Chiết xuất Cistanche Deserticola làm tăng sự hình thành xương ở nguyên bào xương
Mar 05, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,evà Chih-Hsin Tangf,c
trừu tượng
Mục tiêu:Chúng tôi đã điều tra ảnh hưởng củaCistanche Desticola Ma. (CD) về quá trình tạo xương bằng nguyên bào xương nuôi cấy.Phương phápThử nghiệm hình thành nốt khoáng hóa được sử dụng để kiểm tra tác động in-vitro của CD đối với sự hình thành xương. Alkaline phosphatase (ALP), protein di truyền hình thái xương (BMP) -2 và biểu hiện mRNA của osteopontin (OPN) được phân tích bằng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng. Cơ chế hoạt động của chiết xuất CD đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phương pháp thấm phương Tây. Tác dụng chống loãng xương in-vivo của chiết xuất CD đã được đánh giá trên chuột đã cắt buồng trứng.Những phát hiện chínhChiết xuất CD không ảnh hưởng đến sự tăng sinh, di chuyển hoặc chữa lành vết thương của nguyên bào xương được nuôi cấy, nhưng làm tăng ALP, BMP -2 và OPN mRNA và khoáng hóa xương. Protein kinase được kích hoạt bởi mitogen (MAPK) hoặc chất ức chế yếu tố hạt nhân (NF) -kB làm giảm sự hình thành xương do chiết xuất CD và biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN. Tuy nhiên, chiết xuất CD không ảnh hưởng đến quá trình tạo tế bào xương. Ngoài ra, chiết xuất CD đã ngăn ngừa sự mất xương do cắt buồng trứng in vivo.Kết luậnCD có thể là một chất tạo xương mới để điều trị chứng loãng xương.
Giới thiệu
Xương là một mô phức tạp bao gồm một số loại tế bào trải qua một quá trình đổi mới và sửa chữa liên tục được gọi là 'tái tạo xương'. Hai loại tế bào chính chịu trách nhiệm cho quá trình tái tạo xương là tế bào hủy xương, có chức năng hấp thụ lại xương và nguyên bào tạo xương, tạo ra xương mới. Tái tạo xương được điều chỉnh bởi một số hormone toàn thân (ví dụ như hormone tuyến cận giáp, 1, 25- hydroxyvitamin D3, hormone sinh dục và calcitonin) và các yếu tố tại chỗ (ví dụ như oxit nitric, prostaglandin, yếu tố tăng trưởng và cytokine). [1]
Loãng xương là kết quả khi quá trình tiêu hóa và tạo xương diễn ra không phối hợp và quá trình phân hủy xương vượt quá quá trình tạo xương. [2] Các phương pháp điều trị loãng xương hiện nay bao gồm bisphosphonates, calcitonin và estrogen, là những chất ức chế tiêu xương, duy trì khối lượng xương bằng cách ức chế hoạt động của tế bào hủy xương. [3] Tuy nhiên, tác dụng của những loại thuốc này trong việc tăng hoặc phục hồi khối lượng xương là tương đối nhỏ, chắc chắn không quá 2 phần trăm mỗi năm. [3] Do đó, cần có các chất xây dựng xương, chẳng hạn như teriparatide, kích thích sự hình thành xương mới và điều chỉnh sự thay đổi trong vi kiến trúc trabecular vốn là đặc điểm của chứng loãng xương đã hình thành. [4,5] Bởi vì sự hình thành xương mới chủ yếu là chức năng của nguyên bào xương, các tác nhân hoạt động bằng cách làm tăng sự phát triển của các tế bào thuộc dòng nguyên bào xương hoặc gây ra sự biệt hóa của các nguyên bào xương có thể tăng cường sự hình thành xương. [5,6]
Mặc dù các cơ chế của bệnh loãng xương vẫn chưa rõ ràng, chúng có thể liên quan đến việc giảm khả năng sẵn có hoặc ảnh hưởng của các yếu tố tăng trưởng xương, chẳng hạn như protein di truyền hình thái xương (BMP). [7] BMP, có cấu trúc liên quan đến siêu họ yếu tố tăng trưởng chuyển đổi-b, ban đầu được xác định bởi khả năng tạo xương ngoài tử cung ở động vật gặm nhấm. [8] BMP đóng một vai trò quan trọng trong quá trình hình thành xương và biệt hóa tế bào xương bằng cách kích thích hoạt động của men phosphatase kiềm (ALP) cũng như tổng hợp proteoglycan, collagen và osteopontin (OPN). [9] Một nghiên cứu gần đây đã tìm thấy mối liên hệ giữa bệnh loãng xương và các đa hình cụ thể trong gen BMP -2, ALP và OPN, cho thấy chúng có liên quan đến sự phát triển của bệnh loãng xương. [10]
