Khám phá và xác định các thành phần hoạt động kháng melanogenic tiềm năng của Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 và Hongjiang Chen1,2 *

trừu tượng

Tiểu sử:Bletilla striata là loại thuốc chính của nhiều công thức làm trắng da cổ điển trong y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) và được sử dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm gần đây. Tuy nhiên, các thành phần hoạt tính của nó vẫn chưa rõ ràng và rễ xơ không được sử dụng hiệu quả. Mục đích của nghiên cứu hiện tại là khám phá và xác định các thành phần hoạt tính kháng melanogenic tiềm năng của nó bằng mô hình cá ngựa vằn và gắn kết phân tử.

Phương pháp:Cácchất chống oxy hóacác hoạt động được đánh giá bằng hoạt tính thu gom gốc 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis - (3- ethylbenthiazoline -6- axit sulphonic) (ABTS ) hoạt động nhặt rác triệt để và khử sắtchất chống oxy hóathử nghiệm quyền lực (FRAP). Hoạt động chống tạo hắc tố được đánh giá bằngtyrosinaseức chếhoạt động trong ống nghiệm ức chế melanin ở cá ngựa vằn. Các cấu hình hóa học được thực hiện bằng sắc ký lỏng hiệu suất cực cao kết hợp với khối phổ song song thời gian bay tứ cực (UPLC-Q-TOF-MS / MS). Trong khi đó, các thành phần hoạt tính kháng melanogenic tiềm năng được xác định tạm thời bằng cách gắn kết phân tử.

Kết quả:95% chiết xuất etanol của rễ sợi B. striata (EFB) sở hữu các hoạt động ức chế DPPH, ABTS, FRAP andtyrosinase mạnh nhất, với IC 50 5. 94 mg / L, 11,69 mg / L, 6,92 mmol FeSO4 / g, và 58,92 mg / L, tương ứng. Inaddition, EFB và chiết xuất 95% ethanol của củ B. striata (ETB) làm giảm đáng kể sự tổng hợp melanin của ngựa vằn theo cách phụ thuộc vào liều lượng. 39 chế phẩm hóa học, bao gồm 24 stilbenoid đã được xác định tạm thời từ EFB và ETB. Việc gắn kết phân tử chỉ ra rằng có 83 hợp chất (bao gồm 60 stilbenoids) và 85 (bao gồm 70stilbenoids) thể hiện ái lực liên kết mạnh hơn đối với tyrosinase và adenylate cyclase.

Sự kết luận:Những phát hiện hiện tại đã hỗ trợ cơ sở hợp lý cho việc sử dụng EFB và ETB làm chất làm trắng da tự nhiên trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm.

Từ khóa: Bletilla striata, Chất chống oxy hóa, Hoạt động chống tạo hắc tố, UPLC-Q-TOF-MS / MS, Cá ngựa vằn, Gắn kết phân tử

Nhấn vào đây để xem tác dụng phụ và lợi ích của cistanche đối với việc chống oxy hóa

Tiểu sử

Sâu vẽ bùa (Thunb.) Reichb. f. là cây thân thảo lâu năm phân bố rộng rãi ở Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản [1]. Củ khô của B. striata, còn được gọi là Baiji, lần đầu tiên được ghi trong cuốn sách Shennong's Classic of Materia Medica, đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc (TCM) trong hàng nghìn năm ở Trung Quốc. Dược điển Trung Quốc nói rằng nó có khả năng làm se khi cầm máu và giảm đau, do đó, nó được sử dụng rộng rãi để điều trị chứng nôn trớ, ho ra máu, chảy máu do chấn thương, loét, sưng tấy và nứt nẻ da [2, 3]. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh rằng B. striata sở hữu phổ rộng các hoạt động sinh học, chẳng hạn như chữa lành vết thương [4, 5], chất chống đông máu [6, 7], cầm máu [8],chống lại- viêm[9], chất chống oxy hóa[10], kháng khuẩn [11], chống virus cúm [12], và điều trị [13]. Đồng thời, B. striata chứa nhiều loại thành phần hóa học khác nhau, bao gồmpolysaccharid[14], bibenzyls, phenanthrenes, anthraquinon,flavonoidvà 2- isobutylmalates [3, 15], v.v.

