Tế bào TH17 của con người tương tác với lỗ chân lông Gasdermin E để giải phóng IL-1 khi kích hoạt hồng cầu NLRP3
Nov 30, 2023
Người ta đã chứng minh rằng các phản ứng miễn dịch bẩm sinh có thể áp dụng các đặc tính thích nghi như trí nhớ. Liệu các tế bào T có sử dụng các con đường truyền tín hiệu miễn dịch bẩm sinh để đa dạng hóa các chức năng tác động của chúng hay không vẫn chưa được biết. Gasdermin E (GSDME) là một phân tử hình thành lỗ chân lông trên màng đã được chứng minh là có tác dụng gây chết tế bào pyroptotic và do đó đóng vai trò là điểm kiểm tra ung thư tiềm năng. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi chỉ ra rằng tế bào T của con người biểu hiện GSDME và thật ngạc nhiên là biểu hiện này có liên quan đến khả năng tồn tại lâu dài và được tái sử dụng để giải phóng chất báo động interleukin (IL)-1. Đặc tính này được giới hạn ở một tập hợp con của các tế bào T loại 17 trợ giúp của con người có tính đặc hiệu đối với Candida albicans và được điều chỉnh bởi một dòng hồng cầu NLRP3 nội tại của tế bào T và sự tham gia của nó vào dòng phân giải protein của caspase-8, caspase{{6 liên tiếp }}, và sự phân cắt GSDME sau khi kích thích thụ thể tế bào T và sự trưởng thành của calpain được canxi cấp phép ở dạng pro-IL-1. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng sự hình thành lỗ chân lông GSDME trong tế bào T là một cơ chế giải phóng cytokine độc đáo. Phát hiện này làm đa dạng sự hiểu biết của chúng ta về các tiết mục chức năng và thiết bị cơ học của tế bào T và có ý nghĩa đối với khả năng miễn dịch chống nấm.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Tế bào T trợ giúp (tế bào TH) là tác nhân quan trọng tạo ra phản ứng tác động đặc hiệu với kháng nguyên thông qua việc chúng tiết ra các cytokine riêng biệt. Đặc biệt, tế bào T loại 17 trợ giúp (tế bào TH17), được công nhận có chức năng kháng nấm thông qua việc tiết ra cytokine IL-17A đặc trưng của chúng, được điều chỉnh bởi thụ thể mồ côi liên quan đến yếu tố phiên mã RAR (ROR)- t1. Chúng cũng là thủ phạm chính trong cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn2. TH17 trước đây đã được công nhận là có tính không đồng nhất về chức năng3. Chức năng hỗ trợ hoặc chống viêm được phát huy thông qua sự cùng tồn tại khác biệt của IL-17 với interferon (IFN)- hoặc IL-10, tương ứng4–7. Nhìn chung, điều này đã định hình khái niệm về thuyết nhị nguyên tế bào TH17 và đã kích thích nghiên cứu các tín hiệu và mục tiêu phân tử kiểm soát sự phân đôi giữa hai kết quả chức năng của tế bào TH17 cho các ứng dụng điều trị3,4,8,9. Tuy nhiên, sự hiểu biết sâu sắc về danh tính và cơ sở cơ học của số phận tế bào TH17 gây bệnh và điều hòa miễn dịch vẫn còn khó nắm bắt. Các cơ chế tác động bổ sung chưa được tìm thấy vượt ra ngoài khả năng sản xuất IL{19}} cũng có thể hoạt động trong các tế bào TH17 với các đặc tính mục tiêu kháng nấm hoặc kháng khuẩn. Các cytokine IL-1, trong đó IL-1 và IL-1 đại diện cho các thành viên nổi bật nhất, gây ra tác dụng gây viêm sâu sắc. Khi được giải phóng khỏi các tế bào trình diện kháng nguyên (APC), chúng không chỉ gây ra phản ứng viêm nhanh chóng bẩm sinh mà còn điều phối khả năng miễn dịch thích nghi bằng cách thúc đẩy sự phân cực tế bào TH17 và khả năng gây bệnh của tế bào T khi liên kết với thụ thể IL{26}}R1 chung của chúng4,10,11 . Quá trình mồi tế bào TH17 độc lập IL{31}}, cũng đã được mô tả trước đây, dẫn đến việc sản xuất các tế bào TH17 chống viêm4. Do đó, IL-1 từ các nguồn tế bào bẩm sinh đóng vai trò là yếu tố chuyển đổi cho sự phân đôi giữa số phận tế bào TH17 kháng viêm và kháng viêm. Không giống như hầu hết các cytokine khác, các cytokine IL-1 thiếu peptide tín hiệu và do đó được tiết ra bởi cơ chế độc lập với lưới nội chất (ER) –Golgi.
Pro-IL-1 yêu cầu sự phân cắt bằng enzyme trước khi giải phóng vào không gian ngoại bào và sự tham gia của thụ thể của nó. Inflammasome NLRP3 là một phức hợp protein tế bào đa phân tử có chức năng tập hợp sự lây nhiễm của vi khuẩn và tổn thương tế bào, đồng thời huy động caspase-1 cho quá trình phân cắt pro-IL-1 tiếp theo12. Sự thoát ra IL-1 cũng yêu cầu sự phân cắt khí dermin D (GSDMD) qua trung gian caspase-1- và hình thành lỗ chân lông trong một quá trình gọi là pyroptosis, một dạng viêm của tế bào chết13,14. Mặt khác, IL-1 được cho là được xử lý độc lập với dòng siêu nhỏ NLRP3 thông qua các điểm kiểm tra quy định vẫn chưa được hiểu rõ10. Bất chấp những con đường hoàn toàn khác biệt này để trưởng thành và giải phóng IL-1 và IL-1, cả hai cytokine đều được sản xuất bởi các tế bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, cho thấy sự tồn tại của các loại tế bào chưa được xác định các tuyến đường đồng điều tiết. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi cho thấy rằng một tập hợp con tế bào TH17 của con người tham gia vào tầng tín hiệu phụ thuộc NLRP{21}}để tạo ra sự hình thành lỗ màng tế bào bởi GSDME, phục vụ quá trình giải phóng IL tiền viêm-1 tự tiết. Phát hiện này cho thấy một phương thức bài tiết cytokine độc đáo của tế bào T ở người và do đó làm đa dạng hóa các cơ chế và chức năng của tế bào T.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Kết quả
Sản xuất IL{0}} là đặc điểm của tế bào TH ở người
Để nghiên cứu tính không đồng nhất của tập hợp con tế bào TH17 ở người và để phát hiện các chức năng riêng biệt cũng như khả năng kiểm soát phân tử của chúng, chúng tôi đã thực hiện giải trình tự RNA đơn bào (scRNA-seq) của các tế bào TH17 đã hoạt hóa ở người, đã được phân lập ex vivo từ máu ngoại vi theo biểu hiện độc đáo của chúng về chất đánh dấu bề mặt thụ thể chemokine15. Phân tích thăm dò bằng phép xấp xỉ và phép chiếu đa dạng đồng nhất (UMAP) và phân cụm Leiden của tất cả các ô TH17 đã xác định sáu cụm riêng lẻ (Hình 1a). Một quần thể tế bào TH17 biểu hiện IL1A khác biệt và hiếm (6%) đã được làm giàu có chọn lọc trong cụm 1 (Hình 1a, b). So sánh tất cả các gen trong cụm 1 với tất cả các cụm khác cho thấy IL1A được điều chỉnh tăng đáng kể (Bảng bổ sung 1). Điều này thật bất ngờ vì IL{17}} không được coi là thuộc nhóm cytokine tác động chính tắc của tế bào T mà thay vào đó đại diện cho một tín hiệu nguy hiểm bẩm sinh16. Tuy nhiên, IL1A không nằm trong số các gen biểu hiện khác biệt (DEG) hàng đầu trong cụm 1, điều này đòi hỏi một chiến lược tìm kiếm sâu hơn để vạch trần sự điều hòa đáng kể của nó trong một quần thể tế bào TH17 (Hình bổ sung. 1). Ở cấp độ protein, các dòng vô tính tế bào TH17 cũng phân tách thành các dòng tế bào IL-1 + và IL-1 – T riêng biệt, do đó hỗ trợ tính không đồng nhất của biểu hiện protein IL-1 ở cấp độ đơn bào bên trong quần thể tế bào TH17 (Hình 1c). Để so sánh biểu hiện IL1A của tế bào TH17 với biểu hiện của các loại tế bào miễn dịch khác, đặc biệt là các nhà sản xuất IL-1 được báo cáo trước đây, chúng tôi đã thẩm vấn nhiều bộ dữ liệu scRNA-seq công khai về các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người (PBMC). Đáng ngạc nhiên, điều này không tiết lộ bất kỳ biểu hiện IL1A nào trong các loại tế bào miễn dịch khác nhau của PBMC đang nghỉ ngơi, bao gồm tế bào T, tế bào B, tế bào giết người tự nhiên (NK), tế bào NKT, bạch cầu đơn nhân và tế bào đuôi gai (Hình bổ sung 2a, b). Ngay cả các tế bào đơn nhân cũng không hiển thị bất kỳ biểu hiện IL1A nào ở cấp độ đơn bào, trừ khi một kích thích gây ra IL1A cụ thể, cụ thể là lipopolysacarit (LPS), được áp dụng cho các tế bào này (Hình bổ sung 2c, d), làm lộ ra khả năng sản xuất IL1A của chúng và mối liên quan giữa biểu hiện IL1A với phản ứng miễn dịch bẩm sinh gây viêm đang diễn ra (Hình bổ sung. 2e). Điều thú vị là việc so sánh phiên mã đơn bào của DEG giữa các tế bào IL1A+ và IL1A– từ tế bào TH17 so với tế bào đơn nhân cho thấy hầu như không có sự chồng chéo nào trong sự cùng tồn tại gen (IL1A và CCL3), điều này rất gợi ý về một chế độ điều hòa IL1A khác ở T tế bào so với bạch cầu đơn nhân (Hình 1d). Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy sự tồn tại của một quần thể con riêng biệt gồm các ô biểu hiện IL{54}}trong tập hợp con ô TH17.
