số protein được chiết xuất và nồng độ tế bào được điều chỉnh bằng phương pháp của Bradford. 20 ug protein được lấy từ mỗi nhóm để điện di trên gel SDS-polyacrylamide (PAGE), và protein được chuyển sang màng polyvinylidene fluoride (PVDF) bằng phương pháp điện di. Được tạo khối bằng sữa bột không béo ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, được thêm vào kháng thể caspase -3 và caspase -9 của thỏ với tỷ lệ pha loãng 1: 1 000, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ h, tráng 3 lần bằng máy lắc đệm phosphat Tween (PBST) (10 phút / lần), thêm kháng thể thứ cấp gắn nhãn peroxidase củ cải ngựa (HRP) (1: 1 000), ủ trong 1 h ở nhiệt độ phòng, rửa sạch 3 lần với PBST, tráng 1 lần với PBS, thêm chất nền ECL và sử dụng Máy trạm hình ảnh thông minh được sử dụng để chụp ảnh và sự thay đổi băng tần của mỗi nhóm được so sánh để nghiên cứu quá trình apoptosis của tế bào Jurkat do CDP gây ra. Để phát hiện các protein liên quan đến con đường apoptosis, điều kiện nuôi cấy tế bào và điều trị CDP giống như trên. Sau phản ứng, tế bào được ly giải để định lượng protein. Protein được chuyển sang màng PVDF bằng SDS-PAGE và quá trình điện hóa. Sau khi ngăn bằng sữa bột gầy trong 1 giờ, các kháng thể kháng CD71, CD45, p-JNK và p-ERK (1: 1 000) được thêm vào và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Kháng thể thứ cấp được đánh dấu HRP (1: 1 000) được ủ trong 1 giờ và cuối cùng, trạm xử lý hình ảnh thông minh được sử dụng để tạo hình ảnh nhằm nghiên cứu các phân tử tín hiệu liên quan của quá trình chết rụng tế bào Jurkat do CDP gây ra. Các dải thử nghiệm kết quả được chia tỷ lệ xám với Hình ảnh J (1.8.0).

Bấm vào đây để biết tác dụng của Cistanche trong việc chống khối u và tác dụng chống ung thư

1.6 Phân tích thống kê phần mềm SPSS21. 0 được sử dụng để kiểm định t và phân tích phương sai

2 kết quả của chức năng Cistanche trênbệnh bạch cầu

2.1 Mức độ tăng sinh tế bào

CDP đã được phân lập thành công, với hàm lượng đường hơn 9 {{2 0}} phần trăm và hàm lượng protein ít hơn 5 phần trăm. Tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào ở nhóm CDP 1 mg / ml là (19. 1 ± 2. 1) phần trăm, trong khi tỷ lệ này ở nhóm CDP 2 mg / ml và 5 mg / ml là (44. 2 ± 5. 2 )) phần trăm và (47. 8 ± 4. 4) phần trăm, chỉ ra rằng CDP có thể ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào Jurkat theo cách phụ thuộc vào liều lượng. 2.2 So với nhóm kiểm soát (0. 62 ± 0. 0 4, 0. 56 ± {{4 0}}. {{49 }} 7), mức độ apoptosis trong các tế bào Jurkat được xử lý với 5 mg / ml CDP đã tạo ra các enzym caspase -9 và caspase {{3 0}}. Pro-form pro-caspase -9 (0. 0 9 ± 0. 0 2) và pro-caspase -3 ({{ 63}}. 12 ± {65}}. 01) đã giảm đáng kể và nhóm CDP 1 mg / ml và 2 mg / ml kém hiệu quả hơn đáng kể đối với pro-caspase -3 trong tế bào. Hàm lượng Caspase -9 (0,58 ± 0,04, 0,51 ± 0,01) và pro-caspase -3 (0,48 ± 0,04, 0,44 ± 0,05) không có ảnh hưởng đáng kể, nghĩa là, nồng độ CDP thấp không gây ra apoptosis của các tế bào Jurkat, nhưng chủ yếu bị ức chế sự tăng sinh tế bào, như trong Hình 1.