B. striata là loại thuốc chính trong nhiều công thức làm trắng da ở TCM [16] và nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm gần đây [17]. Tuy nhiên, các thành phần hoạt tính của nó vẫn chưa rõ ràng và thậm chí một số kết quả nghiên cứu còn nằm ngoài dự kiến. Ví dụ, kết quả nghiên cứu được đưa ra bởi Chenet al. chỉ ra rằng 95% chiết xuất etanol của B. striata có hoạt tính ức chế tyrosinase cao hơn so với chiết xuất từ ​​nước có tỷ lệ ức chế 68,36% trong ống nghiệm [18], trong khi kết quả của Huang và cộng sự. cho thấy hoạt động ức chế của dịch chiết nước B. striata trên tyrosinase mạnh hơn hoạt tính ức chế của dịch chiết ethanol 95% trong tỷ lệ ức chế là 62% trong ống nghiệm [19]. Các kết quả nghiên cứu của Luetal. [20] và Linghuetal. [21] đã chứng minh rằng nước và 95% chiết xuất ethanol 95% của B. striata, đặc biệt là phân đoạn chloroform của nó, có thể ức chế sự phát triển của tế bào B16 và gây ra quá trình chết rụng theo cách thức phụ thuộc vào nồng độ.

Khi các thử nghiệm in vitro về sự ức chế tyrosinase và các dòng tế bào hắc tố, không liên quan đến các điều kiện sinh lý phức tạp và sự hấp thụ, chuyển hóa, phân phối và bài tiết của mẫu thử nghiệm, nhiều ví dụ cho thấy hoạt động ức chế đáng kể chống lại các dòng tế bào hắc tố và melanoma trong ống nghiệm, tuy nhiên, thể hiện hiệu quả yếu hoặc thậm chí không hiệu quả in vivo [22,23]. Glabridin cho thấy hoạt động ức chế tyrosinase đáng kể với IC 50 0. 43μmol / L, mạnh hơn 176 lần so với axit kojic. Tuy nhiên, nó không có tác dụng ức chế đối với sắc tố của cá ngựa vằn in vivo [24].

Trong khi đó, rễ sợi B. thể vân (FB) là sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình xử lý B. thể vân (TB). Các nghiên cứu hiện đại chỉ ra rằng FB chứa các hợp chất tương tự với TB và với hàm lượng phenol cao hơn [25]. Ngoài ra, các hoạt động kháng khuẩn [26], chống oxy hóa và chống tyrosinase của chiết xuất FB mạnh hơn của chiết xuất TB [25]. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên FB không được sử dụng hiệu quả và được sử dụng trong đất nông nghiệp, dẫn đến lãng phí nguồn FB và ô nhiễm môi trường [27].

Cá ngựa vằn (Danio rerio), một loài cá nước ngọt nhiệt đới nhỏ, là một mô hình động vật mới nổi cho ngành dược học

và nghiên cứu chất độc in vivo, với nhiều ưu điểm, bao gồm chi phí thấp, vòng đời ngắn, độ trong suốt cao, dễ bảo quản, khả năng sinh sản cao và yêu cầu ít mẫu thử hơn [28, 29]. Ngoài ra, cá ngựa vằn có sắc tố melanin trên bề mặt, cho phép quan sát đơn giản quá trình tạo sắc tố, và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu chống tạo hắc tố [28, 30].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã so sánh các hoạt động chống oxy hóa và ức chế tyrosinase của polysaccha-ride thô và 95% chiết xuất ethanol của TB và FB trong ống nghiệm, các hoạt động andanti-melanogenic trong mô hình cá ngựa vằn. Có nghĩa là trong khi đó, các thành phần hoạt tính kháng melanogenic tiềm năng được xác định tạm thời bằng cách gắn kết phân tử. Đã phát hiện ra rằng 95% chiết xuất ethanol của TB (ETB) và FB (EFB) sở hữu các hoạt động chống oxy hóa và chống tyrosinase đáng kể, đồng thời có thể làm giảm sự tổng hợp melanin của phôi cá ngựa vằn một cách phụ thuộc vào liều lượng. Do đó, ETB và EFB có thể được sử dụng như chất làm trắng da tự nhiên trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm.