Tập hợp con sản xuất IL{0}}của các tế bào TH17 có tính chất gây viêm
Để khám phá mối liên quan về mặt sinh lý của biểu hiện IL1A trong tế bào TH17 ở người, chúng tôi đã thực hiện so sánh phiên mã không thiên vị giữa các tế bào IL1A+ và IL1A– TH17 sau scRNA-seq. Phân tích làm giàu bộ gen (GSEA) đối với các gen cùng tồn tại với IL1A trong các tế bào TH17, cũng như phân tích làm giàu bằng cách sử dụng DEG, đã tiết lộ mối liên hệ nổi bật của IL1A với sự kích hoạt và tăng sinh tế bào T sau khi thẩm vấn khách quan tất cả các thuật ngữ bản thể gen có sẵn (GO) ( Hình 2a và Hình bổ sung 3). Phát hiện này đã thách thức vai trò được chỉ định trước đây của IL{12}} đối với quá trình lão hóa và chết tế bào trong bối cảnh mới của tế bào T17. Phân tích làm giàu cũng cho thấy sự biểu hiện quá mức đối với một số thuật ngữ GO liên quan đến 'viêm', cho thấy rằng biểu hiện IL1A của các tế bào TH17 đã góp phần tạo ra nhận dạng tế bào T gây bệnh có vai trò trong các bệnh viêm nhiễm (Hình 2a). Ý tưởng này được hỗ trợ bởi việc điều hòa lại các gen được chú thích bằng thuật ngữ GO 'phản ứng của tế bào với interleukin-1', xem xét tác động chuyển đổi tiền viêm đã được báo cáo trước đó của IL-1 đối với chức năng tổng thể của tế bào TH174 và tác dụng ức chế của autocrine IL-1 trên biểu thức IL-10 (Dữ liệu mở rộng Hình 1a–c). So sánh trực tiếp giữa các tế bào IL1A+ với IL1A– TH17 trên tất cả các cụm đã chứng minh rằng các tế bào IL1A+ TH17 hiển thị các dấu hiệu tiền viêm được tăng cường đáng kể nhưng làm giảm các dấu hiệu chống viêm (Hình 2b) 7. Hơn nữa, cụm 1, được làm giàu cho các tế bào IL1A+ TH17, đã được gây viêm nhiều hơn và ít chống viêm hơn đáng kể so với tất cả năm cụm còn lại, như được chỉ ra bởi GSEA (Hình 2b). Điều đáng quan tâm là việc so sánh phiên mã số lượng lớn các tập hợp tế bào TH17 kháng viêm và kháng viêm cho thấy IL1A thậm chí còn nằm trong số các gen được điều hòa hàng đầu trong tập hợp tế bào TH17 tiền viêm (Hình 2c, d và Hình dữ liệu mở rộng 2). Thay vào đó, IL10 được điều chỉnh ở mức độ thấp như mong đợi theo các báo cáo trước đó4,7. Mối tương quan qua lại giữa biểu hiện IL-1 và IL-10 của các tế bào TH17 cũng được quan sát ở mức độ protein bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (Hình 2e). Phân tích làm giàu với DEG đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của con đường KEGG (Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen ở Kyoto) đối với các bệnh tự miễn như 'viêm khớp dạng thấp' và 'bệnh viêm ruột' (Hình 2f), hỗ trợ tính chất tiền viêm của TH17 biểu hiện IL1A tập hợp con ô. Trên thực tế, những bệnh nhân mắc bệnh viêm khớp vô căn ở trẻ vị thành niên (JIA), một dạng viêm khớp dạng thấp gây viêm nặng ở trẻ em mà cơ chế bệnh sinh trước đây có liên quan đến IL-1 và IL-1 18 bẩm sinh, đã bộc lộ một cách đáng kể và rõ ràng. biểu hiện IL-1 tăng lên bởi các tế bào IL-17+ TH so với các tế bào IL-17+ TH từ máu đối chứng khỏe mạnh (Hình 2g). Thay vào đó, không thấy sự gia tăng IFN- trong các tế bào IL{66}} TH từ máu của bệnh nhân mắc JIA so với máu của người hiến đối chứng, mặc dù có mối liên quan được báo cáo trước đó giữa IFN- với khả năng gây bệnh của tế bào TH17 (Hình 2g, bảng bên phải) 4. Hơn nữa, phân tích dịch khớp phù hợp với máu cho thấy tần số rất cao của tế bào IL{72}} TH, cho thấy rằng tế bào T, ngoài tế bào bẩm sinh, cũng có thể đại diện cho nguồn tế bào có liên quan của IL{{74} liên quan đến bệnh tật. } tại vị trí viêm.
Lợi ích của cistanche tubulosa-tăng cường hệ thống miễn dịch
Biểu thức IL{0}} được điều chỉnh bởi chương trình TH17
Để tìm hiểu xem biểu thức IL-1 có phải là đặc tính chung của tế bào T hay không, chúng tôi đã làm phong phú các tập hợp con tế bào TH riêng lẻ từ PBMC theo biểu hiện khác biệt của thụ thể chemokine (Hình dữ liệu mở rộng 3) và so sánh IL-1 của chúng bài tiết. IL-1 được tạo ra cụ thể bởi tập hợp con ô TH17 chứ không phải tập hợp con ô TH1, tập hợp con ô TH2 hoặc ô T điều tiết (tế bào Treg) (Hình 3a tựa c). Điều đáng chú ý là mức độ bài tiết của nó khi được kích thích bằng kháng thể đơn dòng kháng CD3 và kháng CD28 phù hợp với mức độ bạch cầu đơn nhân của người được kích thích bằng LPS và nigericin, cho thấy rằng các tế bào TH17 của người, mặc dù có đặc tính miễn dịch thích nghi, đóng vai trò là nguồn chính của tín hiệu nguy hiểm IL. -1 (Hình 3a). Biểu hiện protein IL{15}} nội bào không có ở các tế bào TH đang nghỉ ngơi mới phân lập nhưng có thể kích hoạt được khi kích hoạt thụ thể tế bào T (TCR), với sự làm giàu đáng kể ở các tế bào TH17 so với các tế bào TH làm giàu tế bào TH1, TH2 và Treg (Hình 3b) ,c). Những phát hiện này dường như đặc trưng cho hệ thống miễn dịch của con người vì các báo cáo trước đây đã loại trừ việc sản xuất IL{21}} bởi tế bào T của chuột16. Sự liên kết duy nhất của IL{23}} với tập hợp con tế bào TH17 đã thôi thúc chúng tôi mổ xẻ một cách cơ học sự điều hòa của cytokine này. Điều thú vị là biểu hiện IL{25}} đã bị giảm do sự ức chế đặc hiệu của ROR-t, yếu tố phiên mã chính của tế bào TH17 (Hình 3d, e) 1. Những dữ liệu này phù hợp với sự hiện diện của các vị trí liên kết giả định cho ROR-t và ROR- trong vùng tăng cường và tăng cường IL1A (Dữ liệu mở rộng Hình 4a, b). Số phận của một tập hợp con tế bào TH cụ thể được xác định bởi vi môi trường cytokine phân cực rõ rệt trong quá trình kích thích tế bào T ngây thơ. Chúng tôi đã quan sát thấy sự biểu hiện và bài tiết nội bào cao nhất của IL-1 khi bắt đầu tế bào T ngây thơ trong điều kiện phân cực tế bào TH17 (IL-1 và yếu tố tăng trưởng biến đổi (TGF)- ) (Hình 3f, g). Tuy nhiên, các phương pháp điều trị đơn lẻ chỉ với IL{40}} hoặc TGF- không dẫn đến biểu hiện IL{42}} đáng kể ở các tế bào T ngây thơ, nhấn mạnh tác dụng hiệp đồng của các cytokine mồi tế bào TH17 tổ hợp lên quá trình cảm ứng mới của tế bào. IL-1 (Hình bổ sung 4). Ngược lại, các điều kiện mồi tế bào TH1 (IL-12) và TH2 (IL-4) không làm thay đổi đáng kể sự bài tiết IL-1 so với điều kiện được kích thích khi không có cytokine phân cực. Cùng với nhau, những phát hiện này chứng minh rằng các tế bào T ngây thơ có được khả năng sản xuất IL{53}} thông qua các cytokine phân cực tế bào TH17. Các tế bào TH bộ nhớ cũng hiển thị sự điều chỉnh tăng thêm đáng kể của cytokine tác động IL-1 của chúng trong môi trường vi mô IL-1 và TGF- (Hình 3h).
