Clec12a Giảm viêm trong khi hạn chế sự mở rộng của vi khuẩn Colitogen

BẢN TÓM TẮT

Việc điều chỉnh hệ vi sinh vật rất quan trọng đối với sức khỏe đường ruột nhưng các cơ chế được sử dụng bởi khả năng miễn dịch bẩm sinh vẫn chưa rõ ràng. Ở đây chúng tôi chỉ ra rằng những con chuột thiếu thụ thể C-Type-lectin, Clec12a đã phát triển bệnh viêm đại tràng nặng, tình trạng này phụ thuộc vào hệ vi sinh vật. Các nghiên cứu về cấy ghép vi sinh vật trong phân (FMT) trên chuột không có mầm bệnh cho thấy hệ vi khuẩn colitogen hình thành bên trong chuột Clec12a-/- được đánh dấu bằng sự phát triển của sinh vật gram dương, loài gặm nhấm Faecalibaculum. Điều trị bằng F. Rodentium đủ để làm trầm trọng thêm tình trạng viêm đại tràng ở chuột hoang dã. Các đại thực bào trong ruột thể hiện mức độ Clec12a cao nhất. Phân tích Cytokine và giải trình tự trong đại thực bào Clec12a-/- cho thấy tình trạng viêm tăng cao nhưng lại giảm rõ rệt các gen liên quan đến quá trình thực bào. Thật vậy, các đại thực bào Clec12a-/- bị suy giảm khả năng hấp thu F. Rodentium. Clec12a tinh khiết có khả năng liên kết cao hơn với các sinh vật gram dương như F. Rodentium. Do đó, dữ liệu của chúng tôi xác định Clec12a là một cơ chế giám sát miễn dịch bẩm sinh để kiểm soát sự mở rộng của các phần thưởng có khả năng gây hại mà không bị viêm quá mức.

lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch

GIỚI THIỆU

Thành phần và chức năng của hệ vi sinh vật có thể có tác động sâu sắc đến sức khỏe và bệnh tật của động vật có vú (Fassarella và cộng sự, 2021). Điều này đã được ghi nhận rõ ràng đối với bệnh viêm ruột (IBD), trong đó hầu hết các mô hình chuột mắc IBD đều nhạy cảm với những thay đổi trong thành phần hệ vi sinh vật (Gkouskou và cộng sự, 2014). Hiểu được các yếu tố ảnh hưởng và hướng dẫn sự ổn định của hệ vi sinh vật sẽ rất quan trọng khi các liệu pháp dựa trên hệ vi sinh vật được phát triển (Sharma và cộng sự, 2020; Sorbara và Pamer, 2022). Hệ vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số bao gồm chế độ ăn uống, thuốc men và hệ thống miễn dịch. Trong những năm gần đây, các thành phần miễn dịch thích ứng, đặc biệt là IgA, đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến thành phần hệ vi sinh vật (Nakajima và cộng sự, 2018; Okai và cộng sự, 2016; Yang và Palm, 2020). Tuy nhiên, người ta biết ít hơn về mức độ ảnh hưởng của các thụ thể miễn dịch bẩm sinh cụ thể đến thành phần hệ vi sinh vật cân bằng nội môi.

Các đa hình di truyền trong các gen quy định khả năng nhận biết vi khuẩn và khả năng miễn dịch niêm mạc là các alen có nguy cơ đáng kể đối với IBD, bao gồm protein tự thực ATG16L1 (Cadwell và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2015; Rioux và cộng sự, 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). Trong một nghiên cứu gần đây khám phá sự thay đổi biểu hiện gen dòng tủy ở những cá thể có đa hình ATG16L1T300A, thụ thể lectin loại C (CLR), Clec12a, được xác định là bị ức chế đáng kể trong các tế bào này (Begun và cộng sự, 2015). Nghiên cứu tương tự này đã chứng minh rằng Clec12a có chức năng bảo vệ sự lây nhiễm mầm bệnh thông qua sự liên kết với con đường tự thực. Những dữ liệu này cho thấy rằng sự điều hòa giảm Clec12a ở những người mắc IBD có thể ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng và/hoặc sự phát triển của bệnh. Bất chấp bằng chứng này, người ta biết rất ít về cơ chế điều hòa miễn dịch do Clec12a gây ra trong bệnh viêm đại tràng.

Lectin loại C là một nhóm đa dạng gồm các phân tử hòa tan hoặc gắn màng có khả năng liên kết cả lipid, protein và carbohydrate có nguồn gốc từ vật chủ hoặc vi sinh vật (Brown và cộng sự, 2018). Mincle (Clec4e) và Dectin-1 (Clec7a) là hai CLR ảnh hưởng đến các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật để duy trì cân bằng nội môi đường ruột (Iliev và cộng sự, 2012; Martinez-Lopez và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, với hơn 1{12}} lectin loại C khác nhau, vẫn còn nhiều điều cần khám phá trong họ protein này. Clec12a thuộc họ thụ thể sát thủ tự nhiên và là một trong hai loại thảo dược loại C duy nhất có chứa mô típ ức chế miễn dịch-tyrosine (ITIM) có khả năng hạn chế các con đường truyền tín hiệu viêm (Brown và cộng sự, 2018; Marshall và cộng sự, 2004) . Clec12a nhận biết axit uric là tín hiệu của tổn thương tế bào (Neumann và cộng sự, 2014). Clec12a được biểu hiện cao nhất ở các tế bào miễn dịch bẩm sinh và trong bạch cầu trung tính, nó có tác dụng làm giảm sự kích hoạt và điều hòa quá trình sản xuất cytokine gây viêm khi nhận biết axit uric (Neumann và cộng sự, 2014). Ngược lại, Clec12a thúc đẩy quá trình viêm bằng cách cho phép các thực bào đơn nhân (MNP) di chuyển qua hàng rào máu não trong mô hình tự miễn dịch của bệnh đa xơ cứng và tăng cường tín hiệu interferon loại I để đáp ứng với nhiễm virus (Li và cộng sự, 2019; Sagar và cộng sự ., 2017). Clec12a cũng có khả năng nhận ra sản phẩm plasmodial, hemozoin, đã được chứng minh là làm tăng tế bào T CD8+ trong não sau khi nhiễm Plasmodium (Raulf và cộng sự, 2019). Do đó, Clec12a đại diện cho một CLR lăng nhăng với nhiều vai trò khác nhau trong khả năng miễn dịch và khả năng truyền tín hiệu độc đáo, tuy nhiên vai trò của nó trong ruột vẫn chưa được biết rõ.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng các loại nấm đường ruột cụ thể làm trầm trọng thêm bệnh viêm đại tràng bằng cách tạo ra chất chuyển hóa purine, axit uric (Chiaro và cộng sự, 2017). Hơn nữa, quá trình chuyển hóa purine gần đây có liên quan đến bệnh đường ruột ở người (Zhu và cộng sự, 2019). Những dữ liệu này gợi ý chung rằng việc phát hiện axit uric có thể liên quan đến IBD. Dựa trên điều này, chúng tôi bắt đầu khám phá chức năng của Clec12a trong ruột. Chúng tôi phát hiện ra rằng động vật thiếu Clec12a rất dễ bị viêm đại tràng, điều này phụ thuộc vào thành phần hệ vi sinh vật được hình thành khi không có Clec12a. FMT của Clec12a-/- microbiota ở động vật không có mầm bệnh WT là đủ để làm trầm trọng thêm bệnh viêm đại tràng và sự hình thành microbiota colitogen ở động vật Clec12a-/- không phụ thuộc vào khả năng miễn dịch thích nghi. Để xác định các vi khuẩn có liên quan có thể làm trầm trọng thêm tình trạng viêm đại tràng, động vật Clec12a-/- đã được điều trị bằng nhiều loại kháng sinh khác nhau và những loại vi khuẩn nhắm vào vi khuẩn gram dương sẽ cải thiện tình trạng bệnh. Trình tự 16S rDNA đã xác định Faecalibaculum Rodentium có nhiều hơn đáng kể ở động vật Clec12a-/- và việc cho F. Rodentium vào miệng là đủ để làm trầm trọng thêm bệnh lý ở động vật WT. Hồ sơ miễn dịch của động vật Clec12a-/- cho thấy sự giảm rõ rệt các tế bào tủy cân bằng nội môi ở ruột kết. Trình tự RNA của các đại thực bào được xử lý bằng F. Rodentium cho thấy rằng Clec12a thúc đẩy quá trình thực bào. Vì Clec12a đã được chứng minh là có khả năng liên kết nhiều phối tử, nên chúng tôi đã hỏi liệu Clec12a có liên kết với các thành viên khác nhau của hệ vi sinh vật hay không. Bằng cách sử dụng protein tổng hợp Clec12a-Fc, chúng tôi xác định rằng Clec12a liên kết mạnh nhất với các thành viên gram dương của hệ vi sinh vật. Tổng hợp các dữ liệu này gợi ý một mô hình trong đó Clec12a kiểm soát các thành phần gây colitogen của hệ vi sinh vật thông qua liên kết trực tiếp và thực bào đồng thời ngăn ngừa phản ứng viêm. Trong các tình huống mà biểu hiện Clec12a bị giảm, các mầm bệnh gram dương có thể lan rộng và thúc đẩy tình trạng viêm. Do đó, các nghiên cứu của chúng tôi xác định Clec12a là chất ức chế viêm quan trọng để đảm bảo cân bằng nội môi và duy trì hệ vi sinh vật khỏe mạnh.

KẾT QUẢ

Động vật Clec12a-/- rất dễ bị viêm đại tràng mà không phụ thuộc vào hệ thống miễn dịch thích nghi

Giảm biểu hiện Clec12a đã được báo cáo ở những người mắc IBD và chúng tôi đã chứng minh rằng việc ngăn chặn việc sản xuất một trong các phối tử của Clec12a, axit uric, có thể cải thiện tình trạng viêm đại tràng (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Tuy nhiên, Clec12a vẫn chưa được nghiên cứu trên mô hình động vật bị viêm đại tràng. Vì mục đích này, chuột WT và Clec12a-/- C57BL/6 đã được thử thách với bệnh viêm đại tràng DSS cấp tính. Động vật Clec12a-/- giảm cân nhiều hơn đáng kể, biểu hiện dấu hai chấm ngắn hơn và có sự gia tăng đáng kể dấu hiệu viêm LCN2 trong phân khi so sánh với động vật WT, cho thấy tình trạng viêm và bệnh trở nên trầm trọng hơn (Hình 1A-C). Hỗ trợ điều này, phân tích mô học cho thấy tổn thương biểu mô gia tăng, mất mật mã và dòng tế bào miễn dịch tràn vào ở động vật Clec12a-/- so với WT (Hình 1D, E). Phù hợp với các kết quả trong mô hình viêm đại tràng DSS, việc chuyển tế bào CD{21}} CD45RBHi vào TCRb-/-; Chuột bị loại kép Clec12a-/- dẫn đến tăng cân ít hơn theo thời gian và dấu hai chấm ngắn hơn khi so sánh với các tế bào T được chuyển vào chuột TCRb-/- (Hình 1F, G). Nói chung, những kết quả này chứng minh rằng mất Clec12a dẫn đến bệnh đường ruột trở nên tồi tệ hơn.