Phương pháp

Hóa chất và thuốc thử

Tyrosinase, 3- (3, 4- dihydroxyphenyl) -L-alanin (L-DOPA) và arbutin đã được mua từ công ty thuốc thử Aladdin (Thượng Hải, Trung Quốc) .2, 2- diphenyl {{8 }} picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis - (3- ethylbenthiazoline -6- axit sulphonic) (ABTS), 6- hydroxy -2, 5,7 , 8- tetramethylchroman -2- axit cacboxylic (Trolox) và 2,4, 6- tris (2- pyridyl) -s-triazine (TPTZ) đã được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Acetonitril và metanol (cấp HPLC) được mua từ Tedia (Fairfield, OH, Hoa Kỳ). Nước khử ion được chuẩn bị bởi hệ thống nước Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Hoa Kỳ).

Quy trình thu hái và khai thác thực vật

B. striata được thu thập từ Công ty TNHH Công nghệ Nông lâm nghiệp Quzhou YiNianTang (Quzhou, Chiết Giang, Trung Quốc). Các mẫu phiếu được gửi tại Herbarium của Trường Cao đẳng Dược Chiết Giang (Phụ lục số 190615). Toàn bộ cây được chia thành củ và rễ dạng sợi. Sau đó, chúng được cắt thành từng miếng nhỏ và được làm khô bằng phương pháp đông khô chân không.

Các mẫu khô và bột (TB và FB) được chiết xuất với 95% ethanol trong ba lần (1,5 giờ cho mỗi lần). Dịch chiết được lọc bằng giấy lọc What man (số 1). Dịch lọc được cô đặc ở độ khô trong thiết bị cô quay (Hei-VAP, Heidolph, Đức) ở 50 độ và sau đó được làm khô bằng máy sấy chân không. Sản lượng chiết xuất bằng etanol của TB (ETB) và FB (EFB) lần lượt là 5,21 và 6,53%. Cặn được sử dụng để chiết polysaccharide thô được phân tán trong nước 80 độ trong 4 giờ và kết tủa bằng etanol [31]. Sản lượng polysaccharide của TB (PTB) vàFB (PFB) lần lượt là 14,75 và 6,45 phần trăm.

chiết xuất cistanche

Phân tích hóa học

Phân tích hóa học được thực hiện trên sắc ký lỏng hiệu suất cực cao kết hợp với khối phổ tứ cực thời gian bay song song (UPLC-Q-TOF-MS / MS). Sự phân tách sắc ký được thực hiện trên tem Waters Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, US) với cột WatersBEH Shield RP C18 (1 0 0 × 2,1mm, 1,7μm) at3 { {43}} độ. Pha động bao gồm 0,1% formicacid trong nước (A) và acetonitril (B), với gradien tuyến tính: 0–3 phút, 5–16% B; 3–8 phút, 16–30 phần trăm B; 8–10 phút, 30–35 phần trăm B; 10–15 phút, 35–55 phần trăm B; 15–18 phút, 55–80 phần trăm B; 18–19 phút, 80–5 phần trăm B; 19–20 phút, 5 phần trăm B. Tốc độ dòng chảy là 0,3 mL / phút và thể tích tiêm là 2 μL.

Các thí nghiệm TOF-MS / MS được thực hiện bằng cách sử dụng khối phổ AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) được trang bị ion hóa chùm tia điện tử (ESI). Việc phát hiện MS được kết nối trong phương pháp ion hóa âm. Các thông số được thiết lập như sau: nguồn và nhiệt độ khử ẩm lần lượt là 100 độ và 450 độ; Lưu lượng khí khử độc là 900L / h; điện áp mao dẫn là 2kV; điện áp hình nón là 40 V; năng lượng va chạm là 22 eV; và bảng quét đầy đủ là từ 100 đến 2000 Da.