Hình 1|Một tập hợp con riêng biệt của các tế bào TH17 ở người có thể biểu hiện IL-1 .
Nhận dạng của các tập hợp tế bào TH cũng được đặc trưng bởi các đặc tính di chuyển riêng biệt, có liên quan đến sự biểu hiện khác biệt của các thụ thể chemokine20. Chúng tôi quan sát thấy rằng biểu hiện IL{1}} được làm phong phú trong các tế bào CCR6+ chứ không phải ở CCR6–T và bị giảm ở các tế bào CXCR3–T so với các tế bào CXCR3+ T, mặc dù không có sự khác biệt về Biểu thức IL-1 giữa các ô CCR4+ và CCR4– T (Hình 3i). Những dữ liệu này chứng minh rằng các ô tạo IL hiển thị mẫu di chuyển được chỉ định trước đó cho các ô tạo IL15. Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này cho thấy một cách nhất quán rằng IL{13}} là một chức năng duy nhất của tế bào TH17 ở người.
Hình 2|IL-1 sản xuất tế bào TH17 có tính chất tiền viêm
Hình 3|Việc sản xuất IL-1 của tế bào T bị hạn chế ở số phận tế bào TH17
Calpain là điều kiện tiên quyết để tế bào TH17 tiết IL{0}}
Để khám phá cơ chế bài tiết IL{0}}, chúng tôi đã xử lý tế bào TH17 bằng chất ức chế xuất khẩu protein brefeldin A (BFA) và nhận thấy rằng sự bài tiết IL-1 không bị ảnh hưởng, không giống như các cytokine thông thường, chẳng hạn như dưới dạng IL-17A (Hình dữ liệu mở rộng 5a–c). Điều này hỗ trợ sự tồn tại của một con đường độc đáo không phụ thuộc vào ER–Golgi để tiết IL-1 bởi tế bào T và phù hợp với các báo cáo trước đây về các loại tế bào bẩm sinh21,22. Một đặc tính duy nhất trước đây đã được gán cho IL-1 là sự định vị đồng thời của nó trong tế bào chất và màng sinh chất23. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào TH17, trái ngược với bạch cầu đơn nhân, không hiển thị IL{13}} gắn màng (Hình dữ liệu mở rộng 5d). Mặc dù cần phải phân tách pro-IL-1 để tạo ra IL-1 ngoại bào có hoạt tính sinh học, nhưng IL-1 được biết là được giải phóng thụ động khi tế bào chết và phát huy tiềm năng hoạt tính sinh học của nó sau khi liên kết với IL{ {19}}RI ở dạng không phân tách hoặc phân tách24. Để xác định xem pro-IL-1 có trải qua quá trình xử lý nội bào để tế bào T của con người giải phóng có kiểm soát hay không, chúng tôi đã đánh giá các dạng IL-1 có chiều dài đầy đủ và trưởng thành trong phần nổi phía trên của các tế bào TH17 đã hoạt hóa. Để loại trừ bất kỳ bạch cầu đơn nhân gây ô nhiễm nào là nguồn tiềm năng của IL-1 được tiết ra, chúng tôi đã tạo ra các dòng vô tính tế bào TH17 trong khoảng thời gian 2 tuần và mô phỏng lại chúng bằng kháng thể đơn dòng kháng CD3 và kháng CD28 trong 5 ngày nữa trước khi kiểm tra miễn dịch. Trong tất cả sáu dòng vô tính tế bào TH17 đã được thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy sự làm giàu ưu tiên của dạng IL-1 đã phân cắt trong chất nổi trên bề mặt nuôi cấy (Hình 4a). Ngược lại, các tế bào ly giải tế bào TH17 cho thấy sự làm giàu ưu tiên của dạng pro-IL-1 không được lọc, như mong đợi (Hình bổ sung 5a). Những kết quả này loại trừ sự giải phóng thụ động pro-IL-1 trong quá trình hoại tử tế bào như là phương thức thoát IL-1 mặc định trong tế bào T và thay vào đó, gợi ý rằng tế bào TH17 của con người phải sở hữu bộ máy phân tử cho pro-IL{{ 46}} để cho phép các tế bào T khả thi giải phóng ngoại bào có kiểm soát phân tử có hoạt tính sinh học mạnh này, trái ngược với các tế bào bẩm sinh (Hình bổ sung 5b). Tuy nhiên, điều này không loại trừ sự góp phần bổ sung của hoại tử tế bào T vào việc giải phóng dạng tiền hoạt tính sinh học của IL-1 (Hình bổ sung 5a). Quá trình xử lý Pro-IL-1 tại các vị trí phân cắt riêng biệt có thể được xúc tác bởi một số protease17,25,26. Calpain là một cysteine protease phụ thuộc vào canxi có thể tạo ra đoạn IL-1 p1726 trưởng thành mà chúng tôi đã xác định ở đây. Chúng tôi đã phát hiện hoạt động của calpain trong các tế bào TH17. Nó tăng lên khi kích hoạt với kháng thể đơn dòng chống CD3 và chống CD28 (Hình 4b). Sự bài tiết IL-1 của các tế bào TH17 phụ thuộc vào hoạt động calpain nội tại của tế bào T vì sự ức chế calpain dược lý làm giảm sự bài tiết IL-1 của các tế bào TH17 được kích hoạt vào không gian ngoại bào theo cách phụ thuộc vào liều (Hình 4c) . Tương ứng, sự ức chế calpain dẫn đến sự tích tụ nội bào của pro-IL-1 (Hình 4d). Để chứng thực sự phụ thuộc của sự bài tiết IL-1 vào calpain, chúng tôi cũng đã loại bỏ calpain về mặt di truyền trong các tế bào TH17 của con người bằng cách sử dụng các lặp lại palindromic ngắn xen kẽ xen kẽ thường xuyên (CRISPR) –Cas9. Điều này cho thấy vai trò của CAPN2, chứ không phải CAPN1, trong sự tiết IL{81}} của tế bào TH17 ở người (Hình 4e). Ngược lại, sự bài tiết IL-1 do bạch cầu đơn nhân gây ra bởi LPS-/nigericin không phụ thuộc vào calpain (Hình 4f). Những dữ liệu này phù hợp với biểu hiện ưu tiên của CAPN2 chứ không phải CAPN1 của các tập hợp tế bào T của con người, trái ngược với các tế bào đuôi gai, hiển thị kiểu biểu hiện gen calpain đảo ngược (Hình bổ sung 6). Sự tiết IL-1 trong tế bào TH17 tăng lên do tích lũy canxi nội bào và ức chế sarco-/ER Ca2+ ATPase với thapsigargin (Hình 4g) và giảm khi thải canxi ngoại bào bằng (ethylenebis(oxynitride) )tetra-acetate (EGTA) (Hình 4h), phù hợp với chức năng phụ thuộc canxi của calpain và sự bài tiết IL{100}} phụ thuộc TCR26. Cùng với nhau, những dữ liệu này đã chứng minh rằng hoạt động phân giải protein của calpain protease phụ thuộc canxi là điều kiện tiên quyết để tiết IL{103}} độc đáo bởi các tế bào TH17 của người được kích hoạt bằng TCR.