1-4: nhóm tham chiếu,

Nhóm CDP 1 mg / ml, nhóm CDP 2 mg / ml, nhóm CDP 5 mg / ml; giống như hình sau

Hình 1 Ảnh hưởng của CDP đối với caspase -9 và caspase -3 trong các ô Jurkat

Ảnh hưởng của polysaccharides Cistanche Ảnh hưởng đến bệnh bạch cầu

2.3 Các mức biểu hiện tương đối của CD71 và CD45 trong nhóm kiểm soát thụ thể apoptosis là 1. 00 ± 0. 0 4, {{1 0}}. 54 ± 0. {{2 0}} 2. Nhóm CDP 5 mg / ml có thể ức chế đáng kể CD71 (0. 0 5 ± 0. 0 2). 0 1) và CD45 (0. 13 ± {{4 0}}. 03); Nhóm CDP 1 mg / ml và 2 mg / ml có thể ức chế sự biểu hiện của CD71 (0. 52 ± 0. 06, 0. 43 ± 0. 07) ở một mức độ nhất định Không có ảnh hưởng đáng kể đến sự biểu hiện của CD45 (0.51 ± 0,01, 0,48 ± 0,02). Xem Hình 2.

Hình 2 Ảnh hưởng của CDP đến sự biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt màng tế bào

2.4 Các con đường liên quan đến apoptosis

Các mức biểu thức tương đối của p-JNK và p-ERK trong nhóm tham chiếu là 1,2 0 ± 0. 0 8 và 0. 21 ± 0 . 0 3, tương ứng. Nhóm CDP 5 mg / ml gây ra apoptosis và làm giảm đáng kể mức độ phosphoryl hóa của JNK. (0. 32 ± 0. 0 4), làm tăng đáng kể mức độ phosphoryl hóa của ERK (1. 13 ± 0. 0 5); 1 mg / ml, 2 mg / ml CDP làm tăng mức độ phosphoryl hóa của JNK (1. 12 ± 0. 06, 1. 06 ± 0. 06) không có tác dụng đáng kể, nhưng vẫn làm tăng mức độ phosphoryl hóa của ERK (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Xem Hình 3.

Hình 3 Ảnh hưởng của CDP đến quá trình phosphoryl hóa JNK và ERK

3 Thảo luận

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng CDP có tác dụng ức chế nhất định đối với các dòng tế bào bệnh bạch cầu, nhưng cơ chế hoạt động cụ thể vẫn chưa được biết rõ.

Trong quá trình apoptosis, caspase -9 là một trong những phân tử tín hiệu ngược dòng trong quá trình apoptosis phụ thuộc vào caspase. Sau khi kích thích tín hiệu, pro-caspase -9 bị thủy phân ồ ạt để tạo ra dạng hoạt hóa của caspase -9, tiếp tục truyền tín hiệu apoptotic xuống dưới để thúc đẩy quá trình apoptosis. Caspase -3 là một phân tử caspase loại hiệu ứng và là một phân tử tín hiệu quan trọng trong quá trình apoptosis phụ thuộc vào caspase của tế bào. Nó cũng tồn tại ở dạng pro-enzyme (pro-caspase -3) trong điều kiện bình thường. Sau khi được kích hoạt bằng cách thủy phân, một lượng lớn caspase phân cắt được tạo ra. -3, nó sẽ ly giải nhiều loại phân tử protein quan trọng trong tế bào và cuối cùng gây ra quá trình chết rụng. CDP thuộc về các polysaccharid hoạt động của các đại phân tử sinh học và không thể tự do xâm nhập vào tế bào qua màng tế bào. Do đó, CDP gây ra quá trình apoptosis bằng cách ảnh hưởng đến sự biểu hiện và phân bố của các thụ thể trên bề mặt của màng tế bào Jurkat, do đó truyền tín hiệu đến bên trong tế bào, và cuối cùng kích hoạt họ caspase. protein, dẫn đến quá trình apoptosis của tế bào. Nghiên cứu này cho thấy nồng độ CDP thấp không gây ra quá trình apoptosis của tế bào Jurkat mà chủ yếu ức chế sự tăng sinh của tế bào. CD71, còn được gọi là thụ thể transferrin, là một thụ thể glycoprotein xuyên màng loại II liên quan đến việc hấp thụ sắt và điều chỉnh sự tăng trưởng và phát triển của tế bào. CD71 được biểu hiện nhiều ở những bệnh nhân bị bệnh bạch cầu cấp tính và có liên quan đến tình trạng kháng thuốc nguyên phát, tức là sự biểu hiện của CD71. Giá trị càng cao thì tác dụng của hóa trị đầu tiên càng kém. Do đó, CD71 là một trong những dấu hiệu để chẩn đoán phụ trợ. CD45 được biểu hiện trên bề mặt của tất cả các loại bạch cầu, còn được gọi là kháng nguyên chung bạch cầu. Nó thuộc về glycoprotein xuyên màng loại I và có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển và biệt hóa của tế bào T. CD45 có các mức độ biểu hiện khác nhau và các loại dị ứng trong các loại bệnh bạch cầu khác nhau, vì vậy nó có thể được sử dụng như một trong những dấu hiệu để chẩn đoán phân biệt và xác định kiểu miễn dịch của bệnh bạch cầu. Kháng thể đơn dòng CD45 đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh bạch cầu, đặc biệt là bệnh bạch cầu kháng thuốc. Friesen và cộng sự. tìm thấy rằng các hạt nhân phóng xạ