Clec12a được báo cáo là biểu hiện phần lớn trong các tế bào miễn dịch bẩm sinh với biểu hiện rất thấp được báo cáo trong tế bào T CD8+. Do đó, để xác định xem khả năng miễn dịch thích nghi có liên quan đến căn bệnh trở nên tồi tệ hơn ở động vật Clec12a-/- hay không, động vật Clec12a-/- đã được lai với động vật Rag-/- để loại bỏ cả tế bào T và B. Một lần nữa, động vật Clec12a-/- phát triển bệnh nặng hơn khi so sánh với động vật WT vì chúng giảm cân nhiều hơn và có dấu hai chấm ngắn hơn so với đối chứng WT (Hình 1H, I). Tương tự, Clec12a-/-; Rag-/- phát triển bệnh đường ruột trở nên tồi tệ hơn khi so sánh với Rag-/- đối chứng và giảm cân nhiều và có dấu hai chấm ngắn hơn WT và Rag-/- như Clec12a-/- (Hình 1H, I). Trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng điều trị bằng đường uống bằng S. cerevisiae sẽ làm tăng nồng độ axit uric làm viêm đại tràng trở nên trầm trọng hơn. Tuy nhiên, không thấy sự khác biệt về nồng độ axit uric trong huyết thanh hoặc phân ở động vật WT so với Clec12a-/-, cho thấy rằng bệnh tăng cường quan sát thấy ở Clec12A-/- không phải là kết quả của việc tăng axit uric (Hình S1). Do đó, sự phát triển viêm đại tràng trầm trọng hơn được quan sát thấy ở động vật Clec12a-/- không phụ thuộc vào hệ thống miễn dịch thích nghi.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Viêm đại tràng nặng hơn ở động vật Clec12a-/- phụ thuộc vào hệ vi sinh vật

Viêm đại tràng được cho là nguyên nhân một phần là do sự thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật (Kubinak và cộng sự, 2015; Ray và Dittel, 2015). Để xác định xem động vật Clec12a-/- có chứa vi khuẩn làm thúc đẩy tình trạng viêm đại tràng nặng hơn hay không, FMT đã được thực hiện từ chuột WT hoặc Clec12a-/- thành động vật WT không có mầm bệnh. Bốn tuần sau khi cấy ghép, một nửa số động vật được nuôi chung, trong khi nửa còn lại được nuôi riêng. Viêm đại tràng DSS cấp tính sau đó được gây ra ở mỗi nhóm (Hình 2A). Những động vật nhận được Clec12a-/- FMT và những động vật ở cùng nhà giảm cân nhiều hơn đáng kể (Hình 2B) và có dấu hai chấm ngắn hơn đáng kể (Hình 2C) so với những động vật nhận được FMT từ chuột WT. Hơn nữa, phân tích mô học cho thấy tổn thương biểu mô lớn hơn và tình trạng viêm lan tràn sau khi cấy ghép bằng vi khuẩn Clec12a-/- (Hình 2D, E). Các cộng đồng vi sinh vật được thiết lập khác biệt giữa các nhóm được xác định bằng giải trình tự gen 16S rRNA bằng cách sử dụng Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), không trọng số (PERMANOVA, p=0.0062) và có trọng số- Khoảng cách Unifrac (PERMANOVA, p=0.0001). Sự khác biệt về hệ vi sinh vật trong nhóm là lớn nhất ở các động vật sống chung theo cùng một số liệu cho thấy việc thu nhận vi khuẩn từ mỗi kiểu gen FMT (Hình 2 FH). Những dữ liệu này chỉ ra rằng bệnh viêm đại tràng trầm trọng hơn ở động vật Clec12a-/- là do các vi khuẩn cụ thể được làm giàu khi không có Clec12a; và những vi khuẩn này đã trở thành yếu tố chi phối tạo ra kiểu hình colitogen, ngay cả khi có sự hiện diện của hệ vi sinh vật WT đã được thiết lập.

Thành phần microbiota được hình thành ở động vật Clec12a-/- không phụ thuộc vào khả năng miễn dịch thích nghi

Hệ thống miễn dịch rất quan trọng trong việc quyết định thành phần của hệ vi sinh vật. Thí nghiệm FMT chỉ ra rằng Clec12a-/- dẫn đến sự thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật, thúc đẩy sự phát triển bệnh viêm đại tràng trở nên trầm trọng hơn. Trước tiên, chúng tôi muốn xác định xem liệu sự thiếu hụt Clec12a-/- trong khoang miễn dịch có khả năng định hình lại hệ vi sinh vật đường ruột hay không. Vì mục đích này, tủy xương từ chuột WT hoặc Clec12a-/- được chuyển vào chuột nhận WT SPF đã được chiếu xạ gây chết người để chuẩn hóa hệ vi sinh vật, sau đó là giai đoạn phục hồi miễn dịch trong 8-tuần (Hình 3A). Trong thời gian này, hệ thống miễn dịch được cấy ghép có thời gian phát triển bên trong người nhận, hình thành nên thành phần của hệ vi sinh vật một cách khác biệt. Để xác định xem liệu những thay đổi về procolitogen đối với microbiota có phải do việc điêu khắc miễn dịch này hay không, chúng tôi đã thực hiện FMT bằng cách sử dụng phân của chuột WT hoặc Clec12a-/- tinh tinh và gây ra viêm đại tràng DSS (Hình 3A). Mặc dù không có thay đổi đáng kể nào trong việc giảm cân (Hình 3B), nhưng dấu hai chấm của động vật nhận FMT từ chuột tinh tinh Clec12a-/- ngắn hơn đáng kể khi so sánh với động vật nhận FMT từ chuột WT (Hình 3C), cho thấy bệnh trở nên trầm trọng hơn. Hơn nữa, khi những người nhận WT và Clec12a-/- FMT ở cùng một nơi, các dấu hai chấm ngắn hơn đáng kể khi so sánh với những động vật nhận WT FMT (Hình 3C). Do đó, sự thiếu hụt Clec12a-/- trong khoang tạo máu dẫn đến sự hình thành hệ vi khuẩn colitogen chiếm ưu thế.

Để hỗ trợ thêm rằng hệ thống miễn dịch thích ứng có thể được phân phối cho sự hình thành hệ vi sinh vật colitogen ở động vật Clec12a-/-, chúng tôi đã thực hiện FMT bằng cách sử dụng phân từ Rag-/- hoặc Rag- /-; Clec12a-/- - như được mô tả trước đây. Những con vật nhận được Rag-/-; Clec12a-/- FMT giảm cân nhiều hơn và có dấu hai chấm ngắn hơn đáng kể so với những động vật đã nhận FMT từ động vật Rag-/-, hơn nữa, những động vật nuôi chung cũng phát triển bệnh nặng hơn (Hình 3D, E). Những dữ liệu này chứng minh rằng sự thiếu hụt Clec12a trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh đủ để dẫn đến sự hình thành một hệ vi sinh vật có khả năng làm nặng thêm tình trạng viêm đại tràng.

Clec12a ngăn chặn sự mở rộng của Faecalibaculum Rodentium

Chúng tôi đã sử dụng một loạt các loại kháng sinh khác nhau để xác định các sinh vật có liên quan gây bệnh ở động vật Clec12a-/-. Đầu tiên, điều trị bằng hỗn hợp kháng sinh phổ rộng mạnh bao gồm erythromycin, ampicillin, neomycin và gentamycin, làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh ở cả động vật Clec12a-/- và WT, cho thấy rằng quần thể vi khuẩn của microbiota có liên quan đến bệnh ( Hình 4A; Hình S2). Tiếp theo, chúng tôi tiếp tục thu hẹp những quần thể vi khuẩn nào có liên quan nhất đến bệnh tật bằng cách sử dụng các loại kháng sinh khác nhau nhắm vào các loài vi khuẩn riêng biệt. Cụ thể, chúng tôi đã chọn gentamycin, một loại aminoglycoside nhắm vào vi khuẩn gram âm và cephalothin, một cephalosporin chủ yếu nhắm vào vi khuẩn gram dương. Những loại thuốc này được dùng cho động vật Clec12a-/- trong bệnh viêm đại tràng DSS. Mặc dù điều trị bằng gentamycin không tạo ra sự khác biệt về mức độ nghiêm trọng của bệnh, nhưng động vật nhận cephalothin vẫn duy trì trọng lượng và có đại tràng dài hơn đáng kể so với động vật được điều trị giả (Hình 4B, C), cho thấy rằng các sinh vật gram dương cư trú trong Clec12a-/- microbiota đóng vai trò vai trò quan trọng trong việc làm trầm trọng thêm bệnh lý.

Tiếp theo, chúng tôi thực hiện giải trình tự gen 16S rRNA của phân SPF WT và Clec12a-/- để xác định những thay đổi về thành phần trong hệ vi sinh vật. Các động vật WT và Clec12a-/- phân cụm khác nhau đáng kể theo cả các số liệu có trọng số phong phú không phát sinh gen và phát sinh gen, tương ứng là Bray-Curtis và UniFrac có trọng số (Hình S3A-C). Các số liệu đa dạng Alpha cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về mức độ phong phú (các đặc điểm được quan sát), cho thấy Clec12a-/- không chứa nhiều loài hơn (Hình 4D). Tuy nhiên, các chỉ số về độ đồng đều và đa dạng của Shannon đã tăng lên khi không có Clec12a cho thấy rằng sự phân bố tỷ lệ của vi khuẩn ở chuột Clec12a-/- đã bị thay đổi (Hình 4E, F) và hỗ trợ thêm rằng Clec12a rất quan trọng trong việc điều chỉnh cấu trúc hệ vi sinh vật trong ruột.

Phân tích thành phần của hệ vi sinh vật (ANCOM) cho thấy, trong số các ASV (biến thể trình tự khuếch đại) rất phong phú, một ASV được phân loại trong chi Faecalibaculum (họ Erysipelotrichaceae), đã được mở rộng đáng kể trong phân Clec12a-/- so với WT (Hình 4G, H). BLAST sử dụng trình tự đại diện ASV từ phân tích của chúng tôi cho thấy sự đồng nhất 100% với trình tự từ vi khuẩn Faecalibaculum Rodentium. Những dữ liệu này cung cấp bằng chứng cho thấy vi khuẩn gram dương ở động vật Clec12a-/- chịu trách nhiệm tạo ra kiểu hình colitogen và đặc biệt liên quan đến sinh vật gram dương, F. Rodentium, khiến bệnh trở nên trầm trọng hơn.

Dựa trên điều này, chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết rằng F. Rodentium có thể làm trầm trọng thêm bệnh viêm đại tràng. Chúng tôi đã xử lý trước các động vật WT SPF bằng 1 x 108 CFU của F. Rodentium sống hoặc cố định bằng cách cho uống qua đường miệng và tiếp tục điều trị hàng ngày trong mô hình DSS cấp tính để đảm bảo mức độ xâm chiếm F. Rodentium cao. Những con vật được tiếp nhận cả F. Rodentium sống và cố định sẽ giảm cân nhiều hơn và có đại tràng ngắn hơn đáng kể so với những con được điều trị bằng phương tiện (Hình 4I, J), cho thấy rằng mức độ F. Rodentium tăng lên có thể làm bệnh nặng hơn.

Clec12a hạn chế phản ứng viêm của đại thực bào đồng thời tăng cường quá trình thực bào

Để xác định biểu hiện tế bào Clec12a trong trường hợp không mắc bệnh, chúng tôi đã mô tả các tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích nghi trong propria lamina (LP) bằng phương pháp tế bào học dòng chảy nhiều màu. Phù hợp với các báo cáo trước đây, Clec12a chủ yếu bị giới hạn ở dòng tủy và có rất ít hoặc không biểu hiện trên tế bào lympho (Hình 5A) (Han và cộng sự, 2004; Pyz và cộng sự, 2008; Sobanov và cộng sự, 2001). Bạch cầu trung tính, đại thực bào và tế bào đuôi gai trong ruột hiển thị mức độ biểu hiện Clec12a tương tự (Hình S4A), trong khi đại thực bào có tỷ lệ tế bào lớn nhất trong mô ruột biểu hiện Clec12a (Hình 5A). Với vai trò kép của đại thực bào trong việc thúc đẩy quá trình viêm thông qua kích hoạt cổ điển nhưng cũng để bắt đầu các cơ chế phục hồi để đáp ứng với tổn thương mô, chúng tôi đã hỏi làm thế nào Clec12a có thể ảnh hưởng đến sự phân đôi này trong viêm đại tràng. Mặc dù các đại thực bào khá đa dạng, nhưng chúng có thể được chia thành các đại thực bào viêm M1 và đại thực bào phục hồi M2 bằng cách biểu hiện lần lượt CD38 và EGR2. Chúng tôi cho thấy động vật Clec12a-/- đã tăng đại thực bào M1 và giảm đại thực bào M2 trong LP đại tràng trong bệnh viêm đại tràng (Hình 5 B, C, Hình S4B). Những dữ liệu này chỉ ra rằng Clec12a điều chỉnh phản ứng của đại thực bào trong ruột.