Sự tiết IL{0}} của tế bào TH17 được điều hòa bởi sự kích hoạt hồng cầu NLRP3
Mặc dù vai trò thiết yếu của calpain trong quá trình trưởng thành pro-IL-1, cơ chế dẫn đến sự thoát ra ngoại bào của IL-1 bị phân cắt vẫn chưa được biết rõ và do đó sẽ được giải quyết tiếp theo. Sự giải phóng IL-1 ngoại bào bởi các tế bào tủy trước đây có liên quan đến hoạt hóa hồng cầu NLRP3, hoạt động không gây enzyme của caspase-1 và giải phóng IL-1 16,27. Chúng tôi đã kiểm tra xem liệu tế bào TH17 của con người có sở hữu khung phân tử của hồng cầu NLRP3 hay không và nhận thấy biểu hiện protein của NLRP3 và phân tử tiếp hợp, protein giống đốm liên quan đến apoptosis có chứa CARD (ASC), trong tế bào TH17 của con người (Hình dữ liệu mở rộng 6a, b). Chúng tôi đã quan sát thấy quá trình kích hoạt hồng cầu đang diễn ra trong các tế bào TH17 được kích hoạt bằng TCR bằng cách xác định các đốm ASC bằng công nghệ ImageStream (Hình 5a, b) 28,29. Đáng chú ý là tần số tăng lên của các đốm ASC được giới hạn duy nhất trong tập hợp con ô TH17 (Hình 5b, bên trái). Các tế bào TH17 thậm chí còn gần giống với sự hình thành đốm ASC của các đại thực bào được kích thích bằng LPS- và ATP (Hình 5b, bên phải). Ngược lại, các tập hợp ô TH1 và TH2 hiển thị các mức thông số ASC nền (Hình 5b, bên trái). Hơn nữa, sự hình thành đốm ASC-speck và NLRP3-đã bị loại bỏ hoàn toàn khi có chất ức chế hồng cầu NLRP3 cụ thể MCC950, chứng minh sự tồn tại của quá trình kích hoạt hồng cầu NLRP3 đang diễn ra trong các tế bào TH17 (Hình 5b, bên trái và Hình dữ liệu mở rộng. 6c). Sự tham gia có chọn lọc của dòng tế bào NLRP3 bởi các tế bào TH17 được hỗ trợ thêm nhờ sự cảm ứng mạnh mẽ của các bản phiên mã NLRP3 đối với sự kích thích tế bào T với sự hiện diện của các cytokine phân cực tế bào TH17 IL-1 và TGF- (Hình 5c). Điều quan trọng là sự tiết IL{47}} của các tế bào TH17 đã giảm đáng kể do sự ức chế đặc hiệu của dòng hồng cầu NLRP3 với MCC950 (Hình 5d), do đó chứng tỏ vai trò quan trọng của dòng hồng cầu NLRP3 trong việc tiết IL-1 bởi tế bào TH17 của con người. Caspase-1 là protein tác động chính tắc trong phức hợp hồng cầu NLRP330. Chúng tôi đã quan sát thấy biểu hiện pro-caspase-1 trong các tế bào TH17 của con người đã được kích hoạt (Hình 5e). Tuy nhiên, trái ngược với những phát hiện về bạch cầu đơn nhân được kích thích bằng LPS và nigericin, không phát hiện thấy caspase{64}} bị phân cắt trong dung dịch ly giải tế bào TH17 ở người (Hình 5e). Quan sát này đã được chứng thực bằng việc không có nhuộm FLICA caspase{67}} trong các tế bào TH17 được kích thích khi có hoặc không có IL{69}} thúc đẩy các kích thích cytokine (Dữ liệu mở rộng Hình 7a–e). Chúng tôi tiếp tục loại trừ việc giải phóng caspase{71}} ngoại bào bằng ELISA sau khi kích thích tế bào TH17 bằng kháng thể đơn dòng chống CD3 và chống CD28 trong 5 ngày (Hình 5f). Ngay cả khi có sự hiện diện của IL-1 kích thích IL-1 , sự bài tiết caspase-1 vẫn không thể tạo ra được và vẫn ở mức thấp như khi các tế bào đơn nhân nghỉ ngơi (Hình 5f). Sự ức chế dược lý của caspase-1 bằng Ac-YVAD-CMK không làm giảm sự bài tiết IL-1 khi có hoặc không có sự cảm ứng IL-1 bởi IL-1 . Thay vào đó, chúng tôi quan sát thấy sự bài tiết IL-1 tăng nhẹ khi ức chế caspase-1 (Hình bổ sung 7a, b). Điều quan trọng là các tế bào TH17 không thể hiện bất kỳ sự thay đổi nào trong quá trình tiết IL-1 trên sự suy giảm được thiết kế của CRISPR–Cas9- đối với biểu thức CASP1 (Hình 5g). Do không có caspase hoạt tính sinh học-1, chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ sự tiết IL-1 nào của tế bào TH17 ở người. Điều này trái ngược với trường hợp ở tế bào đơn nhân, chứng tỏ sự tiết IL phụ thuộc caspase{101}} khi được kích thích bằng LPS và ATP (Hình dữ liệu mở rộng 7f). Hơn nữa, không có IL{103}} nội bào nào được phát hiện hoặc cảm ứng bởi các cytokine phân cực IL{104}}trong các tế bào TH17 hoặc các dòng vô tính tế bào TH17 hoặc có thể phát hiện được trong các tế bào TH17 đã kích hoạt bằng phân tích scRNA-seq (Hình dữ liệu mở rộng 7g,h, Tôi). Điều này trái ngược với phát hiện về bạch cầu đơn nhân, cùng tồn tại IL{110}} và IL-1 ở cấp độ đơn bào, phù hợp với mô hình điều hòa giả định và bài tiết được đề xuất trước đó của cả IL-1 cytokine (Dữ liệu mở rộng Hình 7g)16,27. Tổng hợp lại, những dữ liệu này chứng minh rằng tế bào TH17 của con người sản xuất IL-1 độc lập với caspase-1 và IL-1, không giống như bạch cầu đơn nhân và có lẽ là các tế bào miễn dịch bẩm sinh khác, mặc dù có sự tham gia rõ ràng của hồng cầu NLRP3.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
IL-1a thoát khỏi các ô TH17 thông qua các lỗ GSDME
Gasdermins thuộc họ các phân tử tác động hình thành lỗ chân lông được xác định gần đây, cho phép giải phóng các chất trung gian gây viêm31. Phân tích phiên mã của chúng tôi cho thấy sự điều hòa có chọn lọc biểu hiện GSDME trong tập hợp con tế bào TH17 được kích thích IL{2}}tiền viêm, nhưng không có sự điều chỉnh nào của bất kỳ thành viên nào khác trong họ gastrin (Hình 6a). Điều này thật đáng ngạc nhiên vì biểu hiện GSDME trước đây chưa bao giờ được báo cáo trong các tế bào T sơ cấp. Ngược lại, GSDMD, được biết là được điều chỉnh bởi dòng siêu nhỏ NLRP3 và là mục tiêu của caspase-1 (tham khảo 31), đã không được điều chỉnh, hỗ trợ cho ý tưởng về tín hiệu dòng siêu nhỏ NLRP3 không chuẩn. GSDME trước đây đã được chứng minh là hình thành các lỗ màng trong các tế bào miễn dịch bẩm sinh, có thể đóng vai trò là ống dẫn để giải phóng các chất báo động ngoại bào và bắt đầu quá trình chết tế bào pyroptotic tương tự như GSDMD32. Để kiểm tra sự liên kết của GSDME với tập hợp con tế bào TH17, chúng tôi đã đánh giá xem liệu các cytokine phân cực tế bào TH17 có điều hòa GSDME hay không. Chỉ sự kết hợp của TGF- với IL-1 (TH17), chứ không phải IL-12 (TH1) hoặc IL-4 (TH2), mới làm tăng mức độ phiên mã GSDME khi được đánh giá bằng phương pháp phiên mã ngược-định lượng PCR (RT–qPCR) (Hình 6b). Điều này được hỗ trợ bởi sự tồn tại của các vị trí liên kết giả định cho các yếu tố phiên mã liên quan đến tế bào TH17 ROR- và BATF (yếu tố phiên mã dây kéo leucine cơ bản, giống ATF) trong các vùng quảng bá của GSDME (Hình dữ liệu mở rộng 8a, b)33. Ngược lại, biểu hiện GSDMD không được điều chỉnh bởi các cytokine phân cực tế bào T (Hình bổ sung 8). Kết quả này thôi thúc chúng tôi đánh giá biểu hiện GSDME ở mức protein trong tế bào TH17 của con người. Biểu mẫu GSDME có thể được kích hoạt khi kích hoạt TCR. Việc tạo ra protein GSDME để đáp ứng với tín hiệu miễn dịch thích ứng này là điều không mong đợi, nhưng được hỗ trợ thêm bởi sự tồn tại của các vị trí liên kết giả định của các yếu tố phiên mã phản ứng tín hiệu TCR như NFAT, FOS, JUN và RELA trong các vùng quảng bá GSDME (Dữ liệu mở rộng Hình 8a) ,b). GSDME được biểu hiện sớm nhất là 24 giờ sau khi kích thích đa dòng. GSDME hình thành lỗ chân lông ở đầu N bị phân cắt có thể được phát hiện ở các thời điểm muộn, 3–4 d sau khi kích thích TCR của các tế bào TH17 (Hình 6c). GSDMD có chiều dài đầy đủ được tạo ra đồng thời khi kích hoạt tế bào T. Ngược lại, không quan sát thấy sự phân cắt GSDMD, như dự đoán do không có sự bài tiết caspase-1 và IL-1, khiến vai trò của GSDMD trong các tế bào TH17 được mở để phân tích thêm (Hình 6c). Tiếp theo, chúng tôi nhằm mục đích khám phá xem liệu các lỗ chân lông GSDME có đóng vai trò là ống dẫn cho việc giải phóng IL-1 ngoại bào trong các tế bào TH17 hay không. Do đó, chúng tôi đã loại bỏ GSDME bằng công nghệ CRISPR–Cas9 và theo dõi việc giải phóng IL-1 vào phần nổi phía trên theo thời gian bằng ELISA. Sự vắng mặt của GSDME, chứ không phải GSDMD, đã ức chế đáng kể việc giải phóng IL-1 bởi các tế bào TH17 (Hình 6d). Điều này chứng minh rõ ràng rằng sự hình thành lỗ chân lông GSDME đóng vai trò là cơ chế giải phóng IL-1 độc đáo bởi các tế bào TH17 của con người.