Cistanche Desticola Ma.(Orobanchaceae; viết tắt là CD) là một loại thảo mộc bản địa ở Trung Quốc và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một chất điều trị do đặc tính an thần, giảm đau và kích thích miễn dịch. [11] Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã chỉ ra rằng chất chiết xuất từ CD có thể kích thích khả năng miễn dịch, [12] quét các gốc tự do [13], và tăng hoạt động của superoxide dismutase. [14] Các chất chống viêm và chống oxy hóa có khả năng điều trị loãng xương bằng cách tăng hình thành xương và / hoặc ngăn chặn quá trình tiêu xương. [15,16] Tuy nhiên, tác động của CD lên chức năng tế bào xương vẫn chưa được xác định. Ở đây, chúng tôi báo cáo rằng chiết xuất CD không ảnh hưởng đến sự tăng sinh, di chuyển hoặc hoạt động chữa lành vết thương của nguyên bào xương được nuôi cấy, nhưng đã làm tăng biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN và khoáng hóa xương. Ngoài ra, chúng tôi cho thấy rằng các con đường truyền tín hiệu do mitogen hoạt hóa protein kinase (MAPK) và yếu tố hạt nhân (NF) -kB có thể tham gia vào quá trình gia tăng biểu hiện gen và khoáng hóa xương qua trung gian CD. Ngược lại, dịch chiết CD không ngăn chặn quá trình tạo xương trong ống nghiệm. Đáng chú ý, việc điều trị chuột bằng chiết xuất CD đã ngăn ngừa mất xương do phẫu thuật cắt buồng trứng in vivo. Do đó, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng CD có thể được sử dụng để kích thích sự hình thành xương để điều trị chứng loãng xương.
Cistanche Desticola
Nguyên liệu và phương pháp
Chiết xuất và nguyên liệu Cistanche Desticola
Chiết xuất CD được mua từ Công ty Dược phẩm Chuang Song-Zong (Cao Hùng, Đài Loan). Việc chiết xuất và phân lập CD đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (trên cơ sở dữ liệu quang phổ, họ đã xác định được thành phần hóa học bao gồm beta-sitosterol, daucosterol, axit succinic, triacontanol, acteoside, betaine và polysaccharide). [17] Các kháng thể đa dòng của thỏ đặc hiệu cho các kinase điều chỉnh tín hiệu p-ngoại bào (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun kinase đầu N (JNK), JNK, p-p65 và p65 đã được mua từ Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, Hoa Kỳ). Bộ công cụ ELISA osteocalcin được mua từ Biosource Technology (Nivelles, Bỉ). Các telopeptide tận cùng C của kit ELISA collagen loại I được lấy từ Cross Laps (Herlev, Đan Mạch). Đột biến âm tính trội p38 được cung cấp bởi Tiến sĩ J. Han (Trung tâm Y tế South-Western, Dallas, Hoa Kỳ). Đột biến âm tính trội JNK được cung cấp bởi Tiến sĩ M. Karin (Đại học California, San Diego, Hoa Kỳ). Đột biến âm tính trội ERK2 được cung cấp bởi Tiến sĩ M. Cobb (Trung tâm Y tế Tây Nam). Tất cả các thuốc thử khác được lấy từ Sigma-Aldrich (St Louis, Hoa Kỳ).
Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào nguyên bào xương của murine MC3T 3- E1 được mua từ American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Tế bào được nuôi cấy trong 95% không khí, 5% CO2 với a-MEM được bổ sung 20 mm HEPES và 10% huyết thanh bê thai bất hoạt nhiệt, 2 mm-glutamine, penicillin (100 U / ml) và streptomycin (100 mg / ml).