Để hiểu rõ hơn về cách Clec12a ảnh hưởng đến sinh học đại thực bào trong phản ứng với các phối tử vi khuẩn, các đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương (BMDM) được phân lập từ WT hoặc Clec12a-/- động vật đã được xử lý bằng nhiều loại phối tử vi khuẩn phổ biến bao gồm LPS, Pam3CysK và Flagellin. Phân tích Cytokine đã được thực hiện trên tất cả các mẫu này. Nhiều cytokine được thử nghiệm không được tạo ra trong các điều kiện này, tuy nhiên, MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a và IL-6 được phát hiện nhất quán trong các môi trường nuôi cấy này ( Hình 5D). Clec12a-/- BMDM có biểu hiện cao hơn đáng kể của các cytokine này khi phản ứng với nhiều phối tử vi sinh vật và phản ứng khác biệt lớn nhất đã được thấy khi phản ứng với chất chủ vận TLR2 Pam3CysK. Dữ liệu này phù hợp với vai trò đã biết của Clec12a trong việc làm dịu các phản ứng viêm trong quá trình viêm vô trùng (Neumann và cộng sự, 2014).

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

RNA-seq đã được thực hiện trên BMDM từ WT hoặc Clec12a-/- được xử lý bằng F. Rodentium để xác định cách Clec12a điều chỉnh phản ứng của các tế bào này với sinh vật vi khuẩn cụ thể này. Chúng tôi đã đánh giá phản ứng khác biệt bằng cách so sánh các BMDM Clec12a-/- tiếp xúc với F. Rodentium qua các phương tiện điều khiển phương tiện với BMDM WT. Phân tích mức độ phong phú của các gen biểu hiện khác nhau cho thấy các đại thực bào thiếu Clec12a có sự gia tăng đáng kể các gen liên quan đến kiểm soát chu kỳ tế bào khi bị thử thách với F. Rodentium (Hình S5A). Chu kỳ tế bào về bản chất có liên quan đến quá trình thực bào và cũng có sự giảm đáng kể về các gen liên quan đến quá trình thực bào và phản ứng viêm (Hình 5E) (Luo và cộng sự, 2005). Phù hợp với một nghiên cứu gần đây về Clec12a và Salmonella, những dữ liệu này cho thấy quá trình thực bào bị khiếm khuyết khi không có Clec12a để đáp ứng với F. Rodentium cư trú bình thường trong ruột (Begun và cộng sự, 2015). Để kiểm tra điều này, các đại thực bào phúc mạc đã được thu thập từ động vật WT và Clec12a-/- và được nuôi cấy cùng với F. Rodentium có nhãn Sybr®-green. Các đại thực bào Clec12a-/- có ít vi khuẩn trên mỗi tế bào hơn đáng kể (Hình 5F, G; Hình S5B), cho thấy rằng sự thiếu hụt Clec12a dẫn đến sự hấp thu của ít sinh vật hơn và phù hợp với tình trạng thực bào giảm trong bộ dữ liệu RNA-seq. Nói chung, các dữ liệu này cho thấy Clec12a đóng vai trò kép trong việc giảm thiểu các phản ứng viêm quá mức đối với các phối tử vi khuẩn thông thường đồng thời thúc đẩy sự hấp thu của vi khuẩn đại thực bào.

Clec12a liên kết tốt hơn với các phần thưởng gram dương

Vì quá trình thực bào được bắt đầu bằng sự liên kết của vi khuẩn, sau đó là quá trình nội hóa và tiêu diệt, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng Clec12a có thể liên kết với các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật, chẳng hạn như F. Rodentium. Để giải quyết khả năng này, một protein tổng hợp chứa miền liên kết ngoại bào của Clec12a ở chuột và phần Fc của IgG1 ở người (Clec12a-Fc) đã được tạo ra (Hình 6A) (Maglinao và cộng sự, 2014; Neumann và cộng sự, 2014; Raulf và cộng sự, 2019). Protein này đã được tinh chế và sàng lọc để liên kết với một nhóm vi khuẩn gram dương và gram âm khác nhau được biết là có mặt trong ruột cân bằng nội môi, bao gồm F. Rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria Animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes clockis, và nấm Candida albicans hội sinh bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Salmonella enterica cũng được đưa vào vì các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng Clec12a có thể liên kết với sự xâm nhập của S. enterica vào tế bào (Begun và cộng sự, 2015). Clec12a liên kết ở các mức độ khác nhau với một số vi khuẩn khác biệt về mặt phát sinh gen, bao gồm F. Rodentium, nhưng không liên kết với nấm, C. albicans (Hình 6B). Clec12a liên kết cao nhất với các sinh vật gram dương F. Rodentium và là thành viên của họ Lachnospiraceae Roseburia sp., và tương tác ít nhất với B. Animalis, B. clockis và S. enterica (Hình 6B), cho thấy Clec12a có thể liên kết với các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật với ưu tiên các sinh vật gram dương. Tổng hợp dữ liệu của chúng tôi xác định Clec12a là một cơ chế được hệ thống miễn dịch sử dụng để khảo sát cộng đồng vi khuẩn đường ruột và cắt tỉa hệ vi sinh vật thông qua liên kết trực tiếp và thực bào đồng thời ngăn chặn phản ứng viêm quá mức đối với lượng vi khuẩn gram dương dồi dào, điều này rất quan trọng để duy trì sức khỏe đường ruột.

CUỘC THẢO LUẬN

Cân bằng nội môi trong ruột đòi hỏi các cơ chế hạn chế vi khuẩn hội sinh mà không gây ra tình trạng viêm nhiễm gây tổn hại (Macpherson và cộng sự, 2000). Trong những năm gần đây, IgA đã nổi lên như một trong những cách quan trọng để khả năng miễn dịch đường ruột có thể kiểm soát hệ vi sinh vật (Pabst và Slack, 2020). Thật vậy, IgA có thể liên kết trực tiếp với vi khuẩn và/hoặc các sản phẩm của chúng và loại bỏ chúng khỏi ruột mà không gây ra tình trạng viêm điển hình nguyên thủy. Cho đến nay, các phân tử miễn dịch khác sở hữu những đặc tính kép này vẫn chưa được nghiên cứu. Lectin loại C bao gồm một loại protein đa dạng có thể nhận biết nhiều loại phân tử protein, carbohydrate và lipid từ các sản phẩm vi sinh vật và vật chủ (Brown và cộng sự, 2018; Drouin và cộng sự, 2020). Tuy nhiên, một số ít đã được nghiên cứu trong bối cảnh miễn dịch đường ruột và hệ vi sinh vật (Iliev và cộng sự, 2012; Martinez-Lopez và cộng sự, 2019). Vì vậy, theo hiểu biết của chúng tôi, đây là bằng chứng đầu tiên cho thấy sự thiếu hụt Clec12a làm thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật gây ra mức độ nghiêm trọng của bệnh.

lợi ích cistanche-tăng cường hệ thống miễn dịch

Clec12a đã được nghiên cứu phần lớn trong bối cảnh nhận biết mononatri urate (MSU) hoặc axit uric, thường là dấu hiệu của sự chết tế bào (Kono và cộng sự, 2010; Neumann và cộng sự, 2014). Axit uric có khả năng kích hoạt các phản ứng viêm thông qua dòng tế bào NLRP3, do đó, để ngăn chặn sự phá hủy mô trong quá trình chết tế bào, tình trạng viêm này phải được kiểm soát (Martinon và cộng sự, 2006). Clec12a đã được chứng minh là có thể cân bằng phản ứng viêm này thông qua việc điều hòa giảm tín hiệu Syk (Marshall và cộng sự, 2004). Phù hợp với điều này, việc xóa Clec12a trong mô hình viêm vô trùng và mô hình tự viêm của bệnh viêm khớp gây ra sự kích hoạt bạch cầu trung tính tăng cường và khiến bệnh trở nên trầm trọng hơn, khiến Clec12a trở thành một loại phanh chống viêm quan trọng (Redelinghuys và cộng sự, 2016). Tuy nhiên, gần đây hơn, Clec12a cũng đã được chứng minh là có tác dụng tăng cường tín hiệu interferon loại I để đáp ứng với nhiễm vi rút và làm trung gian hấp thu Salmonella thông qua con đường tự thực kháng khuẩn (Begun và cộng sự, 2015; Li và cộng sự, 2019). Điều này chứng tỏ rằng Clec12a không chỉ có chức năng hạn chế tình trạng viêm mà còn có thể đóng nhiều vai trò khác nhau tùy theo ngữ cảnh. Ruột khác ở chỗ có một số lượng lớn tế bào miễn dịch ngay cả khi không có bệnh. Điều này là do sự hiện diện của hệ vi sinh vật, hệ vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng trong việc hướng dẫn sự phát triển miễn dịch và ngăn chặn sự xâm chiếm của các sinh vật gây bệnh. Hệ vi sinh vật có các kiểu bề mặt tương tự được phát hiện bởi TLR cũng nhận biết mầm bệnh và do đó hệ thống miễn dịch đường ruột phải có cơ chế điều tiết nghiêm ngặt để hạn chế tình trạng viêm nhiễm đối với các sinh vật lạ này (Blander và cộng sự, 2017).

Ban đầu, chúng tôi quan tâm đến Clec12a vì chúng tôi đã xác định được rằng một loại nấm đường ruột, Saccharomyces cerevisiae, tạo ra axit uric làm trầm trọng thêm bệnh viêm đại tràng (Chiaro và cộng sự, 2017). Hơn nữa, các nghiên cứu khác đã xác định rằng hệ vi sinh vật có thể ảnh hưởng đến bệnh đường ruột thông qua việc kích thích chuyển hóa purine, trong đó sản phẩm cuối cùng ở động vật có vú là axit uric (Zhu và cộng sự, 2019). Những dữ liệu này cho thấy các cơ chế cảm nhận axit uric, chẳng hạn như Clec12a, có thể ảnh hưởng đến cân bằng nội môi đường ruột. Tuy nhiên, chúng tôi quan sát thấy không có sự thay đổi nào về nồng độ axit uric trong huyết thanh hoặc phân, cho thấy rằng mức độ nghiêm trọng của bệnh tăng cao ở động vật Clec12a-/- không phải do axit uric tăng. Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng ngày càng tăng của bệnh viêm đại tràng ở Clec12a-/- là do thành phần của hệ vi sinh vật. Do đó, dựa trên dữ liệu của chúng tôi, việc giảm biểu hiện Clec12a-/- có thể ảnh hưởng đến thành phần của hệ vi sinh vật ở bệnh nhân IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman và cộng sự, 2011; Vijay Kumar và cộng sự, 2010). Thật thú vị, chúng tôi phát hiện ra rằng thuốc kháng sinh nhắm vào các sinh vật gram dương có thể cải thiện mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng ở động vật Clec12a-/-. Điều này trái ngược với một số báo cáo đã xác định được Enterobacteriaceae gram âm mở rộng trong quá trình viêm ruột, do đó, đây là một trong số ít nghiên cứu đã xác định được sự mở rộng của các vi khuẩn gram dương có liên quan đến sự phát triển viêm đại tràng. Mặc dù, có thể không phải là sinh vật duy nhất ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng trong mô hình này, nhưng sự gia tăng đáng kể của F. Rodentium đã được quan sát thấy ở động vật Clec12a-/-. F. Rodentium là thành viên gram dương, oxidase và catalase âm của ngành Firmicutes (Bacillota) (Chang và cộng sự, 2015). Việc sử dụng F. Rodentium hàng ngày cho chuột WT giúp tăng cường viêm đại tràng, chứng minh rằng mức độ F. Rodentium tăng cao trong ruột có hại và có khả năng gây ra mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng ở Clec12a-/-. Một báo cáo gần đây đã chứng minh rằng F. Rodentium có thể làm tăng sự thay đổi biểu mô và ngăn chặn sự biểu hiện của các enzyme trong biểu mô có chức năng điều hòa phản ứng viêm và do đó phù hợp với tình trạng bệnh trở nên trầm trọng hơn mà chúng ta thấy khi F. Rodentium phát triển trong ruột (Cao và cộng sự, 2022). Khi con người bị xâm chiếm bởi một sinh vật tương tự như F. Rodentium (Zagato và cộng sự, 2020), các nghiên cứu sâu hơn sẽ làm sáng tỏ ảnh hưởng của những vi khuẩn giống F. Rodentium này lên các khía cạnh sinh lý của con người liên quan đến viêm đại tràng.