Hình 4|Calpain là điều kiện tiên quyết để tế bào TH17 của con người giải phóng IL{1}} đã bị cắt
Hình 5|Kích hoạt hồng cầu NLRP3 độc đáo điều chỉnh việc sản xuất IL-1 bởi tế bào TH17 của con người
Tầng phân tách caspase-8/3 GSDME cho phép bài tiết IL-1 phụ thuộc NLRP3-
Tiếp theo, chúng tôi đã khám phá khả năng xảy ra nhiễu xuyên âm cơ học giữa hoạt hóa hồng cầu NLRP3 và sự phân cắt GSDME trong tế bào TH17 của con người. Caspase-3 gần đây đã được chứng minh là có khả năng phân tách GSDME, do đó nó trở thành mục tiêu của caspase tương tác siêu nhỏ NLRP3-8 (tham khảo 34,35). Thật vậy, cả pro-caspase-8 và pro-caspase-3 đều được phát hiện trong các ô TH17. Chúng tôi thấy rằng sự phân tách của cả hai caspase xảy ra khi kích thích TCR và sự phân cắt GSDME trước đó (Hình 6e). Ngược lại, không phát hiện thấy sản phẩm phân tách nào của caspase-8 và caspase-3 trong bạch cầu đơn nhân được kích thích bằng nigericin và LPS (Hình 6e). Để xác định vai trò nguyên nhân của các caspase này trong quá trình phân cắt GSDME và bài tiết IL-1 của tế bào T, chúng tôi đã chặn hoạt động caspase-3 hoặc caspase-8 bằng chất ức chế Z-DEVD về mặt dược lý -FMK hoặc Z-IETD-FMK tương ứng. Việc ức chế hoạt động caspase-8 bằng Z-IETD-FMK đã loại bỏ sự phân tách của caspase mục tiêu xuôi dòng-3, phù hợp với các báo cáo trước đây về các loại tế bào khác36. Cả hai phương pháp điều trị đều làm giảm sự phân cắt GSDME đồng thời hủy bỏ sự bài tiết IL-1 (Hình 6f–i và Dữ liệu mở rộng Hình 9a, b). Thay vào đó, việc ức chế caspase-1 không ảnh hưởng đến sự phân tách caspase-3 hoặc GSDME (Hình bổ sung 9). Những dữ liệu này chứng minh rõ ràng rằng trục caspase-8–caspase-3–GSDME đang hoạt động trong các tế bào TH17 của con người khi kích hoạt TCR và nó điều chỉnh sự tiết IL-1 trong các tế bào này. Cuối cùng, để thiết lập mối liên hệ giữa tầng phân cắt phân giải protein này và dòng siêu nhỏ NLRP3, chúng tôi đã áp dụng MCC950 cho các tế bào TH17 được kích thích, điều này thực sự đã tạo ra sự giảm đáng kể về sự phân cắt caspase -3 và GSDME vào ngày thứ 5 (Hình 6f, g) và Dữ liệu mở rộng Hình 9c). Tuy nhiên, việc giảm sự phân tách caspase -8 ít rõ rệt hơn tại cùng thời điểm phân tích, phù hợp với cửa sổ thời gian kích hoạt trước đó của nó (Hình 6e, f). Tóm lại, sự ức chế có mục tiêu của từng tác nhân phân tử riêng lẻ đã thiết lập nên dòng thác NLRP3 inflammasome–caspase-8– caspase-3–GSDME như một con đường phân giải protein liên quan đến quá trình giải phóng IL có hoạt tính sinh học-1 ngoại bào của con người Tế bào TH17
Hình 6|Tầng phân tách NLRP3–casp8/3 dẫn đến các lỗ GSDME để phát hành IL-1
Các tế bào TH17 có khả năng phục hồi pyroptosis bất chấp lỗ chân lông GSDME
Sự hình thành lỗ chân lông Gasdermin trước đây có liên quan đến hiện tượng chết tế bào pyroptotic ở nhiều loại tế bào13,14,37. Chúng tôi đã tìm thấy biểu hiện của đơn vị N-GSDME hình thành lỗ chân lông bị phân cắt trong màng plasma chứ không phải cytosol, hỗ trợ chức năng hình thành lỗ chân lông của GSDME trong tế bào T (Hình 7a). Đáng ngạc nhiên, một so sánh phiên mã của các tế bào TH17 ở người thiếu GSDME-còn nguyên vẹn và CRISPR-Cas9 đã được chỉnh sửa gen, thiếu GSDME của GSEA đã loại trừ sự khác biệt trong các dạng chết tế bào khác nhau; tuy nhiên, đáng chú ý là nó tiết lộ rằng các quá trình và con đường bị ảnh hưởng trong các tế bào TH17 thiếu GSDME chủ yếu liên quan đến các gen kiểm soát sự vận chuyển xuyên màng, phù hợp với các ống dẫn hình thành lỗ chân lông được hình thành bởi N-GSDME (Hình 7b và Hình bổ sung 10) . Một so sánh phiên mã đơn bào của từng tế bào TH17 được chọn cho sự hiện diện so với sự vắng mặt của biểu hiện GSDME đã hỗ trợ khả năng tồn tại của các tế bào TH17 biểu hiện GSDME bằng cách làm giàu bộ gen của chúng để tăng sinh (Hình 7c). Cuối cùng, chúng tôi đã xác nhận khả năng phục hồi của các tế bào TH17 biểu hiện GSDME ở người đối với bệnh pyroptosis bằng cách chứng minh rằng không có bất kỳ sự khác biệt nào trong việc giải phóng lactate dehydrogenase (LDH) trên các tế bào TH17 được chỉnh sửa gen, thiếu GSDME và GSDME còn nguyên vẹn trên kích thích TCR (Hình 1). . 7d). Sau đó, chúng tôi so sánh các tế bào IL-1 + và IL-1 – TH17 về khả năng tồn tại và khả năng tăng sinh của chúng, vì các tế bào TH17 không hiển thị bất kỳ biểu hiện bề mặt IL-1 nào trái ngược với IL{{36 }}sản xuất các tế bào thuộc dòng tế bào khác, chẳng hạn như bạch cầu đơn nhân (Hình dữ liệu mở rộng 5d). Việc so sánh các tế bào IL-1 + và IL-1 – TH17 này đòi hỏi phải thiết lập một xét nghiệm bài tiết IL-1 -tự chế, cho phép phân lập các tế bào TH17 khả thi IL-1 + -bằng cách thu giữ các tế bào TH17 được tiết ra autocrine IL-1 lên bề mặt tế bào sau khi kích thích phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) và ionomycin. Không có sự khác biệt về hiệu quả nhân bản của các tế bào TH17 được gửi dưới dạng các ô đơn lẻ sau khi sắp xếp để tìm sự hiện diện hay vắng mặt của IL-1 bề mặt (Hình bổ sung 11). Phát hiện này đã loại trừ những khác biệt về khả năng tồn tại và mở rộng của các tế bào IL-1 + và IL-1 – TH17 ở cấp độ đơn bào. Chúng tôi tiếp tục nhân bản TH17 đã được sàng lọc, dựa trên mức độ biểu hiện IL-1 nội bào khác nhau và theo dõi hiệu quả nhân bản tương ứng của chúng. Nếu việc phát hành IL-1 hỗ trợ GSDME có liên quan đến tình trạng chết tế bào pyroptotic, thì mối tương quan nghịch giữa biểu hiện IL-1 trong các dòng vô tính tế bào T và tần suất phát triển các dòng vô tính trong quá trình tái bản riêng lẻ của chúng (hiệu suất nhân bản) là được mong đợi. Tuy nhiên, hiệu suất tái bản tế bào T không phụ thuộc vào mức biểu hiện IL{59}} trong các dòng vô tính tế bào TH17 và thay vào đó tương tự như hiệu suất của các dòng vô tính tế bào T đối chứng, được chọn trên cơ sở các mức biểu hiện khác nhau của IFN- khi không có IL-1 cùng tồn tại (Hình 7e). Điều quan trọng là các dòng vô tính tế bào IL-1 + TH17 tiếp tục biểu hiện lại IL-1 trong các chu kỳ tái kích thích TCR lặp đi lặp lại (Hình 7f). Do đó, việc mất các tế bào sản xuất IL{70}}có liên quan đến chết tế bào từ quần thể tế bào T vô tính tương ứng của chúng khi tái mô phỏng đã bị loại trừ. Đáng chú ý, phát hiện này cho thấy bộ nhớ cytokine của tế bào T dành cho IL{71}} cảm ứng. Chúng tôi đã thực hiện so sánh phiên mã giữa các tế bào IL-1 + và IL-1 – TH17 số lượng lớn và quan sát thấy mức độ phong phú thậm chí còn lớn hơn đối với các bộ gen tăng sinh trong IL-1 + so với IL-1 – tế bào TH17 nhân bản (Hình 7g). So sánh phiên mã đơn bào của các tế bào IL1A+ so với IL1A– TH17 đã chứng thực sự làm giàu phiên mã cho sự tăng sinh. Đây cũng là trường hợp so sánh cụm Leiden 1, được làm giàu cho các tế bào TH17 biểu hiện IL1A và các dấu hiệu viêm, với tất cả các cụm khác (Hình 7h). Các tế bào IL-1 + TH17 hiển thị biểu hiện Ki67 cao hơn theo phân tích tế bào học dòng chảy so với IL-1 của chúng – đối tác sau 5 ngày kích thích đa dòng (Hình 7i), một lần nữa ủng hộ ý tưởng rằng trong các tế bào TH17 của con người IL{ Lối ra {96}} không liên quan đến sự chết của tế bào, không giống như ở các tế bào bẩm sinh. Về tổng thể, những dữ liệu này loại trừ mối liên quan giữa việc sản xuất IL-1 với tình trạng chết tế bào (pyroptotic) ngay cả ở cấp độ đơn bào và chứng minh rằng tế bào T của con người có bộ nhớ cytokine để sản xuất IL-1 khi tái cấu trúc TCR lặp đi lặp lại .