Thử nghiệm chất chống oxy hóa hoạt động thu dọn gốc DPPH

Hoạt động thu gom tận gốc DPPH được xác định không phù hợp với Ali và cộng sự. có sửa đổi một chút [32]. Ngắn gọn, dung dịch mẫu thử 5 0 μL được trộn với dung dịch etanol 15 0 μLDPPH (0,2mM) trong 96- đĩa giếng và được giữ trong bóng tối trong 30 phút . Độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 517nm (A1) được đánh giá bằng máy quang phổ vi phiến (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Dung dịch trống không có mẫu thử trộn với dung dịch DPPHetanol được đặt là nhóm dương tính (A0). Dung dịch trống không có DPPH trộn với độ phân giải mẫu thử nghiệm được đặt là nhóm trắng (A2). Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần. Tỷ lệ thu gom gốc DPPH được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ thu gom tận gốc DPPH (phần trăm) {{0}} [A 0- (A 1- A2)] / A0 × 100 phần trăm.

Hoạt động nhặt rác triệt để ABTS

Khả năng thu gom tận gốc ABTS được đo bằng phương pháp được mô tả bởi Ali et al. [32]. Một cách ngắn gọn, dung dịch nước 7mMABST được trộn với kali persulfat 2,45mM theo tỷ lệ 1: 1 (v / v), và ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 16 giờ để thu được dung dịch gốc ABST cộng. Dung dịch gốc được pha loãng với dung dịch muối đệm photphat (PBS) để điều chỉnh độ hấp thụ của (0. 72 ± 0. 2) ở bước sóng 734nm. 20μL mẫu thử ở các nồng độ khác nhau được trộn kỹ với dung dịch ABTS plus 180μL. Các hỗn hợp phản ứng được giữ trong bóng tối trong 5 phút và sau đó đo độ hấp thụ (B1) ở bước sóng 734nm. Độ hấp thụ của hỗn hợp không có mẫu thử và ABST cộng được đặt lần lượt là B và B. Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần. Tỷ lệ loại bỏ các gốc ABTS được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ quét triệt để ABTS (phần trăm) {{0}} [B 0- (B 1- B2)] / B0 × 100 phần trăm.

Thử nghiệm sức mạnh chống oxy hóa khử sắt (FRAP)

Hoạt tính khử sắt của sắt được xác định theo quy trình của Kosakowska và cộng sự. [33]. 3 0 đệm axetat 0mM, 10mM TPTZ (2,4, 6- tris (2- pyridyl) -s-triazine) và 20mM FeCl3 được trộn ở a (v / v / v) tỷ lệ 10: 1: 1 chuẩn bị thuốc thử hoạt động. 100μL của mỗi dung dịch mẫu thử nghiệm được trộn với thuốc thử làm việc 100μL TPTZ, ủ ở 37 độ trong 20 phút và độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 593 nm. Trong khi đó, một loạt các dung dịch chuẩn FeSO4 trong khoảng nồng độ từ 0–1000ug / mL được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Khả năng khử sắt được tính toán khi tạo thành phức Fe2 cộng với -TPTZ màu xanh lam cường độ cao. Kết quả được biểu thị dưới dạng Fe2 cộng với khả năng chống oxy hóa (mmol FeSO4 / g chất béo).

Hoạt động ức chế tyrosinase

Hoạt động ức chế tyrosinase được xác định bằng phương pháp đo quang phổ sử dụng L-DOPA làm chất nền [34]. Tóm lại, các dung dịch mẫu 50μL ở các nồng độ khác nhau được trộn với 50 μL tyrosinase (200 đơn vị / mL, dung dịch đệm phosphat pH 6,8 hòa tan) trong 96- giếng đĩa và ủ trong 15 phút ở 25 độ. Phản ứng sau đó được bắt đầu với việc bổ sung L-DOPA (50 μL). Sau khi ủ 30 phút ở 25 độ, độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm (Aa) được xác định bằng máy quang phổ vi tấm nền bầu trời đa năng (ThermoFisher Scientific, Mỹ). Tương tự, độ hấp thụ của các giếng mẫu không có tyrosinase (Ab) và giếng đối chứng có enzyme nhưng không có mẫu (Ab) đã được phát hiện tại thời điểm đó. Hoạt động ức chế tyrosinase được tính theo phương trình như sau:

Tỷ lệ ức chế tyrosinase (phần trăm)=[1− (Aa - Ab) / Ac] × 100 phần trăm.