Hỗ trợ vai trò của Clec12a trong số các tế bào miễn dịch bẩm sinh, chúng tôi quan sát thấy hệ vi sinh vật gây bệnh đường ruột vẫn được hình thành ở Clec12a-/- động vật thiếu hệ thống miễn dịch thích nghi. Tỷ lệ tế bào trong ruột biểu hiện Clec12a cao nhất là các đại thực bào, điều này khiến chúng tôi tập trung vào chức năng Clec12a trong các tế bào này. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng Clec12a là chất trung gian quan trọng trong việc sản xuất interferon loại I để đáp ứng với nhiễm virus (Li và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, Clec12a tác động như thế nào đến phản ứng với phổ rộng các phối tử vi khuẩn vẫn chưa được đánh giá; điều này rất có liên quan trong ruột nơi tồn tại rất nhiều phối tử TLR. Ở đây, chúng tôi cho thấy rằng Clec12a có tác dụng điều hòa các phản ứng của đại thực bào trong ruột và có khả năng đảm bảo cân bằng nội môi để đáp ứng với hệ vi sinh vật. RNA-seq của các đại thực bào được ủ với F. Rodentium nhấn mạnh rằng sự thiếu hụt Clec12a dẫn đến các khiếm khuyết về chu kỳ tế bào và quá trình thực bào để đáp ứng với các vi khuẩn hội sinh này. Một nghiên cứu gần đây cho thấy các đại thực bào Clec12a-/- đã làm giảm khả năng tự thực bào khi phản ứng với Salmonella (Begun và cộng sự, 2015). Dữ liệu của chúng tôi khen ngợi và mở rộng những phát hiện này để bao gồm cả chức năng của Clec12a để kiểm soát các sinh vật hội sinh không xâm lấn. Những người khác đã chứng minh F. Rodentium có ảnh hưởng đến sinh học biểu mô, điều này cho thấy F. Rodentium nằm rất gần vật chủ và do đó phải được hệ thống miễn dịch kiểm soát chặt chẽ. Dữ liệu của chúng tôi hỗ trợ rằng Clec12a kiểm soát F. Rodentium thông qua việc điều hòa quá trình thực bào. Quá trình thực bào được bắt đầu bằng sự liên kết vật lý của phối tử hoặc vi khuẩn và lectin loại C có thể liên kết với nhiều phối tử, điều này khiến chúng tôi phải kiểm tra xem liệu Clec12a có thể liên kết trực tiếp với vi khuẩn cư trú trong ruột hay không. Điều thú vị là, Clec12a liên kết cao nhất với các sinh vật gram dương F. Rodentium và Roseburia và ít hơn nhiều với các sinh vật gram âm A. muciniphila và B. clockis và hoàn toàn không gắn với C. albicans. Dữ liệu này cho thấy Clec12a có xu hướng liên kết các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật. Điều này cho phép chúng tôi xây dựng một mô hình trong đó sự tham gia của Clec12a và quá trình thực bào tiếp theo có thể kiểm soát một số thành viên của hệ vi sinh vật và ngăn chặn những tác động có hại của việc mở rộng chúng. Điều này nêu bật chức năng kép của Clec12a có thể hạn chế tình trạng viêm chống lại các phối tử vi khuẩn đồng thời nhận biết và kiểm soát các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật. Do đó, Clec12a đại diện cho một cách độc đáo mà hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng để đảm bảo cân bằng nội môi trong đường tiêu hóa.

HÌNH HUYỀN THOẠI

Hình 1. Clec12a hạn chế bệnh đường ruột độc lập với hệ thống miễn dịch thích nghi

(A) Để đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng WT hoặc Clec12a-/- C57BL/6 chuột không có mầm bệnh (SPF) cụ thể được điều trị bằng 2,5% dextran natri sulfat (DSS) quảng cáo tự do trong 7 ngày trong nước uống. Phần trăm giảm cân được đánh giá hàng ngày. Giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được tổng hợp từ ba thử nghiệm độc lập sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA hai chiều và Śídák.

(B) Chiều dài ruột già (cm) của động vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được gộp từ ba thử nghiệm độc lập bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột

(C) Lipocalin trong phân-2 (ng/mL) của động vật được chỉ định được đo bằng chỉ số viêm. Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được gộp từ hai thử nghiệm độc lập bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột

(D) Các phần đại tràng nhuộm màu H&E đại diện từ các động vật được chỉ định sau khi bị viêm đại tràng do DSS.

(E) Điểm mô học của động vật được chỉ định được tạo ra từ các phần ruột ở

(D). Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

(F) Mô hình chuyển tế bào T của viêm đại tràng được thực hiện để đánh giá viêm đại tràng mãn tính. Trọng lượng của động vật TCRb-/- và Clec12a-/- ;TCRb-/- được đo hàng tuần. Biểu đồ mô tả phần trăm giảm cân của động vật được chỉ định trong suốt thí nghiệm. Giá trị trung bình +/- SEM, so với 2-cách ANOVA.

(G) Chiều dài thuộc địa của các động vật được chỉ định từ (I) được đo khi hiến tế. Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

(H) WT, Clec12a-/- , Rag-/- hoặc Rag-/- ;Clec12a-/- C57BL/6 SPF được đánh giá về bệnh viêm đại tràng cấp tính. Động vật được chỉ định được cung cấp 2,5% DSS quảng cáo tự do trong 7 ngày. Phần trăm giảm cân được đánh giá hàng ngày. Giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu là đại diện của hai thí nghiệm độc lập. Thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA và Śídák hai chiều.

(I) Chiều dài ruột già (cm) của động vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu là đại diện của hai thử nghiệm độc lập sử dụng các thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Hình 2. Hệ vi sinh vật hình thành ở động vật Clec12a-/- làm bệnh viêm đại tràng trở nên trầm trọng hơn

A) Cấy ghép microbiota trong phân (FMT) được thực hiện bằng cách chuyển chất nổi trên bề mặt phân từ động vật WT hoặc Clec12a sang chuột WT không có mầm bệnh. Các vi sinh vật được phép đồng nhất trong bốn tuần, sau đó, một nửa số chuột WTFMT và một nửa số chuột Clec12a-/-FMT được nhốt chung và cho phép trộn thêm bốn tuần nữa. Tất cả các nhóm sau đó nhận được 2,5% DSS ad libitum trong nước uống của họ và bị loại bỏ vào ngày thứ 7.

B) Phần trăm giảm cân của động vật được chỉ định được đánh giá hàng ngày. Biểu đồ mô tả giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được tổng hợp từ hai thử nghiệm độc lập sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA hai chiều và Śídák.

C) Chiều dài ruột già (cm) của các con vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng ANOVA một chiều thông thường với thử nghiệm so sánh nhiều chiều của Dunnett. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

D) Các phần ruột kết được nhuộm màu H&E đại diện của động vật được chỉ định sau khi bị viêm đại tràng do FMT và DSS.

E) Điểm mô học được tạo ra từ các phần đại tràng ở (D). Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

F) Khoảng cách Unifrac có trọng số từ trình tự gen 16S rRNA của WTFMT, Clec12a-/- FMT hoặc động vật sống chung. Các biểu đồ hình hộp và râu hiển thị tất cả các điểm (so sánh khoảng cách theo cặp) và được so sánh bằng cách sử dụng bài kiểm tra Kruskal-Wallis.

G) Khoảng cách Unifrac không trọng số từ trình tự gen 16S rRNA của WTFMT, Clec12a-/- FMT hoặc động vật nuôi chung. Các biểu đồ hình hộp và râu hiển thị tất cả các điểm (so sánh khoảng cách theo cặp) và được so sánh bằng cách sử dụng bài kiểm tra Kruskal-Wallis.

H) Khoảng cách Bray-Curtis với trình tự gen 16S rRNA của WTFMT, Clec12a-/- FMT hoặc động vật sống chung. Các biểu đồ hình hộp và râu hiển thị tất cả các điểm (so sánh khoảng cách theo cặp) và được so sánh bằng cách sử dụng bài kiểm tra Kruskal-Wallis.

Hình 3: Thành phần hệ vi sinh vật được hình thành ở động vật Clec12a-/- không phụ thuộc vào khả năng miễn dịch thích nghi

A) Sơ đồ thể hiện sự phục hồi tủy xương với FMT tiếp theo. Chuột C57Bl/6 WT được chiếu xạ gây chết và được hoàn nguyên bằng WT hoặc Clec12a-/- tủy xương. Sau 8 tuần, phân được lấy từ những con chuột này và chuyển vào những con chuột không có mầm bệnh WT như được giải thích ở (A). Sau đó, các động vật tinh tinh được hoàn nguyên ban đầu được cung cấp 2,5% DSS ad libitum trong nước uống của chúng.

B) Phần trăm giảm cân của chuột FMT từ (F) được đánh giá hàng ngày. Giá trị trung bình +/- SEM, sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA và Tukey hai chiều.

C) Chiều dài ruột già (cm) của các con vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột

D) FMT để đánh giá vai trò của hệ thống miễn dịch thích ứng đối với sự hình thành vi khuẩn và mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng đã được thực hiện bằng cách chuyển chất nổi trong phân từ Rag-/- hoặc Rag-/-; Clec12a-/- SPF vào chuột không có mầm bệnh WT như mô tả trong (A). Chuột được điều trị bằng DSS 2,5% trong 7 ngày. Phần trăm giảm cân được đánh giá hàng ngày. Biểu đồ là giá trị trung bình +/- SEM, sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA và Tukey hai chiều.

E) Chiều dài ruột già (cm) của các con vật được chỉ định trong (F) được đo khi hiến tế. Giá trị trung bình +/-, SEM được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA và Dunnet một chiều thông thường. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Hình 4. Clec12a hạn chế sự phát triển của loài gặm nhấm Faecalibaculum, một loại vi khuẩn làm bệnh viêm đại tràng trở nên trầm trọng hơn

A) Chuột WT hoặc Clec12a-/- C57BL/6 SPF được cho uống một loại cocktail kháng sinh (A) (neomycin, gentamycin, ampicillin, erythromycin), cephalothin hoặc gentamycin (B, C) ở nồng độ 0. 5g/L trong 14 ngày. Sau bảy ngày, động vật được cho uống 2,5% DSS trong nước uống cho đến khi hiến tế. Chiều dài ruột già (cm) của các con vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

B) Phần trăm giảm cân của động vật được chỉ định được đánh giá hàng ngày. Biểu đồ là giá trị trung bình +/- SEM, sử dụng thử nghiệm so sánh bội ANOVA và Tukey hai chiều

C) Chiều dài ruột già (cm) của động vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, t-test không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

D) Các đặc điểm được quan sát từ phân WT hoặc Clec12a-/-, tính đa dạng alpha trình tự 16S rRNA. Giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng phép thử Mann-Whitney.

E) Pielou Evenness từ WT hoặc phân Clec12a-/-, sự đa dạng alpha trình tự 16S rRNA. Giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng phép thử Mann-Whitney.

F) Trung bình Entropy của Shannon +/- SEM, được so sánh bằng phép thử Mann-Whitney.

G) Phân tích ANCOM từ phân WT và Clec12a-/-. Tên phân loại là cách phân loại ASV tốt nhất bằng cách sử dụng Cơ sở dữ liệu phân loại bộ gen (GTDB).

H) Sự phong phú tương đối của ASV Faecalibaculum Rodentium. So sánh khi sử dụng Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) Chuột C57Bl/6 WT SPF được xử lý trước bằng 1x108 CFU của F. Rodentium bằng đường uống trong ba ngày. Sau đó, động vật nhận được 2,5% DSS trong nước uống của chúng trong 7 ngày trong khi tiếp tục nhận được thức ăn F. Rodentium hàng ngày. Phần trăm giảm cân được đánh giá hàng ngày. Giá trị trung bình +/- SEM, Dữ liệu được tổng hợp từ bốn thử nghiệm riêng biệt bằng cách sử dụng thử nghiệm so sánh đa chiều ANOVA và Tukey hai chiều.

J) Chiều dài ruột già (cm) của các con vật được chỉ định được đo khi hiến tế. Biểu đồ thanh là giá trị trung bình +/- SEM, Dữ liệu được tổng hợp từ bốn thử nghiệm riêng biệt được so sánh bằng cách sử dụng ANOVA một chiều thông thường với thử nghiệm hiệu chỉnh bội số Dunnet. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Hình 5. Clec12a hạn chế tình trạng viêm và thúc đẩy quá trình thực bào trong đại thực bào.