Đo sự hình thành nốt khoáng
Sự hình thành nốt khoáng được đánh giá như mô tả. [18] Tóm lại, nguyên bào xương được nuôi cấy trong môi trường có chứa vitamin C (50 mg / ml) và b-glycerophosphat (10 mm) trong hai tuần, và môi trường được thay đổi ba ngày một lần. Sau khi ủ với dịch chiết CD trong 12 ngày, các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm Tris 20 mm có chứa
0. 15 m NaCl (pH 7,4), cố định trong etanol 75% (v / v) lạnh trong đá trong 30 phút và được làm khô trong không khí. Sự lắng đọng canxi được xác định bằng phương pháp nhuộm alizarin red-S. Một cách ngắn gọn, các tế bào và chất nền cố định bằng etanol được nhuộm trong 1 giờ với 40 mm alizarin red-S (pH 4,2) và rửa sạch bằng nước. Vết liên kết được rửa giải với 10 phần trăm (w / v) cetylpyridinium clorua, và alizarin red-S trong các mẫu được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm và so sánh với đường chuẩn. Một mol alizarin red-S liên kết chọn lọc với khoảng hai mol canxi.
Định lượng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực
RNA tổng số được chiết xuất từ nguyên bào xương bằng kit TRIzol (MDBio Inc., Đài Bắc, Đài Loan). Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng 2 mg RNA tổng số và một đoạn mồi oligo (dT). [19,20] Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng (qPCR) được thực hiện bằng cách sử dụng TaqMan® một bước PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, HOA KỲ). Tổng cDNA đã được thêm vào (100 ng cho mỗi 25- ml phản ứng) với các đoạn mồi cụ thể theo trình tự và đầu dò Taqman®. Tất cả các đoạn mồi và mẫu dò gen mục tiêu đã được mua thương mại, bao gồm b-actin như một chất kiểm soát nội bộ (Hệ thống sinh học ứng dụng). Các xét nghiệm qPCR được thực hiện ba lần trên hệ thống phát hiện trình tự Ste-pOnePlus (Hệ thống sinh học ứng dụng). Các điều kiện chu kỳ là 10- phút kích hoạt polymerase tối thiểu ở 95 độ, sau đó là 40 chu kỳ 95 độ trong 15 giây và 60 độ trong 60 giây. Ngưỡng được đặt phía trên nền kiểm soát không phải khuôn mẫu và trong giai đoạn tuyến tính của quá trình khuếch đại gen mục tiêu để tính toán số chu kỳ mà bản sao được phát hiện (ký hiệu là CT).
Phân tích Western blot
Dịch ly giải tế bào đã được chuẩn bị như đã mô tả trước đây. [21,22] Protein được phân giải bởi SDS-PAGE và chuyển sang màng Immobilon polyvinyl difluoride (Millipore, Billerica, Hoa Kỳ). Các đốm màu được chặn bằng 4% albumin huyết thanh bò trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó được thăm dò bằng kháng thể kháng người của thỏ chống lại p -65, hoặc p-p65 (1: 1000) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau ba lần rửa, các đốm màu được ủ với kháng thể thứ cấp chống thỏ liên hợp với peroxidase (1: 1000) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các đốm màu được hình dung bằng cách tăng cường phát quang hóa học bằng cách sử dụng phim X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, Hoa Kỳ).
Chứng loãng xương do phẫu thuật cắt buồng trứng
Những con chuột ICR cái, bốn tuần tuổi, nặng 22 ~ 28 g, được sử dụng cho nghiên cứu này. Những con chuột được cắt buồng trứng hai bên khi gây mê trichloro- acetaldehyde (100 mg / kg) và những con chuột đối chứng được phẫu thuật giả (Sham) để so sánh. Mật độ khoáng của xương và hàm lượng chất khoáng của xương được đo sau khi uống các chất chiết xuất từ CD với nồng độ khác nhau hai ngày một lần trong bốn tuần. Tổng mật độ khoáng của xương cơ thể và hàm lượng khoáng của xương được xác định bằng máy đo hấp thụ tia X năng lượng kép (DEXA; XR -26; Norland, Fort Atkinson, Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng chế độ cho các đối tượng nhỏ như đã mô tả trước đây. [18, 23] Tất cả các quy trình đều tuân thủ các hướng dẫn của thể chế và đã được Ủy ban Chăm sóc Động vật của Đại học Y Trung Quốc phê duyệt.