IC50 được tính toán bằng phương trình GraphPad Prism như sau:

Y=tối thiểu cộng (tối đa - tối thiểu) / 1 cộng 10 (x − logIC50) × Độ dốc đồi

X đại diện cho nồng độ chất ức chế; Y đại diện cho dữ liệu ức chế (phần trăm) cùng với các giá trị tối thiểu (tối thiểu) và cực đại (tối đa) của chúng; Độ dốc của đồi là hệ số của độ dốc.

Cistanche ức chế hoạt động của tyrosinase.

Ức chế melanin ở cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn dòng AB loại hoang dã (do Hunter Bio-technology, Inc., Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang cung cấp) được nuôi trong nước cá (0. 2% muối biển tức thì trong nước khử ion, pH 6,9–7,2, độ dẫn điện 48 { {18}} - 510 mS / cm và độ cứng 53,7–71,6mg / L CaCO3) trong chu kỳ ánh sáng / tối 14 / 10h ở nhiệt độ không đổi 28 ± 0,5 độ và cho tôm ăn nước muối sống hai lần mỗi ngày. Những con ngựa vằn được lấy từ sinh sản tự nhiên và được thu thập trong vòng 30 phút. Thử nghiệm cá ngựa vằn đã được Hiệp hội Đánh giá và Công nhận về Chăm sóc Động vật Phòng thí nghiệm (AAALAC) công nhận. Nghiên cứu hiện tại đã được IACUC (Ủy ban sử dụng và chăm sóc động vật thể chế) tại Hunter Biotechnology, Inc. phê duyệt và số phê duyệt của IACUC là 001458.

Phôi ở giai đoạn 6 giờ sau thụ tinh (hpf) được xử lý từng chiết xuất ở sáu nồng độ (1 0, 30, 62,5,125, 250 và 500 mg / L) trong 72 giờ để đánh giá nồng độ không gây chết tối đa (MNLC ). Kết quả là, các MNLC của tất cả dịch chiết có hơn 62,50mg / L.10 phôi được đặt trong 6- giếng và được tiếp xúc với các mẫu thử nghiệm ở nồng độ 10 và 30 mg / L từ 6 hpf đến 54 hpf (tiếp xúc 48 giờ ). DMSO (0,05%, v / v) vàarbutin (10 và 30mg / L) được sử dụng tương ứng như đối chứng dương tính và bình thường.

Các phôi đồng bộ được thu thập và quan sát dưới kính hiển vi soi nổi (SZX7, Olympus, Nhật Bản) được trang bị máy ảnh kỹ thuật số (VertA1, Trung Quốc). Sự tích tụ melanin, tương quan trực tiếp với các vùng sắc tố của cá ngựa vằn, được tính toán bằng cách sử dụng Chương trình Thao tác GNUImage (GIMP phiên bản 2.10.2) và được biểu thị theo tỷ lệ phần trăm đối với sự kiểm soát âm tính (tích lũy melanin 100 phần trăm) [28, 30].

Nghiên cứu gắn kết phân tử

158 hợp chất được phân lập từ B. striata trong tài liệu [2], bao gồm 19 glycoside, 28 bibenzyls, 19 phenan-threnes, 18 biphenanthrenes, 23 dihydrophenanthrenes, 5 anthocyanins, 11 steroids, 8 triterpenoids, 12 phe-nolic acid, 5 quinone, và 10 hợp chất khác, được sử dụng làm phối tử. Các cấu trúc 3D được vẽ bởi ChemBio3D và được tối ưu hóa bằng cách sử dụng MM2 và Autodock Tools. Cấu trúc tinh thể 3D của tyrosinase (PDBID: 5M8N) và adenylate cyclase (PDB ID: 5IV3) được lấy từ Ngân hàng dữ liệu protein RCSB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Tất cả các phân tử nước và các nguyên tử khác nhau đã bị loại bỏ khỏi cấu trúc tinh thể bằng cách sử dụng Công cụ Chimera và MGL. Cuối cùng, Autodock

Vina được sử dụng để gắn protein thụ thể với các phối tử phân tử nhỏ. Các thông số của vị trí gắn kết pro-tein của thụ thể được đặt lần lượt là −36,700, 7,034, −19,104, và - 17,467, - 22,807, 2,786, theo phối tử gốc mimosine và LRE1 [35]. Để đạt được độ chính xác tính toán cao hơn, 20 tham số toàn diện cho mỗi thụ thể đã được tạo ra và cấu trúc có ái lực cao nhất đã được chọn theo cấu trúc kết nối cuối cùng và được hiển thị trong Pymol2.3. Trong khi đó, các phối tử ban đầu là mimosine và LRE1 được lấy làm đối chứng tích cực [36].