A) Kiểu hình miễn dịch được thực hiện thông qua phương pháp tế bào học dòng chảy trên các tế bào phân lập từ propria lamina đại tràng (cLP) trên động vật WT và Clec12a-/-. Bản đồ nhiệt cho thấy tần suất biểu hiện Clec12a trên các tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích nghi

B) Biểu đồ thanh hiển thị tần số của các tế bào tiền cổng, CD{1}} (đại thực bào M1) từ cLP của các động vật được chỉ định. Giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

C) Biểu đồ thanh hiển thị tần số của các tế bào tiền cổng, EGR{1}} (đại thực bào M2) từ cLP của các động vật được chỉ định. Giá trị trung bình +/- SEM, được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

D) BMDM được thu hoạch từ xương dài WT và Clec12a-/- và nuôi cấy với sự có mặt của M-CSF (20ng/mL) trong 7 ngày. Vào ngày thứ 8, BMDM được truyền xung bằng LPS (100ng/mL), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/mL) hoặc Flagellin (1mg/mL) trong 24 giờ. Môi trường được thu thập và thử nghiệm để sản xuất cytokine. Bản đồ nhiệt cho thấy sự thay đổi lần lượt Log2 của các cytokine được chỉ định từ Clec12a-/- so với WT.

E) BMDM từ WT và Clec12a-/- chuột được phân lập và nuôi cấy như trong (A), sau đó được nuôi cấy cùng với F. Rodentium ở MOI là 10 trong 24 giờ. Sau khi BMDM được rửa sạch, RNA được thu thập và chuẩn bị để giải trình tự RNA. 10 danh mục thuật ngữ GO (quy trình sinh học) được đơn giản hóa hàng đầu được làm phong phú trong số Clec12a-/- được điều chỉnh lại

F) Các đại thực bào phúc mạc được phân lập từ chuột WT và Clec12a-/- và sau đó được nuôi cấy bằng F. Rodentium nhuộm màu xanh lá cây Sybr để đánh giá khả năng thực bào. Bên trái: đại thực bào WT. Phải: đại thực bào Clec12a-/-. Hình ảnh đại diện từ trường sáng (cột bên trái), huỳnh quang (cột giữa) và hợp nhất (cột bên phải) được mô tả. Đầu mũi tên màu vàng biểu thị các ví dụ về tế bào F. Rodentium bị đại thực bào nhấn chìm. thanh tỷ lệ=20 µm. Hình ảnh là đại diện của hai thí nghiệm riêng biệt.

G) Biểu đồ thanh hiển thị số sinh vật trên mỗi tế bào, như được thấy trong (F). 250 tế bào WT và 269 tế bào Clec12a-/- đã được đếm để định lượng lượng F. Rodentium trên mỗi tế bào.

Hình 6: Clec12a liên kết trực tiếp với các thành viên cụ thể của hệ vi sinh vật.

A) Sơ đồ mô tả protein tổng hợp Clec12a-human IgG1-hoặc vectơ trống (chỉ phần Fc) B) Biểu đồ phân tích tế bào học dòng chảy thể hiện sự liên kết khác biệt của Clec12a-Fc với các vi khuẩn khác nhau hoặc C. albicans.

HUYỀN THOẠI HÌNH BỔ SUNG

Bổ sung Hình 1. Sự vắng mặt của Clec12a không làm gián đoạn nồng độ axit uric.

A) Axit uric huyết thanh (µM) của động vật được chỉ định đã được đo để đánh giá quá trình chuyển hóa purine giữa chuột WT và Clec12a-/- C57Bl/6. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được gộp từ ba thử nghiệm độc lập bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

B) Axit uric trong phân (µM) của động vật được chỉ định đã được đo để đánh giá sự bài tiết axit uric trong ruột giữa chuột WT và Clec12a-/- C57Bl/6. Biểu đồ phân tán là giá trị trung bình +/- SEM, dữ liệu được gộp từ ba thử nghiệm độc lập bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi. Mỗi điểm đại diện cho một con chuột.

Hình bổ sung 2. Bệnh phân biệt ổ vi khuẩn WT và Clec12a-/-

Phần trăm giảm cân của động vật WT và Clec12a-/- được điều trị bằng hỗn hợp kháng sinh bao gồm neomycin, gentamycin, ampicillin và erythromycin.

Bổ sung Hình 3. Thành phần microbiota bị ảnh hưởng bởi Clec12a.

A) Sơ đồ PCoA của 3 trục đầu tiên dựa trên khoảng cách Bray-Curtis hiển thị mối quan hệ tổng thể của hệ vi sinh vật cũng như các sơ đồ hộp và râu tương ứng định lượng sự khác biệt trong mỗi nhóm và được so sánh với thử nghiệm Mann-Whitney.

B) Các sơ đồ PCoA dựa trên khoảng cách Unifrac có trọng số và các sơ đồ hộp và râu tương ứng định lượng sự khác biệt trong nhóm so với việc sử dụng thử nghiệm Mann-Whitney không ghép đôi.

C) Bảng hiển thị kết quả xét nghiệm PERMANOVA đối với hệ vi sinh vật WT so với Clec12a-/- trong phân với khoảng cách Bray-Curtis và Unifrac có trọng số.

Bổ sung Hình 4: Clec12a trong đại thực bào hạn chế tình trạng viêm.

A) Sơ đồ đàn vĩ cầm mô tả cường độ huỳnh quang trung bình hình học (MFI) của các tế bào miễn dịch được thể hiện trong (A). Kiểm tra trung bình +/- SEM, Kruskal-Wallis với hiệu chỉnh của Dunn cho nhiều so sánh. Các chữ cái biểu thị các nhóm có sự khác biệt đáng kể.

B) Sơ đồ tế bào học dòng đại diện của đại thực bào M1 và M2 từ cLP của chuột WT hoặc Clec12a-/- sau viêm đại tràng DSS. Các ô được kiểm soát trước trên trực tiếp, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ và CD64+. Từ hình 5A

Hình 5 bổ sung. Clec12a ổn định việc kiểm soát chu kỳ tế bào và điều hòa quá trình thực bào trong đại thực bào.

A) 10 danh mục thuật ngữ GO (quy trình sinh học) đơn giản hóa hàng đầu được làm phong phú giữa các gen được điều chỉnh tăng Clec12a-/- so với WT để đáp ứng với F. Rodentium. BMDM từ WT và Clec12a-/- chuột được nuôi cấy cùng với F. Rodentium đã được phân lập và phân tích như trong Hình 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 đại thực bào đã được đếm. Biểu đồ thanh hiển thị số lượng F. Rodentium trung bình từ 4 giếng riêng lẻ để thể hiện tính nhất quán trong cách đếm và tác dụng trên các giếng. Giá trị trung bình +/- SEM được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi.

SỰ NHÌN NHẬN

Chúng tôi xin cảm ơn Gordon Brown vì đã cung cấp động vật Clec12a-/- cho dự án này. Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ Helen Hay Whitney (KSO), Quỹ đào tạo T32 về sinh bệnh học vi khuẩn NRSA của Đại học Utah (KSO), Giải thưởng nghiên cứu cấp cao CCFA (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 và NCCAM R01AT011423 (JLR), Edward Mallinckrodt Quỹ Jr. (JLR), Giải thưởng NGHỀ NGHIỆP của NSF (IOS-1253278) (JLR), Học bổng Khoa học và Kỹ thuật Packard (JLR), Nhà điều tra Chào mừng Burroughs về Giải thưởng Sinh bệnh học (JLR), Quỹ Hen suyễn Hoa Kỳ (JLR), Margolis Foundation (JLR), một khoản trợ cấp của Trung tâm Xã hội MS (JLR) và Giải thưởng Nhà sáng tạo mới NIH DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), Tài trợ nghiên cứu của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ (RMO), Giải thưởng Học giả Kimmel (RMO), R01AG047956 (RMO) và NIAID R01AI141202 (ASI). Công trình này được hỗ trợ bởi Cơ sở đo tế bào dòng chảy của Đại học Utah cùng với Viện Ung thư Quốc gia thông qua Giải thưởng Số 5P30CA042014-24. Xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ và nguồn lực từ Trung tâm Điện toán Hiệu năng Cao tại Đại học Utah.

SỰ ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

TRC đã giúp hình thành nên nghiên cứu, thực hiện hầu hết các thí nghiệm trên chuột và miễn dịch học, tổng hợp dữ liệu thành các hình vẽ và giúp viết bản thảo. RB đã thiết lập các thí nghiệm không có mầm bệnh và duy trì tất cả các động vật không có mầm bệnh. ESV đã hỗ trợ các thí nghiệm về lớp màng miễn dịch trong ruột. KSO đã giúp thu hoạch chuột và cung cấp cái nhìn sâu sắc cũng như phương hướng. KMB đã giúp thu hoạch chuột và đo tế bào theo dòng chảy. MCN đã giúp thu hoạch chuột. WV đã trợ giúp xây dựng cấu trúc cho protein tổng hợp và quá trình tinh chế. TJ đã cung cấp trợ giúp về xét nghiệm thực bào. JH đã phân tích các slide kính hiển vi thực bào. MH đã cung cấp trợ giúp trong việc tinh chế và sử dụng protein tổng hợp. KAK cung cấp các chủng vi khuẩn phân lập. ROC cung cấp kiến ​​thức chuyên môn và hiểu biết sâu sắc về miễn dịch học. WZS đã giúp hình thành nghiên cứu, thực hiện các phân tích tin sinh học, hỗ trợ chuẩn bị số liệu và thống kê cũng như giúp viết bản thảo. JLR đã giúp hình thành và chỉ đạo nghiên cứu, giám sát thiết kế và kết quả thử nghiệm, tổ chức các cộng tác viên và thuốc thử, thu hút tài trợ cho nghiên cứu và giúp viết bản thảo.

PHƯƠNG PHÁP

Chủng chuột

Tất cả các dòng chuột được sử dụng ở đây đều có nền C57BL/6. Chuột Clec12a-/- được Gordon Brown (Trung tâm Hội đồng nghiên cứu y tế về nấm y học, Đại học Exeter) cung cấp và có kiểu gen theo quy trình được mô tả trước đây của họ (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- và TCRb-/- (Phòng thí nghiệm Jackson, 002118) được lấy từ Phòng thí nghiệm Jackson và được duy trì trong đàn chuột của chúng tôi trong nhiều thế hệ. Đối với tất cả các thí nghiệm về bệnh viêm đại tràng in vivo, chuột phù hợp với giới tính từ 8 đến {12}}tuần tuổi đã được sử dụng. Cả chuột đực và chuột cái đều được sử dụng. Chuột được duy trì trong điều kiện không có mầm bệnh cụ thể.

Các chủng vi khuẩn và nấm

Các sinh vật sau đây được lấy từ Bộ sưu tập Vi sinh vật và Nuôi cấy Tế bào GmbH của DSMZ-Đức: Faecalibaculum Rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacteria động vật DSMZ (DSM# 26074). Đồng phục Bacteroides được mua lại từ Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ (ATCC® 8492™). Một chủng Roseburia sp (ký hiệu chủng JLR.KK002) đã được phân lập trên môi trường thạch Schaedler từ chuột C57BL/6 chứa một hệ vi sinh vật giàu bào tử trước đây. Việc làm giàu bào tử trước đây đã được thực hiện như mô tả trước đây và chuột được duy trì qua nhiều thế hệ với hệ vi sinh vật này trong cơ sở gnotobiotic của chúng tôi trước khi JLR.KK002 được phân lập từ phân (Browne và cộng sự, 2016). Chúng tôi khuếch đại PCR và Sanger giải trình tự gen 16S rRNA rồi phân loại nó với dịch vụ SILVA ACT và cơ sở dữ liệu SILVA (Pruesse et al., 2012). Chủng Salmonella typhimurimum ST2 đã được sử dụng. Chủng Candida albicans sc5314 đã được sử dụng. Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong cộng đồng tổng hợp PhyLo11b được mô tả dưới đây.

Viêm đại tràng thực nghiệm do DSS gây ra

Bệnh viêm đại tràng được gây ra bằng cách bổ sung 2,5% hoặc 3% (w/v) 36,000-50,000MW Dextran natri sulfat (DSS) (MP Biomedicals) vào nước uống trong 7 ngày. Mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng được theo dõi hàng ngày thông qua những thay đổi về trọng lượng cơ thể, độ đặc của phân và máu trong phân. Đối với thí nghiệm giải cứu bạch cầu đơn nhân, tất cả chuột nhận được 2,5% DSS trong 5 ngày, sau đó được cung cấp nước thường xuyên; việc theo dõi cân nặng tiếp tục đến ngày thứ 10 khi động vật được thu hoạch. Giới hạn mức độ nghiêm trọng của việc giảm cân lớn hơn 20% được áp dụng làm ngưỡng nghiêm trọng. Tại các điểm cuối thử nghiệm, MLN và dấu hai chấm đã bị xóa. Đại tràng được đo từ manh tràng đến trực tràng để xác định chiều dài. Các mô sau đó được xử lý để phân tích mô học, chiết xuất RNA hoặc phân tích tế bào học dòng chảy.