Phân tích thống kê
Phân tích thống kê được thực hiện bằng Prism 4. 0 1 phần mềm. (GraphPad Software Inc., San Diego, Hoa Kỳ). Các giá trị đã cho là trung bình ± SEM. Phân tích thống kê giữa hai mẫu được thực hiện bằng phép thử t của Student. So sánh thống kê của hơn hai nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều với kiểm định posthoc của Bonfer-Roni. Trong tất cả các trường hợp, P <0,05 được="" coi="" là="" có="" ý="">
Chiết xuất Cistanche Desticola
Kết quả
Chiết xuất Cistanche Desticola làm tăng quá trình khoáng hóa xương bởi các nguyên bào xương
Việc bổ sung chiết xuất CD trong 24 hoặc 48 giờ không ảnh hưởng đến sự gia tăng của tế bào E1 của nguyên bào xương chuột MC3T 3- trong một thử nghiệm MTT (dữ liệu không được hiển thị). Bởi vì sự biệt hóa nguyên bào xương là một quá trình phức tạp liên quan đến sự tăng sinh và di chuyển của tế bào, chúng tôi cũng đã kiểm tra khả năng di cư của các tế bào MC3T 3- E1 sau khi điều trị bằng chiết xuất CD. Sử dụng Transwell và các xét nghiệm chữa lành vết thương, chúng tôi nhận thấy rằng trích xuất CD không ảnh hưởng đến sự di chuyển của nguyên bào xương (dữ liệu không được hiển thị). Sự hình thành các nốt khoáng hóa là một trong những dấu hiệu của sự trưởng thành nguyên bào xương. Nhuộm Alizarin red S cho thấy các nốt khoáng hóa hình thành khi các nguyên bào xương được nuôi cấy trong hai tuần trong môi trường có chứa vitamin C (50 mg / ml) và b-glycerophosphat (10 mm), và điều này được tăng lên theo cách phụ thuộc vào nồng độ khi bổ sung của CD (Hình 1a). Do đó, chiết xuất CD gây ra sự hình thành nốt xương bởi các nguyên bào xương được nuôi cấy, nhưng không gây ra sự tăng sinh hoặc di cư của chúng. Chúng tôi cũng đã kiểm tra vai trò của chiết xuất CD trong quá trình tạo xương do RANKL gây ra nhưng không có tác dụng (dữ liệu không được hiển thị).
Chiết xuất Cistanche Desticola làm tăng phosphatase kiềm, protein hình thái xương -2 và biểu hiện osteopontin trong nguyên bào xương nuôi cấy
Các nguyên bào xương biệt hóa thể hiện hoạt động ALP tăng cao, tương quan với mức độ biểu hiện enzym cao. [18] Chúng tôi nhận thấy rằng điều trị bằng chiết xuất CD trong 72 giờ làm tăng đáng kể hoạt động ALP của nguyên bào xương (Hình 1b). Với vai trò quan trọng của BMP -2, ALP và OPN trong sự biệt hóa nguyên bào xương, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu chiết xuất CD có tác dụng lên quá trình biệt hóa nguyên bào xương bằng cách điều chỉnh biểu hiện BMP -2, ALP và OPN hay không. Xử lý tế bào bằng chiết xuất CD làm tăng biểu hiện mRNA của ALP, BMP -2 và OPN theo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 1c), chứng tỏ rằng chiết xuất CD gây ra sự khác biệt của nguyên bào xương bằng cách điều chỉnh ALP, BMP -2 và biểu thức OPN.
Chiết xuất Cistanche Desticola làm tăng sự hình thành nốt xương thông qua con đường protein kinase được kích hoạt bởi mitogen
Người ta đã báo cáo rằng MAPK đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành xương [24,25] vì vậy chúng tôi tiếp theo kiểm tra xem liệu con đường tín hiệu này có liên quan đến quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD gây ra hay không. Tiền xử lý tế bào bằng chất ức chế ERK U0126, chất ức chế p38 SB203580, hoặc chất ức chế JNK SP600125 làm giảm quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD (Hình 2a, 3a và 4a). Hơn nữa, các chất ức chế cũng ngăn chặn biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN do trích xuất CD gây ra (Hình 2b – 4c). Việc chuyển các tế bào có đột biến ERK2, p38 hoặc JNK làm giảm sự tăng trích xuất CD trong biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN mRNA (Hình 2c, 3c và 4c). Tiếp theo, chúng tôi trực tiếp kiểm tra kích hoạt ERK, p38 và JNK sau khi xử lý trích xuất CD. Ủ tế bào với chiết xuất CD gây ra sự phosphoryl hóa ERK, p38 và JNK (Hình 2d, 3d và 4d). Do đó, ERK, p38 và JNK làm trung gian cho sự gia tăng hình thành xương do điều trị CD của nguyên bào xương.