IL có nguồn gốc từ tế bào T-1 góp phần bảo vệ vật chủ chống nấm
Phát hiện của chúng tôi rằng tế bào TH17 của con người tạo ra tín hiệu nguy hiểm bẩm sinh IL-1 và tái sử dụng bộ máy truyền tín hiệu bẩm sinh để giải phóng ngoại bào, làm mờ đi sự khác biệt giữa phản ứng miễn dịch thích nghi và miễn dịch bẩm sinh và do đó mở rộng danh mục chức năng tổng thể của tế bào T. Một tính năng quan trọng vẫn là đặc điểm của phản ứng bộ nhớ thích ứng là tính đặc hiệu của kháng nguyên TCR. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu khả năng sản xuất IL-1 của tế bào TH17 ở người có bị hạn chế ở các đặc tính kháng nguyên cụ thể hay không. Các tế bào TH17 trước đây đã được chứng minh là có mức độ phong phú cao trong các tế bào đặc hiệu cho kháng nguyên C. albicans và Staphylococcus Aureus15. Điều thú vị là chúng tôi đã quan sát thấy sự biểu hiện và bài tiết IL-1 lớn hơn đáng kể của C. albicans đặc hiệu so với các dòng vô tính tế bào TH17 đặc hiệu của S. Aureus (Hình 8a). Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra xem liệu các tế bào T ngây thơ nhận ra C. albicans chứ không phải S. vàng có được kháng nguyên cùng nguồn gốc của chúng tạo ra IL-1 một cách có chọn lọc hay không. Các tế bào TH ngây thơ (CD45RA+ CCR7+ ) TH được nuôi cấy bằng bạch cầu đơn nhân tự thân được truyền xung động với kháng nguyên C. albicans hoặc S. vàng bất hoạt bằng nhiệt hoặc được kích thích đa dòng bằng kháng thể đơn dòng kháng CD3 và kháng CD28, sau đó được nhân bản vào ngày thứ 7 với các tế bào trung chuyển đồng loại. Tất cả các dòng vô tính đã được mô phỏng lại vào ngày 14 với kháng thể đơn dòng kháng CD3 và kháng CD28 trong 5 ngày để xét nghiệm ELISA của chất nổi trên bề mặt của chúng. Điều đáng chú ý là chúng tôi phát hiện thấy rằng C. albicans, chứ không phải S. tụ vàng hoặc hoạt hóa TCR đa dòng, đã tạo ra sự sản sinh de novo IL{28}} trong các tế bào TH17 đang biệt hóa ở người (Hình 8b). Do đó, phương pháp kết hợp thu hồi ex vivo và mồi in vitro của chúng tôi chứng minh rằng khả năng sản xuất IL-1 chỉ giới hạn ở các tế bào T có tính đặc hiệu TCR đối với C. albicans. Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem khả năng đặc biệt của các tế bào TH17 đặc hiệu C. albicans trong việc tạo ra IL-1 có liên quan đến vai trò sinh lý trong việc bảo vệ vật chủ chống nấm hay không. Để làm điều này, chúng tôi đã nuôi cấy bạch cầu đơn nhân của con người bằng chất siêu nhiên từ tế bào TH17 của con người sau khi tái cấu trúc đa dòng của chúng bằng kháng thể đơn dòng chống CD3 và chống CD28 trong 5 ngày. Chúng tôi đã quan sát thấy khả năng thực bào của C. albicans được dán nhãn FITC tăng lên đáng kể bởi các tế bào đơn nhân bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Điều quan trọng là khả năng thực bào C. albicans tăng lên nhờ chất nổi trên bề mặt tế bào TH17 phụ thuộc vào IL-1 như được thể hiện bằng sự loại bỏ đáng kể quá trình thực bào của C. albicans nếu chất nổi trên bề mặt tế bào TH17 không có IL-1 sau khi hấp thụ miễn dịch hoặc CRISPR–Cas{ {46}}sự suy giảm IL{47}} được nhắm mục tiêu trong các ô TH17 (Hình 8c). Hình ảnh in vitro của tế bào sống đã chứng thực thêm về sự gia tăng hấp thu và loại bỏ C. albicans của bạch cầu đơn nhân với sự hiện diện của IL-1 -chứa chất nổi trên bề mặt tế bào TH17 (Hình 8d, dữ liệu video). Kết hợp lại với nhau, những phát hiện này cho thấy rõ ràng rằng các tế bào TH17 loại bỏ nhiễm trùng C. albicans không chỉ thông qua việc sản xuất IL-17, như đã nghĩ38 trước đây, mà còn, ở một mức độ đáng kể, thông qua khả năng của một tập hợp con tế bào TH17 duy nhất tạo ra IL-1 . Về tổng thể, các phát hiện xác định sự hình thành lỗ chân lông GSDME trong tế bào T như một chiến lược thoát khỏi IL-1 tiền viêm và sự điều chỉnh GSDME bằng trục inflammasome–caspase-8–caspase-3 NLRP3 tiết lộ một cơ chế mới chế độ bài tiết cytokine của tế bào T có liên quan đến một tập hợp con tiền viêm của tế bào TH17 có đặc tính kháng nấm TCR. Điều này cung cấp các mục tiêu điều trị mới để điều chế các tế bào TH17 ở người có liên quan đến việc bảo vệ vật chủ chống nấm và cũng có thể tham gia vào cơ chế bệnh sinh của các bệnh viêm mãn tính.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Cuộc thảo luận
Tóm lại, những phát hiện của chúng tôi tiết lộ một con đường sinh học chưa được biết đến trước đây và phương thức bài tiết cytokine trong tế bào T ở người giúp đa dạng hóa chức năng tổng thể của quần thể tế bào T. Chúng tôi thấy rằng biểu hiện IL-1 chỉ giới hạn ở số phận tế bào TH17, bằng chứng là nó cùng tồn tại với IL-17A, được điều chỉnh bởi ROR-t, cảm ứng bởi các cytokine mồi tế bào TH17 IL{{ 6}} và TGF- và bởi đặc tính biểu hiện thụ thể chemokine liên kết với tế bào TH17 của nó. Những phát hiện này phù hợp với sự tồn tại của các vị trí gắn kết với ROR-t và ROR- trong vùng quảng bá và tăng cường IL1Α như được mô tả trong nghiên cứu hiện tại và với các vị trí gắn kết ROR-t được báo cáo trước đó trong vùng quảng bá NLRP339. Chúng tôi quan sát thêm rằng các cytokine mồi tế bào TH17 làm tăng biểu hiện NLRP3 và GSDME. Theo đó, các bộ điều chỉnh chính về số phận tế bào TH17, chẳng hạn như ROR- và BATF, cũng như nhiều yếu tố phiên mã cảm ứng TCR, hiển thị các vị trí liên kết giả định trong vùng tăng cường GSDME. Do đó, sự phân cực tế bào TH17 không chỉ thúc đẩy biểu hiện IL{24}} mà còn cả sự thoát ra ngoại bào của nó (Dữ liệu mở rộng Hình 10, tóm tắt bằng đồ họa). Thật bất ngờ, chúng tôi nhận thấy dòng siêu nhỏ NLRP3 đang hoạt động và được tái sử dụng để phát hành IL-1 thay vì IL-1 trong các tế bào TH17 được kích hoạt bằng TCR. Không giống như các tế bào bẩm sinh, tế bào T không chuyên biệt cho khả năng cảm nhận mối nguy hiểm bẩm sinh, vốn được biết là có tác dụng kích hoạt sự lắp ráp các thành phần hồng cầu NLRP3. Tuy nhiên, độ cao của Ca2+ trong tế bào chất trước đây đã được chứng minh là có thể vượt qua tín hiệu nguy hiểm bẩm sinh để kích hoạt hồng cầu NLRP316,40. Điều này phù hợp với phát hiện của chúng tôi rằng hoạt hóa TCR, đi kèm với dòng canxi, là yêu cầu để tế bào TH17 của con người giải phóng IL{36}}. Chúng tôi quan sát thấy các tế bào TH17 tham gia vào một tầng tín hiệu xuôi dòng NLRP3 thay thế thông qua sự tham gia của caspase-8. Điều này có thể đã được tạo điều kiện thuận lợi do không có sự phân tách caspase-1 bởi vì việc tuyển dụng cực kỳ hấp dẫn caspase-1 so với caspase-8 đã được chứng minh trước đây34,41. Chúng tôi cũng tìm thấy pro-caspase-1 và GSDMD chưa được tách ra trong các tế bào TH17 của con người, nhưng không có bằng chứng nào cho thấy sự phân cắt được điều hòa bởi hồng cầu NLRP3 hoặc việc sản xuất IL-1 của chúng. Biểu hiện của tiền chất của chúng đặt ra câu hỏi liệu tín hiệu hồng cầu NLRP3 cổ điển và sự giải phóng IL{53}} cũng có thể hoạt động trong các tế bào TH17 của con người hay không nếu áp dụng các kích thích thay thế chưa được xác định. Điều này ngụ ý rằng các cơ chế điều hòa phụ thuộc caspase-8- so với caspase-1-có thể kiểm soát sự phân đôi giữa quá trình sản xuất IL-1 và IL-1 của các tế bào T, củng cố các vai trò được đề xuất trước đây đối với dòng siêu nhỏ NLRP3 trong việc giải phóng IL-1 trong tế bào TH1 của con người42 và tế bào TH17 của chuột43. Một quan sát hấp dẫn trong nghiên cứu của chúng tôi là việc xác định biểu hiện và sự phân cắt GSDME trong các tế bào T. Điều này tiết lộ rằng sự tiết cytokine độc đáo qua các lỗ trên màng có thể xảy ra ở tế bào T. Một số chức năng gần đây được giao cho GSDME có liên quan đến chứng pyroptosis và sau đó làm tăng tình trạng chết tế bào khối u và môi trường vi mô gây viêm32,44. Đáng ngạc nhiên là chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào TH17 biểu hiện GSDME thay vào đó lại hiển thị khả năng tồn tại được bảo tồn và tiếp tục tăng sinh khi kích thích TCR lặp đi lặp lại so với các tế bào T thiếu GSDME. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy đối với IL-1 + so với IL-1 – tế bào T. Những phát hiện này thật bất ngờ, vì việc sản xuất IL{75}} cho đến nay vẫn được coi là dấu hiệu đặc trưng của sự lão hóa và do đó của các tế bào bị ngừng sao chép hoặc sắp chết45. Điều này gợi lên ý tưởng rằng tín hiệu nguy hiểm IL-1 có thể là một phần của bộ nhớ cytokine liên quan đến tế bào T có thể tái kích thích khi nhận dạng kháng nguyên cùng nguồn gốc46. Hơn nữa, các lỗ GSDME có thể phục vụ chức năng sinh lý để cho phép các tế bào TH17 giải phóng thêm các phân tử chưa được xác định ngoài IL-1 được xác định bởi kích thước hoặc điện tích của chúng47. Điều này sẽ nhất quán với kết quả so sánh phiên mã không thiên vị của chúng tôi về các tế bào TH17 thiếu GSDME hoặc GSDME nguyên vẹn hoặc CRISPR–Cas{88}}được thiết kế, thiếu GSDME, cho thấy nhiều vai trò của GSDME trong vận chuyển xuyên màng nhưng không làm chết tế bào. Cơ chế giúp duy trì khả năng tồn tại và bộ nhớ cytokine IL-1 dài hạn trong tế bào T có lỗ chân lông GSDME, vẫn còn được khám phá trong tương lai. Sự sẵn có của IL-1 từ các nguồn tế bào khác nhau, đặc biệt là từ các APC bẩm sinh, đặt ra câu hỏi về sự đóng góp tương đối của IL{95}} có nguồn gốc từ tế bào T đối với sức khỏe và bệnh tật của con người. Mặc dù tế bào T IL-1 + chỉ cấu thành một tập hợp con nhỏ trong dòng tế bào T, nhưng khả năng sản xuất IL-1 của chúng có thể so sánh về mặt định lượng với khả năng của các tế bào đơn nhân được kích thích bằng LPS, hỗ trợ cho khái niệm mới rằng tế bào T có thể phục vụ là nguồn gây viêm IL-1 có liên quan. Phát hiện của chúng tôi từ các phân tích phiên mã và chức năng cho thấy IL{100}} có liên quan đến số phận tiền viêm của tế bào TH17. Tiểu quần thể IL{102}} của tế bào TH17 ở người biểu hiện các dấu hiệu phiên mã về khả năng gây bệnh viêm tăng cường và mối liên quan với các bệnh viêm mãn tính. Sự biểu hiện IL{104}} được tăng cường đáng kể bằng cách tuần hoàn các tế bào TH17 từ bệnh nhân mắc JIA và sự định vị dồi dào của chúng trong dịch khớp bị viêm hỗ trợ khả năng gây bệnh này của tập hợp con IL{106}} của các tế bào TH17. Mối quan hệ nhân quả chặt chẽ giữa IL{108}sản sinh tế bào TH17 và cơ chế bệnh sinh của JIA vẫn chưa được thiết lập và tác động tương đối của tế bào IL{110}} TH17 đã được xác nhận trong các thử nghiệm lâm sàng trong tương lai. Một quan sát đáng chú ý là việc sản xuất IL{112}} của tế bào T được quy định chặt chẽ thông qua tính đặc hiệu TCR của chúng. Mặc dù việc sản xuất IL-1 bởi các nguồn tế bào bẩm sinh được kích hoạt bởi các kích thích căng thẳng không đặc hiệu16, nhưng chúng tôi nhận thấy việc sản xuất IL-1 bởi các tế bào TH17 của con người có liên quan đến tính đặc hiệu TCR đối với C. albicans. Thay vào đó, các tế bào TH17 dành riêng cho S. Aureus cho thấy khả năng sản xuất IL{120}} giảm đáng kể. Những phát hiện này phù hợp với yêu cầu khác biệt của IL{121}} đối với việc tạo ra C. albicans- nhưng không phù hợp với các tế bào TH17 đặc hiệu của S. Aureus như đã báo cáo trước đây4 và theo đó, với vai trò quan trọng của IL{{126} } để tạo ra biểu thức IL{127}}, như đã báo cáo ở đây. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy sự bài tiết IL{128}} phụ thuộc vào sự kích thích TCR và tín hiệu canxi, nhấn mạnh mối liên hệ chặt chẽ của nó với tín hiệu miễn dịch thích ứng cụ thể thông qua TCR. Các tế bào TH17 được biết đến là nhân vật chính trong việc loại bỏ nhiễm trùng C. albicans thông qua việc chúng tiết ra IL-17, được minh họa bằng chứng rối loạn sinh lý C. albicans trong bối cảnh thiếu hụt IL{131}} về mặt di truyền hoặc điều trị38. Chúng tôi nhận thấy sản phẩm tế bào TH17 IL{134}} có liên quan đến quá trình thanh thải C. albicans vì sự vắng mặt của nó trong chất nổi trên bề mặt tế bào TH17 làm giảm đáng kể quá trình thực bào C. albicans bởi bạch cầu đơn nhân. Điều này cho thấy rằng chức năng tác động của tế bào TH17 chống nấm được thực hiện không chỉ thông qua IL{137}}A/F như đã đề xuất trước đây mà còn thông qua IL{138}} theo cách dành riêng cho TCR. Do đó, liệu sự điều chỉnh bất thường của con đường phân tử dẫn đến việc sản xuất IL{140}} bởi các tế bào TH17 có thể dẫn đến khả năng bảo vệ vật chủ chống nấm bị tổn hại hay không sẽ cần phải được kiểm tra trong tương lai. Nói chung, những phát hiện của chúng tôi mở đường cho một cuộc điều tra có hệ thống về sự đóng góp của IL{142}}sản xuất tế bào TH17 trong các bệnh viêm nhiễm khác nhau và khả năng bảo vệ vật chủ chống nấm. Trục TCR–NLRP3 inflammasome–caspase-8–caspase-3–GSDME không chỉ đại diện cho một chế độ truyền tín hiệu miễn dịch và chỉ dẫn số phận bị bỏ qua trước đây trong các tế bào TH mà còn cung cấp các mục tiêu phân tử để phá vỡ tế bào TH17 gây bệnh danh tính hoặc khai thác nó để bảo vệ máy chủ.
Hình 7|Các tế bào TH17 có khả năng phục hồi pyroptosis mặc dù có lỗ chân lông trên màng huyết tương GSDME.
Hình 8|Tính đặc hiệu của TCR kiểm soát việc sản xuất IL-1 góp phần làm sạch C. albicans
Người giới thiệu
1. Ivanov, II và cộng sự. Thụ thể hạt nhân mồ côi RORgammat chỉ đạo chương trình biệt hóa của các tế bào trợ giúp IL{1}} T tiền viêm. Phòng 126, 1121–1133 (2006).
2. Zwicky, P., Unger, S. & Becher, B. Nhắm mục tiêu interleukin-17 trong bệnh viêm mãn tính: góc nhìn lâm sàng. J. Exp. Med. 217, e20191123 (2020).
3. Stockinger, B. & Omenetti, S. Bản chất phân đôi của 17 tế bào T trợ giúp. Nat. Linh mục Miễn dịch. 17, 535–544 (2017).
4. Zielinski, CE và cộng sự. Các tế bào TH17 ở người do mầm bệnh tạo ra IFN-gamma hoặc IL-10 và được điều chỉnh bởi IL-1beta. Thiên nhiên 484, 514–518 (2012).
5. Ghoreschi, K. và cộng sự. Tạo ra các tế bào TH17 gây bệnh khi không có tín hiệu TGF-beta. Thiên nhiên 467, 967–971 (2010).
6. Noster, R. và cộng sự. Rối loạn điều hòa chức năng tế bào TH17 tiền viêm và chống viêm ở người trong hội chứng Schnitzler tự viêm. J. Phòng khám dị ứng. Miễn dịch. 138, 1161–1169.e1166 (2016).
7. Aschenbrenner, D. và cộng sự. Một chương trình điều hòa miễn dịch và lưu trú mô được điều chế bởi c-MAF trong tế bào TH17 của con người. Nat. Miễn dịch. 19, 1126–1136 (2018).