Mô học đại tràng và tính điểm

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

ELISA lipocalin-2 (LCN-2)

Giao thức được thực hiện theo giao thức của nhà sản xuất (Fischer Scientific DY1857-05). Tóm lại, phân được thu thập, cân và nghiền trong HBSS 1X ở nồng độ 100mg/mL. Các mẫu sau đó được quay ở tốc độ 50 xg trong 5 phút để loại bỏ các mảnh vụn lớn. Chất nổi phía trên sau đó được loại bỏ và đặt vào một ống mới và quay ở tốc độ 8000 xg trong 5 phút để tạo thành viên vi khuẩn. Chất nổi phía trên này sau đó được pha loãng tùy theo tình trạng bệnh của động vật nhưng thường nằm trong khoảng từ 1:100- 500 (khỏe mạnh) – 1:500-1000 (được xử lý DSS). Đo axit uric Nồng độ axit uric được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Bộ xét nghiệm hoạt tính Invitrogen™ Amplex™Red Uric/Uricase, cat# A22181). Tóm lại, máu được thu thập từ chuột WT hoặc Clec12a-/- bằng cách chọc thủng tim vào các ống tách huyết thanh hàng đầu bằng vàng. Các ống được để đông trong 30 phút và sau đó quay ở tốc độ 1300 xg trong 10 phút. Huyết thanh được lấy ra và cho vào ống Eppendorf 1,5ml, đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ -80 độ C cho đến khi thử nghiệm. Axit uric trong phân được thực hiện bằng cách thu được các viên phân tươi từ chuột WT và Clec12-/-. Các viên được cân và ghi lại, sau đó được nghiền trong 1mL dung dịch đệm phản ứng 1x. Sau khi nghiền vật lý, các ống được quay ở tốc độ 50 xg trong 5 phút để loại bỏ các mảnh vụn lớn. Bùn phân còn lại được phân tích để tìm axit uric.

Viêm đại tràng thực nghiệm chuyển tế bào T

Lách WT được phân lập và nghiền trong RPMI chứa 10% huyết thanh bò bào thai, penicillin và streptomycin. Các tế bào được quay ở tốc độ 367 xg để phân lập các tế bào. Sau đó, viên tạo thành được lơ lửng trong dung dịch đệm ly giải RBC 1x trong 5 phút, ở nơi tối, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào bạch cầu thu được sẽ được chuyển qua cột Miltenyi CD4+ MACS để phân lập tế bào T CD4+. Sau đó, các tế bào T được nhuộm bằng CD4 và CDRB và được phân loại trên FACS Aria Fusion (BD Bioscatics). CD4+ tế bào CDRBHi đã được thu thập và quản lý cho TCRb-/- hoặc TCRb-/-; Clec12a-/- chuột trong phúc mạc (IP). Mỗi con chuột nhận được 5 x 105 ô. Mức độ nghiêm trọng và sự phát triển của bệnh viêm đại tràng được theo dõi hàng tuần bằng cách đánh giá tình trạng giảm cân. Tại điểm cuối thử nghiệm, MLN và dấu hai chấm được loại bỏ và dấu hai chấm được đo từ manh tràng đến trực tràng để đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh.

Phân lập bạch cầu từ propria lamina đại tràng

Các dấu hai chấm của chuột có manh tràng kèm theo được thu hoạch và đặt vào 1X PBS trong 6-các đĩa giếng trên băng. Bất kỳ chất béo và mô liên kết nào còn sót lại đều được loại bỏ và manh tràng được cắt bớt khỏi ruột kết. Các đại tràng được mở ra và chất nhầy cũng như phân được loại bỏ cẩn thận khỏi đại tràng trước khi đặt lại vào 6-đĩa giếng. Sau khi tất cả các dấu hai chấm đã được tách ra và cạo sạch, mỗi dấu hai chấm được cắt hạt lựu trên nắp đĩa petri bằng lưỡi dao cạo và đặt vào một ống 50 mL riêng biệt. 10 mL dung dịch phân ly được làm ấm trước (1X HBSS không có Ca+ và Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES và 30 mM EDTA) được thêm vào và lắc nhanh các ống. Colons được ủ trong khoảng 25 phút. ở 37 độ và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút cho đến khi dung dịch đục do quá trình tách IEC. Các mẫu được lắc 3X và xoáy trong 15 giây sau đó đổ qua bộ lọc 100 mM trên hình nón 50 ml để loại bỏ các tế bào không miễn dịch như IEC và các bộ lọc được rửa nhanh bằng 2 mL PBS 1X lạnh như đá. Các mô còn lại được thu thập trên bộ lọc bằng kẹp và chuyển sang hình nón 50 mL mới. 15 mL dung dịch phân hủy được làm ấm trước (1X HBSS với Ca+ và Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, cat # 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS002139] và 0,5 mg/mL Collagenase D [Millipore-Sigma, cat # 11088866001]) được thêm vào, lắc xoáy nhanh các mẫu và sau đó ủ trong 45 phút. ở 37 độ và lắc ở 150 vòng/phút hoặc cho đến khi dung dịch trở nên đục. Sau đó, các mẫu được lắc 3 lần và vortex trong 15 giây. Để thu thập các tế bào cLP miễn dịch còn lại, mô đã tiêu hóa sau đó được đổ qua bộ lọc 40 mM trên ống hình nón 50 mL chứa 10 mL 1X PBS. Tiếp theo, các mẫu được rửa sạch và lọc bằng 2 mL PBS 1X lạnh như đá và quay ở tốc độ 800 xg trong 10 phút ở 4 độ. Tiếp theo, phần nổi phía trên được loại bỏ và loại bỏ bằng chân không. Các tế bào sau đó được treo lại trong 500 ml RPMI hoàn chỉnh và được đếm bằng nhuộm loại trừ màu xanh lam Trypan.

tế bào học dòng chảy

Các bạch cầu phân lập từ cLP được nhuộm để xác định khả năng sống sót bằng cách sử dụng thuốc nhuộm zombie 510 (AmCyan) trong 10 phút ở RT trong bóng tối. Sau đó, các mẫu được chặn bằng CD{2}}/32 Thụ thể Fc trong 20 phút ở nhiệt độ 4 độ trong bóng tối. Sau khi quay ở tốc độ 367 xg trong 5 phút, các tế bào đã lọc được nhuộm trong 30 phút trong bóng tối ở 4 độ. Tất cả các kháng thể được sử dụng ở độ pha loãng 1:250 trừ khi có ghi chú khác. Bảng myleloid bao gồm CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (nội bào, 1:50). Tế bào T được phân biệt bằng: Thuốc nhuộm zombie 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (nội bào 1:50), IL{{ 50}}PE (nội bào 1:50), IFN-g (BV605) (nội bào 1:50), RORgt-PE610 (nội bào 1:50), IL-17A-BV785 (nội bào 1:50). Sau khi nhuộm, tế bào được rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch đệm cột (1X HBSS w/o Ca2+, Mg2+ và HEPES, EDTA, FBS). Các tế bào được cố định O/N với 2% PFA nếu không cần nhuộm nội bào và sau đó được rửa trong cột đệm 2X trước khi chạy trên máy đo tế bào dòng chảy. Nếu nhuộm nội bào là cần thiết, thì bộ đệm nhuộm FoxP3 / Transcription Factor (Tonbo Bioscatics) và giao thức sẽ được tuân theo. Sau đó, tất cả các mẫu được treo lại trong 300 ul dung dịch đệm cột và chạy trên BD LSR Fortessa sau khi bù bằng UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) và sử dụng các biện pháp kiểm soát vết bẩn đơn.

Vi khuẩn nhuộm IgA

Vi khuẩn được phân lập từ các viên phân bằng cách nghiền thành HBSS với Ca2+ và Mg2+, ở nồng độ 100 mg phân trên mỗi mL HBSS. Phân nghiền sau đó được quay ở tốc độ 50 xg trong 5 phút để loại bỏ các mảnh vụn lớn. Phần nổi phía trên được loại bỏ và đặt vào một ống mới. Sau đó nó được quay ở tốc độ 8000 xg trong 5 phút để tạo thành viên vi khuẩn. Phần nổi phía trên được loại bỏ và các viên được rửa trong HBSS với Ca2+ và Mg2+. Cuối cùng, các viên được phân tán lại trong HBSS ở nồng độ 100 mg/mL và 10uL trong số này được đặt vào một đĩa giếng 96-và được chặn bằng HBSS có chứa HBSS w/Ca2+ và Mg2+ 10% FBS trong 20 phút tại RT. Sau đó, 100uL kháng IgA (PE) được thêm trực tiếp vào mẫu và ủ trong 30 phút ở 4 C trong bóng tối. Sau đó, tế bào được rửa trong dung dịch HBSS+FBS 2x và cuối cùng được huyền phù lại trong HBSS{22}}x Sybr®-green và để ủ trong 20 phút trong bóng tối ở RT. Các mẫu sau đó được đọc trực tiếp trên máy đếm tế bào dòng chảy.

Phân lập tủy xương

Tủy xương được phân lập như mô tả trước đây. Tóm lại, xương dài từ động vật C57Bl/6 Wild hoặc Clec12a-/- được tách ra và làm sạch bằng khăn giấy bằng cách chà xát nhẹ. Xương sạch được giữ trên đá trong khi động vật được xử lý. Các đầu xương được cắt bớt một chút để lộ tủy. Xương được đưa vào (đầu lộ ra úp xuống) vào ống Eppendorf 0,5mL đã được đâm bằng kim 18g. Sau đó, ống Eppendorf 0,5mL này được đặt bên trong ống Eppendorf 1,5mL và quay ở tốc độ 13,000 x g trong 1 phút. Tách qua tủy xương sau đó được ly giải hồng cầu, sử dụng dung dịch đệm ly giải RBC (Biolegend) theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Sau khi ly giải hồng cầu, các tế bào được treo lại trong môi trường hoàn chỉnh Modified Eagle Medium (DMEM) của Dulbecco chứa: 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x axit amin không thiết yếu, Natri Pyruvate 1mM. Sau đó, các tế bào được quay ở tốc độ 367 xg trong năm phút để tạo thành các tế bào dạng viên. Các tế bào biệt lập sau đó được sử dụng để phát triển BMDM hoặc để phân lập thêm các tế bào đơn nhân.

Đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương

Bạch cầu được phân lập từ quá trình phân lập tủy xương, lơ lửng trong DMEM hoàn chỉnh và được đếm thông qua nhuộm loại trừ màu xanh lam trypan trên máy đo huyết cầu. Tế bào được đặt trên các đĩa 10 cm đã xử lý nuôi cấy mô ở nồng độ 5-8 x 106 tế bào/đĩa trong 10 mL môi trường hoàn chỉnh + M-CSF (20ng/mL). Phương tiện mới, bao gồm M-CSF, đã được thêm vào phương tiện hiện có vào ngày 4 và ngày 7. Các BMDM khác biệt hoàn toàn đã được sử dụng để sử dụng thử nghiệm giữa các ngày 7-9.