Trong dự đoán silico ADMET

3 lượt truy cập hàng đầu từ B. striata sở hữu ái lực liên kết tốt hơn với tyrosinase và adenylate cyclase, được đưa vào phân tích ADMET. QikProp trong Schrodingersuite được sử dụng để tính toán các đặc tính vật lý của chúng và các đặc điểm liên quan đến drug, bao gồm trọng lượng phân tử (MW), hệ số phân vùng octanol / nước dự đoán (QPlogPo / w), độ hòa tan trong nước dự đoán (QPlogS), dự đoán ô Caco -2 biểu kiến tính thấm đối với hàng rào máu-ruột (QPPCaco), dự đoán hệ số phân tán máu / não (QPlogBB), dự đoán tính thấm qua da (QPlogKp), dự đoán IC50 cho sự tắc nghẽn của các kênh HERGK cộng (QPlog HERG) và dự đoán khả năng hấp thu qua đường miệng của con người. Các thuộc tính được đánh giá dựa trên quy tắc 5 của Lipin-ski và tài liệu [37, 38].

Mô phỏng động lực học phân tử

Để kiểm tra sự ổn định và dao động động của phức hợp phối tử-protein trong môi trường sinh học mô phỏng, và xác nhận thêm các kết quả gắn kết, các hợp chất blestrin D (75) đã được chọn làm phối tử cho phép mô phỏng động lực học phân tử (MD), dựa trên kết quả docking phân tử. Phức hợp của blestrin D với tyrosinase và adenylate cyclasewere thực hiện mô phỏng MD và chạy trong 100ns, sử dụng chế độ nước TIP3P. Giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) của các nguyên tử xương sống của protein so với cấu trúc ban đầu được tính toán để kiểm tra độ ổn định của protein trong suốt thời gian mô phỏng [39].

Kết quả

Thành phần hóa học

Các sắc ký đồ pic cơ bản điển hình của ETB và EFB được thể hiện trong Hình 1. Phần mềm PeakView được sử dụng để xác định các thành phần. Công thức phân tử đã được ấn định chính xác với sai số khối lượng 10ppm. Trọng lượng phân tử chính xác và các phân mảnh được sử dụng để xác định các thành phần theo nhiệt độ và cơ sở dữ liệu cấu trúc hóa học miễn phí, suchas ChemSpider và Massbank. Kết quả là, 39 chế phẩm hóa học, bao gồm 24 stilbenoids (bibenzyls, phenanthrenes và các dẫn xuất của chúng), 6 glycoside, 4phenolic acid, 3 quinones, 1 steroid và 1 hợp chất khác đã được dự kiến ​​xác định từ EFB và ETB. Đồng thời, quá trình bán định lượng tương đối của chúng được thực hiện bằng cách đo diện tích pic của mỗi hợp chất ở chế độMS sử dụng sắc ký đồ ion chiết xuất được [40]. nồng độ) đã được tóm tắt trong Bảng 1.

Khả năng chống oxy hóa

Ai cũng biết rằng tia cực tím A (UVA) -irradiation có thể tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) và làm trung gian cho sự hình thành hắc tố quá mức trong tế bào da. , 42]. Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, khả năng chống oxy hóa được đánh giá thông qua DPPH, hoạt động thu gom gốc ABTS và FRAPassay. Kết quả (Bảng 2 và Hình 2) cho thấy rằngEFB (IC 50=5. 94mg / L) sở hữu hoạt động nhặt rác DPPHradical mạnh nhất trong ống nghiệm so với PTB (IC 50=548. 24 mg / L) , PFB (IC 50=285. 81 mg / L) và ETB (IC 50=65. 25mg / L). Một xu hướng tương tự đã được quan sát trong xét nghiệmABTS và FRAP. 95% chiết xuất etanolic của TB và PB có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn polysaccharides thô thantheir in vitro. Ngoài ra, EFB thể hiện hoạt động chống oxy hóa mạnh hơn ETB, phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó [25].