Chiết xuất Cistanche Desticola làm tăng sự hình thành nốt xương thông qua con đường yếu tố hạt nhân-kB
Như đã đề cập trước đó, kích hoạt NF-kB là cần thiết cho sự hình thành xương. [26,27] Tiếp theo, chúng tôi điều trị nguyên bào xương bằng các chất ức chế NF-kB pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) và N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) được mua từ Calbiochem (Darmstadt, Đức) để xác định xem hoạt hóa NF-kB có liên quan đến quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD gây ra hay không. Hình 5a cho thấy việc xử lý trước nguyên bào xương bằng PDTC hoặc TPCK đã ức chế sự hình thành nốt xương do chiết xuất CD và cũng làm giảm sự gia tăng biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN (Hình 5b và 5c). Sự phosphoryl hóa của tiểu đơn vị NF-kB p65 là một chỉ số của sự hoạt hóa NF-kB; [28] phù hợp với điều này, chúng tôi nhận thấy rằng chiết xuất CD làm tăng sự phosphoryl hóa p65 trong nguyên bào xương (Hình 5d). Những kết quả này chỉ ra rằng sự kích hoạt NF-kB là quan trọng đối với sự biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN do chiết xuất CD gây ra và sự hình thành nốt xương.
Ức chế quá trình mất xương bằng chiết xuất Cistanche Desticola ở chuột được cắt buồng trứng
Để kiểm tra tác động của chiết xuất CD đối với sự mất xương, người ta đã gây ra chứng loãng xương ở chuột cái bằng phương pháp cắt bỏ buồng trứng. Đúng như dự đoán, những con chuột được cắt buồng trứng cho thấy mật độ khoáng trong xương và hàm lượng khoáng trong xương toàn bộ cơ thể giảm (Hình 6a và 6b). Điều trị bằng chiết xuất CD trong bốn tuần đã ức chế sự mất mật độ chất khoáng của xương và hàm lượng chất khoáng của xương theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 6a và 6b). Nồng độ ALP trong máu có thể phản ánh hoạt động của nguyên bào xương. [29] Như thể hiện trong Hình 6c, chiết xuất CD ức chế sự giảm hoạt động ALP huyết thanh do cắt bỏ buồng trứng. Ngoài ra, chiết xuất CD cũng làm tăng mức độ osteocalcin, một chất đánh dấu quá trình hình thành xương, và giảm mức độ telopeptides đầu C của collagen loại I, một dấu hiệu của quá trình tiêu xương (Hình 6d và 6e). Do đó, những phát hiện này hỗ trợ hiệu lực và hiệu quả của chiết xuất CD trong việc ngăn ngừa mất xương in vivo.
Thảo luận
Cistanche DesticolaMa, một loại thảo mộc bản địa ở Trung Quốc, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền cho các phương pháp điều trị khác nhau do hoạt tính an thần, giảm đau và kích thích miễn dịch của nó. [11–15] Ở đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng chiết xuất CD gây ra sự khoáng hóa xương trong các nguyên bào xương được nuôi cấy, nhưng đã không ảnh hưởng đến sự di chuyển hoặc tăng sinh tế bào của chúng. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng ALP, BMP -2 và OPN là các protein đích của tín hiệu do trích xuất CD, đòi hỏi sự kích hoạt ERK, p38, JNK và NF-kB.
Xương là một mô phức tạp bao gồm một số loại tế bào liên tục trải qua quá trình đổi mới và sửa chữa. [30] Khi quá trình tiêu hóa và hình thành xương bị mất cân bằng, quá trình phân hủy xương sẽ đè lên quá trình hình thành xương và dẫn đến loãng xương. [30] Chúng tôi sử dụng chuột đã được cắt buồng trứng để kiểm tra tác dụng chống loãng xương của chiết xuất CD. Những con chuột được cắt buồng trứng đã giảm mật độ khoáng xương toàn cơ thể và hàm lượng khoáng chất trong xương, điều này được giảm bớt bằng cách điều trị bằng chiết xuất CD. Chiết xuất CD cũng làm tăng nồng độ huyết thanh của chất đánh dấu tạo xương ALP và osteocalcin. Do đó, CD là một chất tạo xương ngăn ngừa sự mất xương do phẫu thuật cắt buồng trứng in vivo.