Phân lập bạch cầu đơn nhân

Tủy xương được thu hoạch từ động vật WT và Clec12a-/- như mô tả trước đây. Bạch cầu đơn nhân được phân lập bằng Bộ cách ly Monocyte (BM), chuột (Miltenyi Biotec) và cột LS MACS theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

F. đồng nuôi cấy BMDM của loài gặm nhấm và RNAseq

Nuôi cấy F. Rodentium được định lượng bằng OD 600nm (sử dụng 1 OD 600nm=1 x 10^8 tế bào/mL), rửa 2 lần trong PBS vô trùng và nuôi cấy đồng thời với BMDM biệt hóa hoàn toàn 1 x 106 tế bào/mL ở tốc độ MOI là 10 trong 6-đĩa nuôi cấy mô giếng. Sau 24 giờ đồng nuôi cấy, môi trường được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ -20 C cho đến khi sử dụng tiếp. BMDM được rửa bằng PBS lạnh, vô trùng, 2x. Thuốc thử ổn định RNA Qiazol (Qiagen cat# 79306), sau đó được thêm trực tiếp vào từng giếng. Các giếng được cạo bằng dụng cụ cạo tế bào được thu vào 1,5 ống Eppendorf và đông lạnh ở mức -20 cho đến khi chiết RNA. Quá trình chiết RNA được thực hiện bằng cách sử dụng bộ miniprep Direct-zol RNA (Zymo Research cat# R2070) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các thư viện giải trình tự đã được chuẩn bị bởi cơ sở lõi Genomics thông lượng cao của Viện Ung thư Huntsman. Tổng RNA lần đầu tiên được lai với bộ NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) để giảm bớt rRNA khỏi các mẫu. Các thư viện giải trình tự RNA bị mắc kẹt đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng Bộ công cụ chuẩn bị thư viện RNA định hướng NEBNext Ultra II cho Illumina (NEB, cat# E7760L). Các thư viện đã được tinh lọc đã đủ tiêu chuẩn trên Agilent Technologies 4150 TapeStation bằng cách sử dụng xét nghiệm D1000 ScreenTape (Agilent, cat# 5067-5582 và 5067-5583). Độ mol của các phân tử được biến đổi bộ chuyển đổi được xác định bằng phương pháp PCR định lượng bằng cách sử dụng Bộ định lượng thư viện Kapa Biosystems Kapa (Roche, cat#07960140001). Các thư viện riêng lẻ đã được chuẩn hóa thành 5 nM để chuẩn bị cho việc phân tích trình tự Illumina và được giải trình tự trên NovaSeq 6000 bằng cách chạy trình tự chu trình 150-cuối cặp.

Phân tích cytokine

BMDM được phân lập và phát triển như mô tả trước đây. BMDM biệt hóa hoàn toàn được đặt ở kích thước 1 x 105 tế bào/giếng trong 12-đĩa nuôi cấy mô giếng. BMDM được kích thích bằng LPS 100ng/mL; 1 ug/mL Pam3Cysk; hoặc 1ug/mL Flagellin. Tế bào được kích thích trong 24 giờ, môi trường được thu thập và lưu ở nhiệt độ -20 C để phân tích. Cytokine được phân tích bằng Bảng chống viêm chuột LEGENDplex™ (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm phân tích dữ liệu LEGENDplex™.

Giải trình tự gen rRNA thập niên 16

Các viên phân hoặc chất chứa trong hồi tràng được thu thập từ từng con chuột và được đông lạnh ngay lập tức ở nhiệt độ {{0}} trong ống nắp vặn 2mL chứa 250 mg hạt garnet 0,15 mm (MoBio, cat# {{5 }}). DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng Bộ cách ly DNA Power Fecal (MoBio hoặc QIAGEN), theo hướng dẫn của bộ sản phẩm và bao gồm 2 chu kỳ đập hạt trong 1 phút ở 4 độ trên Mini-Bead-Beater 16 (Sản phẩm BioSpec). Vùng V3 và V4 của gen 16S rRNA được khuếch đại bằng một vòng PCR duy nhất bằng cách sử dụng các đoạn mồi chứa (được mô tả từ 3' đến 5') trình tự nhắm mục tiêu gen 16S rRNA vùng V3/4, theo sau là một 2-đệm nucleotide bởi trình tự mồi Illumina, trình tự chỉ số nucleotide 8- và trình tự bộ chuyển đổi Illumina còn lại. Các chuỗi nhắm mục tiêu V3/{23}}S được lấy từ Takahashi (Takahashi và cộng sự, 2014) và các Chỉ số được lấy từ Kozich (Kozich và cộng sự, 2013). Các trình tự oligonucleotide đầy đủ được sử dụng là (các chỉ số được biểu thị bằng X): Prok16SV34_Dành cho: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Điều kiện chu trình PCR như sau: biến tính ban đầu 98 độ trong 2 phút; 26 chu kỳ biến tính 20 giây 98 độ, ủ 20 giây 51,5 độ, kéo dài 20 giây 72 độ; và một lần mở rộng 72 độ cuối cùng trong 2 phút. Mỗi PCR (được thực hiện ba lần cho mỗi mẫu) được thực hiện với thể tích 25 ul bằng cách sử dụng Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, cat# M0492L), 5 pmol của mỗi mồi và 50 ng DNA mẫu. Sau khi khuếch đại, PCR ba lần từ mỗi mẫu được gộp lại, 5 ul được chạy trên gel agarose để xác nhận độ khuếch đại và thể tích còn lại được làm sạch bằng cách sử dụng các hạt làm sạch PCR Axygen AxyPrep MAG (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53 }}) được pha loãng đến 62,5% trong nước để loại bỏ hiệu quả bất kỳ dimer mồi nào được ưu tiên sắp xếp trình tự. Các hạt pha loãng được thêm vào với thể tích gấp 1,8 lần thể tích phản ứng PCR, được làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các bộ khuếch đại đã được làm sạch được rửa giải bằng 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0. Sau đó, các bộ khuếch đại được định lượng bằng xét nghiệm DSDNA màu xanh lá cây pico (ThermoFisher, cat #P11495) trên đầu đọc vi bản, sau đó các thư viện giải trình tự riêng lẻ đã được làm sạch và lập chỉ mục sẽ được ghép kênh đồng đều (bởi ng DNA) và giải trình tự trên thiết bị Illumina MiSeq ở đầu ghép nối Chế độ chu kỳ 300 tại cơ sở tài nguyên chia sẻ gen thông lượng cao của Viện Ung thư Huntsman.

Tin sinh học xử lý dữ liệu trình tự

Việc đọc thô gen 16S rRNA được phân tách cho phép 0 không khớp trong các chỉ số, sau đó được xử lý và phân tích trong khung QIIME2 (Bolyen và cộng sự, 2019) như chúng tôi đã mô tả trước đây (Stephens và cộng sự, 2021). Tóm lại, các trình tự được tách kênh và lọc chất lượng trước tiên được cắt bớt các trình tự mồi và trình liên kết bằng plugin Cutadapt, sau đó được khử nhiễu bằng DADA2 (Callahan và cộng sự, 2016; Martin, 2011). Sau đó, các nguyên tắc phân loại được gán cho ASV bằng phương pháp phân loạisklearn trong plugin phân loại tính năng, dựa trên bộ tham chiếu GTDB (bản phát hành89) được cắt bớt theo vùng V3/4 được khuếch đại và được huấn luyện bằng phương pháp fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks và cộng sự, 2018; Pedregosa và cộng sự, 2011). Số liệu đa dạng, khoảng cách và ý nghĩa thống kê của các nhóm đa dạng beta theo permanova đã được tính toán trong QIIME2 (Anderson, 2001).

Đối với RNA-seq của BMDM, số lần đọc thô có chất lượng đầu tiên và được cắt bớt bộ chuyển đổi bằng cách sử dụng nhiều phần cắt, sau đó số lượng bản phiên mã được định lượng bằng cách sử dụng Salmon đối với bản phiên mã từ tổ hợp GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Định lượng cấp độ phiên mã được đọc vào R bằng cách sử dụng gói thời gian và tóm tắt thành số lượng cấp độ gen trước khi phân tích biểu hiện khác biệt với DESeq2 bằng cách sử dụng công thức thiết kế '~ Kiểu gen + Điều trị + Kiểu gen: Điều trị' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Các phản ứng khác biệt đối với F. Rodentium thể hiện sự khác biệt giữa phản ứng của mỗi kiểu gen đối với việc xử lý F. Rodentium sống trên các tế bào được điều trị bằng phương tiện kiểm soát. Các gen biểu hiện khác biệt đáng kể được xác định là các gen có giá trị p được điều chỉnh <0, 05 và thay đổi lần log2 > |0,58| (thay đổi lần 1,5). Sau đó, danh sách gen được điều chỉnh tăng và điều chỉnh giảm đáng kể được sử dụng để kiểm tra mức độ phong phú của các thuật ngữ bản thể gen (GO) bằng cách sử dụng gói clusterProfiler bao gồm chức năng đơn giản hóa để giảm sự dư thừa thuật ngữ GO và xác định các quá trình sinh học quan trọng (S, 2020; Wu et al ., 2021).

Thử thách DSS của loài gặm nhấm F.

F. Rodentium đã được trồng như mô tả trước đây và định lượng thành 1 x 1{15}}9 CFU/mL trong PBS vô trùng. F. Rodentium được cố định bằng cách rửa lần đầu tiên 2 lần trong PBS vô trùng và sau đó hòa lại trong 1mL Fomalin-PBS 10% trong 10 phút. Sau đó, tế bào được rửa thêm hai lần nữa trong 10mL PBS vô trùng để chuẩn bị cho qua đường miệng. Những tế bào không cố định được rửa sạch như tế bào cố định và giữ trong đá cho đến khi cho vào ống. Chuột WT C57BL/6 SPF được đo bằng đường uống với 100uL dung dịch chỉ chứa PBS (phương tiện), F. Rodentium (sống) hoặc F. Rodentium (cố định) từ ngày -3 đến ngày 10. Động vật được cho dùng 3,0% DSS vào ngày 0-7; nước DSS mới được thay thế mỗi ngày. Giới hạn mức độ nghiêm trọng của việc giảm cân lớn hơn 20% được áp dụng làm ngưỡng nghiêm trọng. Tại các điểm cuối thử nghiệm, MLN và dấu hai chấm đã bị xóa. Đại tràng được đo từ manh tràng đến trực tràng để xác định chiều dài. Các mô sau đó được xử lý để phân tích mô học, chiết xuất RNA hoặc phân tích tế bào học dòng chảy.

Xét nghiệm thực bào

Đại thực bào phúc mạc được phân lập bằng cách tiêm 5mL PBS vô trùng vào khoang phúc mạc. PBS được khuấy trộn nhẹ nhàng khi ở trong khoang cứ sau vài giây. Sau 2 phút, PBS được rút bằng kim cỡ 28 và phân phối vào DMEM lạnh hoàn chỉnh. Các tế bào được quay ở tốc độ 367 xg và được rửa trong môi trường hoàn chỉnh. Sau đó, các tế bào được đếm bằng máy đo huyết sắc tố và đặt vào các đĩa nuôi cấy mô 12-giếng ở nồng độ 2,5 x 105 tế bào/mL. Các tế bào được phép bám dính qua đêm. Ngày hôm sau, các giếng được trộn nhẹ nhàng bằng cách xoáy và môi trường được hút. Sau đó, các tế bào kết dính được rửa hai lần với 500uL PBS lạnh, vô trùng. DMEM hoàn chỉnh được làm ấm trước chứa F. Rodentium ở MOI 10 sau đó được thêm vào chất kết dính (đại thực bào). Sau đó, các đĩa được quay nhẹ ở tốc độ 200 xg, ở nhiệt độ phòng trong ba phút và sau đó được ủ trong điều kiện nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn (37 C, 5% CO2) trong 90 phút. F. Rodentium đã được điều chế như mô tả cho việc đồng nuôi cấy BMDM chỉ để giải trình tự RNA, sau khi rửa, các tế bào được huyền phù lại trong màu xanh lá cây Sybr® 1x (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), ở RT trong 20 phút. Các tế bào vi khuẩn sau đó được tạo thành viên ở tốc độ 4000 vòng / phút trong 5 phút được nối lại với DMEM hoàn chỉnh và được làm ấm trước cho các đại thực bào phúc mạc. Sau 90 phút đồng nuôi cấy, môi trường được hút và tế bào được rửa hai lần bằng PBS lạnh, vô trùng. Các tế bào kết dính chứa F. Rodentium được nhuộm màu xanh Sybr® được cố định bằng 2% paraformaldehyde (PFA) trong 10 phút. PFA được hút và PBS vô trùng được đặt vào tế bào. Sau đó, các tế bào được chụp ảnh để thực bào F. Rodentium

Phân tích hình ảnh đại thực bào

Hình ảnh trường sáng và huỳnh quang của môi trường nuôi cấy đại thực bào được xử lý bằng F. Rodentium được chụp bằng Hệ thống hình ảnh EVOS m7000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ba đến năm hình ảnh ngẫu nhiên riêng biệt được chụp cho mỗi nền văn hóa, được thực hiện ba lần.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

Cấu trúc protein tổng hợp CLEC12A-Fc athứ thanh lọcTRÊN

Các cDNA mã hóa các miền ngoại bào của chuột Clec12a được khuếch đại bằng PCR từ các tế bào bạch cầu phân lập từ tủy xương C57Bl/6 WT SPF và được xác nhận bằng cách giải trình tự. Các cDNA được kết hợp với đầu C của IgG1-Fc người trong vectơ biểu hiện pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Các cấu trúc chứa Clec12a hoặc vectơ trống được chuyển vào các tế bào Lx293 được nuôi cấy bằng DMEM +10% FBS và Pen/strep (1mg/mL). Các protein tổng hợp được tiết ra đã được thu hoạch từ môi trường 24-48 sau khi truyền máu. Môi trường được quay ở tốc độ 367 xg trong 5 phút để loại bỏ mảnh vụn/tế bào chết và chất nổi phía trên được đông lạnh ở nhiệt độ -20 C cho đến khi sử dụng. Các protein tổng hợp Clec12a-Fc hoặc chỉ chứa Fc được phân lập bằng Bộ công cụ IP/Co-IP từ tính Pierce™ Classic (Thermo Fisher Scientific, Số danh mục: 88804), được định lượng bằng Bộ xét nghiệm protein Pierce™ BCA (Số danh mục khoa học của Thermo Fisher: 23227) và được xác nhận bởi Western blot bằng kháng thể khángClec12a (Novus Bis NBP2-27346SS).