Hoạt động ức chế tyrosinase

Tyrosinase là enzym giới hạn tốc độ quan trọng trong con đường tổng hợp melanin và được sử dụng rộng rãi để xác định tiềm năng của các sản phẩm tự nhiên có tác dụng chống hình thành hắc tố [43]. Kết quả (Hình 3) cho thấy ETB vàEPB có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh hơn PTBand PPB in vitro, phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó [25]. EFB thể hiện hoạt động ức chế tyrosinasein mạnh hơn theo cách phụ thuộc vào liều lượng (từ 20 đến 200mg / L) với IC 50=58. 92mg / L so với ETB (IC 50=75. 44mg / L) và hợp chất dương tính arbutin (IC { {11}}. 02 mg / L).

Ức chế melanin ở cá ngựa vằn

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}. 05), chỉ ra rằng 0,05% DMSO của thevehicle không ảnh hưởng đến việc sản xuất melanin trong phôi cá ngựa vằn. Tuy nhiên, sau khi tiếp xúc với các mẫu thử nghiệm và arbutin trong 48 giờ, phôi cá ngựa vằn đã ức chế sự lắng đọng melanin ở các mức độ khác nhau (Hình 3B, 4), ngoại trừ nhóm PFB 10 mg / L. Đáng chú ý là hàm lượng melanin tiềm ẩn trong nhóm ETB 10mg / L (78,38 phần trăm) và 30 mg / L (64,72 phần trăm) thấp hơn đáng kể so với thatin PTB 10mg / L (93,06 phần trăm) và 30mg / L (82,02 phần trăm) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Gắn kết phân tử

Tyrosinase là enzyme giới hạn tốc độ trong sinh tổng hợp melanin: hydroxyl hóa tyrosine thành 3, 4- dihydroxy-phenylalanine (DOPA), và oxy hóa DOPA todopaquinone. Do đó, tyrosinase được coi là mục tiêu quan trọng cho sự phát triển của các chất ức chế tạo hắc tố [44]. Ngoài ra, adenylatecyclase là enzym quan trọng của quá trình hình thành hắc tố do cAMP gây ra. Sự liên kết của melanotropin alpha polypeptide (-MSH) với các thụ thể MC1R gây ra sự hoạt hóa của menadenylate cyclase, tăng mức cAMP, điều hòa biểu hiện của gen tyrosinase, và sau đó tăng cường tổng hợp melanin [45]. Do đó, chúng tôi đã thực hiện một nghiên cứu gắn kết phân tử của 158 hợp chất được phân lập từ B. striata trước đây [2], withtyrosinase và adenylate cyclase. Năng lượng liên kết của các phối tử được nghiên cứu với tyrosinase và adenylatecyclase được tóm tắt trong Bảng S1. Có 83 hợp chất (bao gồm 6 0 stilbenoids) và 85 (bao gồm 70 stilbenoids) thể hiện tyrosinase và adenylate cyclase liên kết mạnh hơn, so sánh với liều lượng của các phối tử ban đầu là mimosine (- 6,4 kcal / mol) và LRE1 (- 8,5 kcal / mol). 1, 8- bis (p-hydroxybenzyl) -4- methoxyphenanthrene -2, 7- diol (56), blestrin D (75) và 2, 7- dihydroxy -1, 6- bis (p-hydroxybenzyl) -4- meth-oxy -9, 10- dihydrophenanthrene (93) là ba yếu tố hàng đầu đối với tyrosinase, với năng lượng liên kết −10.2,10.0, và 9,7kcal / mol, tương ứng. Trong khi blestrin D (75), blestrin B (73) và 3,3′-dihydroxy -5- metoxy -2, 5 ′, 6- tris (p-hydroxybenzyl) bibenzyl (42) là các phối tử thứ ba đối với adenylate cyclase, với năng lượng liên kết - 12,1, - 11,9, và - 11,6 kcal / mol, tương ứng.