CD45 mAb được gắn thẻ có thể gây ra apoptosis trong các dòng tế bào bệnh bạch cầu kháng thuốc bằng cách kích hoạt các protein họ caspase (bao gồm caspase -3, caspase -8 và caspase -9). CDP gây ra quá trình apoptosis của tế bào Jurkat, trước hết bằng cách tác động lên các thụ thể trên bề mặt màng tế bào CD45 và CD71, ảnh hưởng đến sự biểu hiện và phân phối của cả hai, truyền tín hiệu apoptosis vào tế bào và cuối cùng kích hoạt caspase -9 và caspase {{8 }}, kích hoạt quá trình apoptosis. Tuy nhiên, cả caspase -9 và caspase -3 đều nằm ở hạ lưu của con đường apoptotic và các phân tử tín hiệu ngược dòng cần được khám phá thêm. Trong nghiên cứu này, CDP ở nồng độ 5 mg / ml gây ra quá trình apoptosis của tế bào Jurkat trong khi ức chế sự biểu hiện của CD45, tương tự như của kháng thể đơn dòng CD45 được mô tả ở trên. Do đó, từ quan điểm của các thụ thể liên quan đến quá trình apoptosis CD45 và CD71,Cistanchecó một tiềm năng nhất định để điều trị hoặc điều trị bổ trợ bệnh bạch cầu.Hệ thống protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) được biểu hiện trong tất cả các tế bào nhân thực.

Viên nén Cistanche để cải thiện hệ thống miễn dịch điều trị bệnh bạch cầu

Nó là một con đường truyền thông tin rất quan trọng dẫn truyền tín hiệu kích thích ngoại bào vào nội bào và được cấu tạo bởi các kinase protein serine / threonine, bao gồm ERK, JNK và p38MAPK. Quá trình phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa của nó là công tắc của các hoạt động sống của tế bào và tham gia vào Và điều chỉnh quá trình phát triển, tăng sinh, biệt hóa, kích hoạt và apoptosis của tế bào. Nghiên cứu này cho thấy rằng quá trình khử phosphoryl hóa JNK có liên quan đến quá trình tự chết của tế bào T do CDP gây ra, trong khi quá trình phosphoryl hóa ERK tham gia vào hai quá trình trong đó CDP ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra quá trình chết rụng.

Tóm lại là,Cistanche CDPcó tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào bệnh bạch cầu lympho T Jurkat, cho thấy nồng độ thấp (dưới 2 mg / ml) ức chế sự tăng sinh tế bào, trong khi nồng độ cao (5 mg / ml) gây ra hiện tượng apoptosis.Cistanche CDPgây ra quá trình apoptosis ở tế bào Jurkat chủ yếu bằng cách ảnh hưởng và thay đổi tế bào.

Sự biểu hiện của các thụ thể liên quan đến quá trình apoptosis CD71 và CD45 trên bề mặt màng sẽ truyền tín hiệu đến bên trong tế bào, tiếp tục gây ra quá trình phosphoryl hóa ERK và khử phosphoryl hóa JNK, và cuối cùng là hoạt hóa caspase -9, từ đó kích hoạt caspase {{4} } để tạo ra apoptosis.