Xét nghiệm gắn kết Clec12a-Fc

Cấu trúc tinh khiết được pha loãng thành 0,4 mg/mL trong HBSS với Ca2+ và Mg2+. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường tương ứng và điều kiện hiếu khí và được chuẩn hóa bằng OD 600nm. Vi khuẩn được rửa bằng HBSS w/Ca2+ và Mg2+ và chặn bằng HBSS w/Ca2+ và Mg2+ +10% FBS trong 20 phút tại RT. Tất cả các quy trình nhuộm màu diễn ra trong điều kiện khí quyển. 1 x 107 tế bào vi khuẩn được đặt vào đĩa giếng 96-có đáy tròn, quay ở tốc độ 3,000 xg và gạn. 50uL cấu trúc được đặt lên tế bào vi khuẩn, trộn nhẹ nhàng và ủ ở 4 C trong 1 giờ. Tế bào vi khuẩn được rửa bằng HBSS w/Ca2+ và Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50uL Fc kháng người (PE) của dê (Danh mục khoa học sinh học số 12-4998-82) được thêm vào tế bào và ủ ở 4 C trong 1 giờ, trong bóng tối. Sau đó, tế bào được rửa như trước và đặt vào HBSS có chứa Ca2+ và Mg2+ chứa 1x xanh Sybr® (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Các tế bào được ủ ở RT trong 20 phút trong bóng tối và đọc ngay trên máy đo tế bào dòng chảy BD LSR Fortessa.

Chiếu xạ và phục hồi tủy xương

Tủy xương được thu hoạch từ động vật WT và Clec12a-/- như mô tả trước đây. Chuột nhận được chiếu xạ gây chết người với 500 Rad vào ngày -1, tiếp theo là 400 Rad vào ngày 0. Bốn giờ sau lần chiếu xạ cuối cùng, chuột nhận được gây mê bằng isoflurane và 100uL phân lập các tế bào tủy xương lơ lửng trong PBS vô trùng (1 x 10 tế bào/mL) được đưa qua kim cỡ 28,5 đến khoang sau quỹ đạo. Chúng tôi quan tâm đến hệ vi sinh vật nên động vật không được sử dụng kháng sinh và sau 8 tuần, các viên phân được thu thập để chuyển hệ vi sinh vật vào động vật GF.

NGƯỜI GIỚI THIỆU

Anderson, MJ (2001). Một phương pháp mới để phân tích phương sai đa biến phi tham số. Sinh thái Úc. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Bắt đầu, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015). Bộ gen tích hợp của biến thể nguy cơ bệnh Crohn

xác định vai trò của CLEC12A trong quá trình tự thực kháng khuẩn. Đại diện tế bào 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF và Artis, D. (2017). Điều chỉnh tình trạng viêm bằng tương tác microbiota với vật chủ. Nat. Miễn dịch. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA và Caporaso, JG (2018). Tối ưu hóa phân loại phân loại các chuỗi khuếch đại gen đánh dấu bằng plugin phân loại tính năng QIIME 2 ''sq2-. Hệ vi sinh vật 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., và những người khác. (2019). Khoa học dữ liệu hệ vi sinh vật có thể tái tạo, tương tác, có thể mở rộng và mở rộng bằng QIIME 2. Nat. Công nghệ sinh học. 37, 852-857. 10,1038/giây41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA và Whitehead, L. (2018). Lectin loại C trong khả năng miễn dịch và cân bằng nội môi. Nat. Linh mục Miễn dịch. 18, 374-389. 10,1038/giây41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., và Lawley, TD (2016). Nuôi cấy hệ vi sinh vật 'không thể nuôi cấy' của con người cho thấy các phân loại mới và sự hình thành bào tử rộng rãi. Thiên nhiên 533, 543-+. 10.1038/thiên nhiên17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., và những người khác. (2008). Một vai trò quan trọng đối với bệnh autophagy và gen autophagy Atg16l1 trong tế bào Paneth ruột của chuột và người. Thiên nhiên 456, 259-263. 10.1038/thiên nhiên07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA và Holmes, SP (2016). DADA2: Suy luận mẫu có độ phân giải cao từ dữ liệu khuếch đại Illumina. Nat. Phương pháp 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., và Garrett, WS (2022). Faecalibaculum Rodentium điều chỉnh tín hiệu axit retinoic để điều chỉnh cân bằng nội mô biểu mô ruột phụ thuộc bạch cầu ái toan. Vật chủ tế bào & vi khuẩn 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK và Kim, BC (2015). Gen Faecalibaculum Rodentium. tiểu thuyết, sp. nov., được phân lập từ phân của chuột thí nghiệm. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10,1007/giây10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., và những người khác. (2017). Một thành viên của mycobiota ruột điều chỉnh quá trình chuyển hóa purine của vật chủ làm trầm trọng thêm bệnh viêm đại tràng ở chuột. Khoa học. Dịch. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. và Chiffoleau, E. (2020). Các thụ thể giống lectin loại C: Đầu hoặc đuôi trong khả năng miễn dịch khi chết tế bào. Đằng trước. Miễn dịch. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., và Zoetendal, EG (2021). Sự ổn định và khả năng phục hồi của hệ vi sinh vật đường ruột: làm sáng tỏ phản ứng với những xáo trộn nhằm điều chỉnh sức khỏe đường ruột. Ruột 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. và Eliopoulos, AG (2014). Hệ vi sinh vật đường ruột trong mô hình chuột mắc bệnh viêm ruột. Những ranh giới trong vi sinh học tế bào và nhiễm trùng 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., và Cao, XT (2004). KLRL1, một thụ thể giống lectin của tế bào tiêu diệt mới, ức chế độc tế bào của tế bào tiêu diệt tự nhiên. Máu 104, 2858-2866. DOI 10.1182/máu-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Tương tác giữa nấm hội sinh và thụ thể lectin loại C Dectin-1 ảnh hưởng đến bệnh viêm đại tràng. Khoa học 336, 1314-1317. 10.1126/khoa học.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell & June L. Round (2015). Biến thể MHC tạo ra các cộng đồng vi khuẩn cá nhân kiểm soát tính nhạy cảm với nhiễm trùng đường ruột. Giao tiếp thiên nhiên. 0.1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. và Rock, KL (2010). Axit uric thúc đẩy phản ứng viêm cấp tính đối với sự chết tế bào vô trùng ở chuột. J. Lâm sàng. Đầu tư. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK và Schloss, PD (2013). Phát triển Chiến lược sắp xếp trình tự chỉ mục kép và quy trình quản lý để phân tích dữ liệu trình tự Amplicon trên Nền tảng trình tự MiSeq Illumina. Vi sinh vật ứng dụng và môi trường 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM và Round, JL (2015). Tín hiệu MyD88 trong tế bào T chỉ đạo việc kiểm soát hệ vi sinh vật qua trung gian IgA để tăng cường sức khỏe. Vi khuẩn chủ tế bào 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS và Ruland, J. (2019). Thụ thể tinh thể axit uric Clec12A có tác dụng tăng cường phản ứng interferon loại I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015). Các phân tích của hiệp hội xác định 38 cơ địa nhạy cảm đối với bệnh viêm ruột và nêu bật nguy cơ di truyền được chia sẻ giữa các quần thể. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. và Anders, S. (2014). Ước tính được kiểm duyệt về sự thay đổi và phân tán nếp gấp đối với dữ liệu RNA-seq với DESeq2. Bộ gen Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., và Patro, R. (2020). Tximeta: Tổng kiểm tra trình tự tham chiếu để xác định nguồn gốc trong RNA-seq. Sinh học tính toán Plos 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC và Casadevall, A. (2005). Kích hoạt thụ thể Fc và bổ thể kích thích sự phát triển chu kỳ tế bào của các tế bào đại thực bào từ G1 đến SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., và Zinkernagel, RM (2000). Một cơ chế độc lập với tế bào T nguyên thủy của phản ứng IgA niêm mạc ruột đối với vi khuẩn hội sinh. Khoa học 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH và Lepenies, B. (2014). Một nền tảng để sàng lọc các carbohydrate liên kết với thụ thể lectin loại C và tiềm năng của chúng trong việc nhắm mục tiêu cụ thể vào tế bào và điều chế miễn dịch. Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. và Brown, GD (2004). Xác định và mô tả đặc tính của một thụ thể giống lectin loại c ức chế Myeloid mới ở người (MICL) được biểu hiện chủ yếu trên bạch cầu hạt và bạch cầu đơn nhân. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt Loại bỏ các chuỗi bộ điều hợp khỏi các lần đọc trình tự thông lượng cao. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, và cộng sự. (2019). Cảm biến hệ vi sinh vật bằng trục Mincle-Syk trong tế bào đuôi gai điều chỉnh việc sản xuất Interleukin-17 và -22 và thúc đẩy tính toàn vẹn của hàng rào đường ruột. Miễn dịch 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Thị trưởng, A., Tardivel, A., và Tschopp, J. (2006). Các tinh thể axit uric liên quan đến bệnh gút kích hoạt dòng hồng cầu NALP3. Thiên nhiên 440, 237-241. 10.1038/thiên nhiên04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA điều chỉnh thành phần và chức năng trao đổi chất của hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách thúc đẩy sự cộng sinh giữa các vi khuẩn. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014). Clec12a là một thụ thể ức chế tinh thể axit uric điều chỉnh tình trạng viêm để đáp ứng với sự chết của tế bào. Miễn dịch 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et al. (2016). IgA đơn dòng có ái lực cao điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột và ngăn ngừa viêm đại tràng ở chuột. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O. và Slack, E. (2020). IgA và hệ vi sinh vật đường ruột: tầm quan trọng của tính đặc hiệu. Chất miễn dịch niêm mạc. 13, 12-21. 10,1038/giây41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, và Hugenholtz, P. (2018). Một hệ thống phân loại vi khuẩn được tiêu chuẩn hóa dựa trên bộ gen phát sinh loài đã sửa đổi đáng kể cây sự sống. Nat. Công nghệ sinh học. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA và Kingsford, C. (2017). Salmon cung cấp định lượng nhanh chóng và nhận biết sai lệch về biểu thức bảng điểm. Nat. Phương pháp 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Học máy bằng Python. J Mach Tìm hiểu Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR và Brown, GD (2008). Đặc tính của MICL ở chuột (CLEC12A) và bằng chứng về phối tử nội sinh. Euro. J. Miễn dịch. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). Thụ thể lectin loại C CLEC12A nhận ra hemozoin plasmodial và góp phần phát triển bệnh sốt rét não. Dân biểu Ô 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. và Dittel, BN (2015). Mối liên quan giữa rối loạn sinh lý ở hệ vi sinh vật đường ruột do suy giảm miễn dịch và sự xâm nhập của bệnh viêm đại tràng. Miễn dịch học 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, và những người khác. (2016). MICL kiểm soát tình trạng viêm trong viêm khớp dạng thấp. Ann. Thấp khớp. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.