Mặc dù các cơ chế của bệnh loãng xương không hoàn toàn rõ ràng, chúng có thể liên quan đến việc giảm khả năng sẵn có hoặc giảm tác động của các yếu tố tăng trưởng xương, chẳng hạn như ALP, BMP -2 và OPN. Ba yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và tái tạo xương, [31] và đã được ghi nhận rõ ràng rằng sự kích thích biệt hóa tế bào nguyên bào xương được đặc trưng chủ yếu bởi sự gia tăng biểu hiện của ALP, BMP -2 và OPN. [32 ] Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng chiết xuất CD làm tăng biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN và tăng cường quá trình khoáng hóa xương. Do đó, chiết xuất CD làm trung gian cho quá trình hình thành xương một phần bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của ALP, BMP -2 và OPN.
Người ta đã báo cáo rằng p38 tham gia vào việc điều hòa biểu hiện ALP trong quá trình biệt hóa của các tế bào tạo xương; [33] tương tự, ERK1 / 2 rất quan trọng đối với sự tăng sinh và biệt hóa của nguyên bào xương. [34,35] JNK tham gia vào quá trình hình thành tế bào hủy xương. . [36] Chúng tôi đã chỉ ra ở đây rằng chiết xuất CD gây ra quá trình phosphoryl hóa ERK, p38 và JNK, và các chất ức chế các enzym này đối kháng với khả năng khoáng hóa xương qua trung gian chiết xuất CD, cho thấy rằng sự hoạt hóa ERK, p38 và JNK đóng một vai trò bắt buộc trong quá trình hình thành xương do chiết xuất CD bằng cách Tế bào tạo xương. Ngoài ra, các chất ức chế enzym và các đột biến âm tính trội của ERK, p38 và JNK làm giảm biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN tăng cường chiết xuất CD. Những dữ liệu này cho thấy rằng cần phải kích hoạt các con đường ERK, p38 và JNK để tăng biểu hiện và trưởng thành ALP, BMP -2 và OPN do trích xuất CD trong nguyên bào xương. ERK đã được báo cáo là làm tăng sự tăng sinh và biệt hóa nguyên bào xương. [34,35] Tuy nhiên, chúng tôi không phát hiện thấy ảnh hưởng của chiết xuất CD đối với sự tăng sinh nguyên bào xương. Do đó, các con đường khác có thể đã chống lại hiệu ứng ERK sau khi kích thích chiết xuất CD, hoặc cần thiết cho sự tăng sinh. Về vấn đề này, chúng tôi nhận thấy rằng các chất ức chế PI3K và Akt cũng làm giảm quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD và biểu hiện mRNA ALP, BMP -2 hoặc OPN (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, những con đường này có thể được yêu cầu cho quá trình hình thành xương do chiết xuất CD.
NF-kB đã được chứng minh là có khả năng kiểm soát chức năng nguyên bào xương trong xương. [37] Kết quả của nghiên cứu này cho thấy kích hoạt NF-kB góp phần vào quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD và biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN trong nguyên bào xương được nuôi cấy và các chất ức chế con đường tín hiệu phụ thuộc NF-kB (PDTC và TPCK ) ức chế quá trình khoáng hóa xương do chiết xuất CD gây ra và biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN. p65 được phosphoryl hóa tại Ser536 bởi nhiều loại kinase trong một số con đường tín hiệu, giúp tăng cường tiềm năng chuyển hóa p65. [38] Kết quả của nghiên cứu này cho thấy chiết xuất CD làm tăng quá trình phosphoryl hóa p65. Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy rằng cần phải kích hoạt NF-kB để tạo xương do chiết xuất CD trong nguyên bào xương nuôi cấy. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng các chất ức chế ERK, p38 và JNK đã đảo ngược hoạt tính NF-kB luciferase do chiết xuất CD gây ra (dữ liệu không được hiển thị), phù hợp với các enzym này là chất trung gian ngược dòng của sự hoạt hóa NF-kB do chiết xuất CD gây ra. Do đó, chiết xuất CD gây ra sự hình thành xương thông qua các con đường ERK / p38 / JNK / và NF-kB.
Kết luận
Nghiên cứu này đã chứng minh rằng chiết xuất CD gây ra sự biệt hóa và trưởng thành nguyên bào xương nhưng không tăng sinh hoặc di cư. Chiết xuất CD cũng làm tăng biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN và khoáng hóa xương. Chúng tôi đã chỉ ra rằng các con đường ERK, p38, JNK và NF-kB tham gia vào quá trình hình thành xương qua trung gian chiết xuất CD và biểu hiện ALP, BMP -2 và OPN. Hơn nữa, chiết xuất CD ngăn ngừa mất xương in-vivo do cắt bỏ buồng trứng. Do đó, CD có thể có lợi trong việc kích thích tạo xương trong điều trị các bệnh loãng xương.