8. Wu, C. và cộng sự. Cảm ứng tế bào TH17 gây bệnh bằng kinase SGK1 cảm ứng muối. Bản chất 496, 513–517 (2013).
9. Matthias, J. và cộng sự. Muối tạo ra các tế bào Th17 chống viêm nhưng khuếch đại khả năng gây bệnh trong môi trường vi mô cytokine tiền viêm. J. Lâm sàng. Đầu tư. 130, 4587–4600 (2020).
10. Cavalli, G. và cộng sự. Interleukin 1alpha: đánh giá toàn diện về vai trò của IL{2}}alpha trong sinh bệnh học và điều trị các bệnh viêm và tự miễn dịch. Tự miễn dịch. Bản sửa đổi ngày 20, 102763 (2021).
11. Acosta-Rodriguez, EV, Napolitani, G., Lanzavecchia, A. & Sallusto, F. Interleukins 1beta và 6 nhưng không biến đổi yếu tố tăng trưởng-beta là cần thiết cho sự biệt hóa của interleukin 17-sản xuất tế bào trợ giúp T của con người . Nat. Miễn dịch. 8, 942–949 (2007).
12. Latz, E., Xiao, TS & Stutz, A. Kích hoạt và điều chỉnh các dòng siêu nhỏ. Nat. Linh mục Miễn dịch. 13, 397–411 (2013).
13. Shi, J. và cộng sự. Sự phân tách GSDMD bằng các caspase gây viêm quyết định sự chết của tế bào pyroptotic. Thiên nhiên 526, 660–665 (2015).
14. Liu, X. và cộng sự. Khí dermin D được kích hoạt bằng Inflammasome gây ra bệnh pyroptosis bằng cách hình thành các lỗ trên màng. Thiên nhiên 535, 153–158 (2016).
15. Acosta-Rodriguez, EV và cộng sự. Kiểu hình bề mặt và tính đặc hiệu kháng nguyên của interleukin người 17-sản xuất tế bào trí nhớ T trợ giúp. Nat. Miễn dịch. 8, 639–646 (2007).
16. Gross, O. và cộng sự. Các chất kích hoạt hồng cầu gây ra sự bài tiết interleukin- 1alpha thông qua các con đường riêng biệt với các yêu cầu khác nhau đối với chức năng protease của caspase-1. Miễn dịch 36, 388–400 (2012).
17. Malik, A. & Kanneganti, TD Chức năng và quy định của IL{1}}alpha trong các bệnh viêm nhiễm và ung thư. Miễn dịch. Rev. 281, 124–137 (2018).
18. Cimaz, R. Viêm khớp vô căn ở trẻ vị thành niên khởi phát toàn thân. Tự miễn dịch. Bản sửa đổi 15, 931–934 (2016).
19. Fong, KY, Boey, ML, Koh, WH & Feng, PH Nồng độ Cytokine trong dịch khớp và huyết tương của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp: mối tương quan với sự xói mòn xương. Phòng khám. Exp. Thấp khớp. 12, 55–58 (1994).
20. Eyerich, S. & Zielinski, CE Xác định các tập hợp tế bào Th theo cách cổ điển và dành riêng cho mô: ví dụ từ da. Euro. J. Miễn dịch. 44, 3475–3483 (2014).
21. Monteleone, M., Stow, JL & Schroder, K. Cơ chế bài tiết độc đáo của các cytokine họ IL-1. Cytokine 74, 213–218 (2015).
22. Keller, M., Ruegg, A., Werner, S. & Beer, HD Active caspase-1 là chất điều hòa sự bài tiết protein độc đáo. Phòng 132, 818–831 (2008).
23. Kurt-Jones, EA, Beller, DI, Mizel, SB & Unanue, ER Xác định interleukin 1 liên quan đến màng trong đại thực bào. Proc. Học viện Natl. Khoa học. Hoa Kỳ 82, 1204–1208 (1985).
24. Mosley, B. và cộng sự. Thụ thể interleukin-1 liên kết với tiền chất alpha interleukin-1 của con người nhưng không liên kết với tiền chất beta interleukin-1. J. Biol. Chem. 262, 2941–2944 (1987).
25. Carruth, LM, Demczuk, S. & Mizel, SB Sự tham gia của protease giống calpain trong quá trình xử lý tiền chất interleukin 1alpha của chuột. J. Biol. Chem. 266, 12162–12167 (1991).
26. Kobayashi, Y. và cộng sự. Xác định protease trung tính được kích hoạt bằng canxi là enzyme xử lý interleukin 1 alpha của con người. Proc. Học viện Natl. Khoa học. Hoa Kỳ 87, 5548–5552 (1990).
27. Fettelschoss, A. và cộng sự. Kích hoạt hồng cầu và IL{1}}beta nhắm mục tiêu IL-1alpha để bài tiết thay vì biểu hiện bề mặt. Proc. Học viện Natl. Khoa học. Hoa Kỳ 108, 18055–18060 (2011).
28. Franklin, BS, Latz, E. & Schmidt, FI Chức năng nội và ngoại bào của các đốm ASC. Miễn dịch. Rev. 281, 74–87 (2018).
29. Nagar, A., DeMarco, RA & Harton, JA Inflammasome và caspase-1 mô tả và đánh giá hoạt động: phát hiện và đánh giá dựa trên máy đo tế bào dòng chảy hình ảnh về các đốm hồng cầu và kích hoạt caspase-1. J. Miễn dịch. 202, 1003–1015 (2019).
30. Các phức hợp Rathinam, VA & Fitzgerald, KA Inflammasome: các cơ chế và chức năng tác động mới nổi. Ô 165, 792–800 (2016).
31. Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. Kẻ chủ mưu là một họ protein thực hiện quá trình chết tế bào và viêm. Nat. Linh mục Miễn dịch. 20, 143–157 (2020).
32. Zhang, Z. và cộng sự. Gasdermin E ngăn chặn sự phát triển của khối u bằng cách kích hoạt khả năng miễn dịch chống khối u. Thiên nhiên 579, 415–420 (2020).
33. Schraml, BU và cộng sự. Yếu tố phiên mã AP-1 BATF kiểm soát sự khác biệt TH17. Thiên nhiên 460, 405–409 (2009).
34. Antonopoulos, C. và cộng sự. Caspase-8 đóng vai trò là tác nhân tác động và điều chỉnh tín hiệu hồng ngoại NLRP3. J. Biol. Chem. 290, 20167–20184 (2015).
35. Vajjhala, PR và cộng sự. Bộ điều hợp gây sốt ASC tạo ra các sợi miền hiệu ứng tử vong Procaspase-8. J. Biol. Chem. 290, 29217–29230 (2015).
36. Stennicke, HR và cộng sự. Pro-caspase-3 là mục tiêu sinh lý chính của caspase-8. J. Biol. Chem. 273, 27084–27090 (1998).
37. Đặng, W. và cộng sự. Liên cầu ngoại độc tố gây sốt B phân cắt GSDMA và gây ra bệnh pyroptosis. Bản chất 602, 496–502 (2022).
38. Puel, A. và cộng sự. Bệnh nấm candida da niêm mạc mãn tính ở người có khiếm khuyết bẩm sinh về khả năng miễn dịch interleukin-17. Khoa học 332, 65–68 (2011).
39. Billon, C., Murray, MH, Avdagic, A. & Burris, TP RORgamma quy định về hồng cầu NLRP3. J. Biol. Chem. 294, 10–19 (2019).
40. Lee, GS và cộng sự. Thụ thể cảm nhận canxi điều chỉnh dòng hồng cầu NLRP3 thông qua Ca2+ và cAMP. Bản chất 492, 123–127 (2012).
41. Gao, Y. và cộng sự. Hồ sơ phiên mã xác định caspase-1 là chất điều hòa nội tại tế bào T của sự biệt hóa Th17. J. Exp. Med. 217, e20190476 (2020).
42. Arbore, G. và cộng sự. Khả năng miễn dịch của người trợ giúp T 1 yêu cầu hoạt động hồng cầu NLRP3 được điều khiển bổ sung trong tế bào T CD4+. Khoa học 352, aad1210 (2016).
43. Martin, BN và cộng sự. ASC nội tại tế bào T thúc đẩy nghiêm trọng bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm qua trung gian TH17-. Nat. Miễn dịch. 17, 583–592 (2016).
44. Wang, Y. và cộng sự. Thuốc hóa trị gây ra bệnh pyroptosis thông qua sự phân tách caspase-3 của kẻ chủ mưu. Thiên nhiên 547, 99–103 (2017).
45. Wiggins, KA và cộng sự. Sự phân cắt IL-1 bởi các dòng viêm của dòng siêu nhỏ không chính tắc kiểm soát kiểu hình bài tiết liên quan đến tuổi già. Tế bào lão hóa 18, e12946–e12946 (2019).
46. Helmstetter, C. và cộng sự. Các tế bào trợ giúp T riêng lẻ có bộ nhớ cytokine định lượng. Miễn dịch 42, 108–122 (2015).
47. Xia, S. và cộng sự. Cấu trúc lỗ chân lông Gasdermin D cho thấy sự giải phóng ưu tiên của interleukin trưởng thành-1. Bản chất 593, 607–611 (2021).