Điều đáng chú ý là blestrin D (75), một hợp chất biphenanthrene, đi vào túi liên kết củatyrosinase và adenylate cyclase (Hình 5), và thể hiện các ái lực liên kết đáng kể đối với cả tyrosinase vàadenylate cyclase. Tương tác Van der Walls góp phần vào giá trị tương tác năng lượng tổng thể, trong khi nhóm hydroxyl tạo ra liên kết hydro với gốc aminoacid Glu 451, Arg114 của tyrosinase, và Val 167of adenylate cyclase, tương ứng (Bảng 3 và Hình S1). Hợp chất 93 cũng thể hiện các liên kết liên kết đáng kể hướng tới tyrosinase thông qua sự hình thành 6 hydrobond với các gốc axit amin Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 và Gln236.

Trong dự đoán silico ADMET

Các giá trị dự đoán của một số tham số quan trọng cùng với phạm vi chấp nhận được của chúng được tóm tắt trong Bảng 4. Ngoài QPlogS là 3,3 ′, 5- trimethoxybibenzyl, blestrin B và blestrin D, và QPlogBBof 3,3 ′, {{6} } trimethoxybibenzyl, tất cả các thuộc tínhADMET được tính toán khác của ba lần truy cập hàng đầu đều nằm trong phạm vi dự kiến, trong khi đó, QPlog HERG của tất cả ba lần truy cập hàng đầu đều nhỏ hơn −5, cho thấy chúng có khả năng gây nghiện cho con người. QPlog Kp của tất cả ba lần truy cập hàng đầu cho cả tyrosinase và adenylatecyclase, ngoại trừ 3,3 ′, 5- trimethoxybibenzyl, đều nằm trong phạm vi thuận lợi, cho thấy các hợp chất này có thể dễ dàng thấm vào da.

Mô phỏng động học phân tử

Biểu đồ RMSD cho thấy rằng các giá trị RMSD của phức hợp protein-phối tử không dao động đáng kể trong toàn bộ thời gian mô phỏng. Các giá trị RMSD (Hình 6A) của blestrin D với phức hợp tyrosinase và ade-nylate cyclase được xác định trong khoảng từ 1,5 đến 2,8Å, và từ 2. 0 đến 3,6Å, tương ứng. Giá trị TheRMSF phản ánh tính linh hoạt của từng mô phỏng lưu trú. Các chất cặn có giá trị RMSF cao hơn cho thấy chúng linh hoạt hơn (Hình 6B). Các giá trị RMSF của dư lượng axit amin trong các vùng mạch vòng được phát hiện là dao động lớn. Trong khi đó, các siteresidue đang hoạt động giữ một giá trị RMSF nhỏ (nhỏ hơn 1. 0 Å), chẳng hạn như Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 và Arg230in tyrosinase và Val167, Leu102, Phe45, Lys95 vàLeu166 trong adenylate cyclase, cho thấy các tập tin ràng buộc đã được giữ ổn định. Các tương tác phân tử củablestrin D với tyrosinase và adenylate cyclase được thể hiện trong Hình 7.

Năng lượng tự do liên kết được tính toán bằng phương pháp diện tích bề mặt sinh tổng quát cơ học phân tử (MM-GBSA) [39]. Năng lượng tự do liên kết dự đoán của blestrin D với tyrosinase và adenylatecyclase lần lượt là-96,94kcal / mol và-139,69kcal / mol, ngụ ý các tương tác liên kết là tự phát (Bảng 5). Hơn nữa, những đóng góp ủng hộ liên kết phối tử là tương tác solvat hóa không cực, van der Waals và phản ứng điện phân.

Điều đáng chú ý là các loại và hàm lượng của các thành phần hóa chất trong EFB nhiều hơn so với trongETB. Diện tích pic của tất cả các hợp chất được xác định trongEFB xấp xỉ hai lần diện tích trong ETB. Mili-tarine là hợp chất phong phú nhất trong cả EFB và ETB, có các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ thần kinh đáng kể, và được chọn làm chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng của B. striata trong ấn bản Dược điển Trung Quốc 2020 [46]. Diện tích đỉnh tương đối của quân đội inEFB (38,39 × 106) cao hơn một chút so với trong ETB (30,48 × 106). Gastrodin là một hợp chất nổi tiếng trong nhiều loại thuốc thảo dược của Trung Quốc, chẳng hạn như Gastrodia elata, có tác dụng ức chế tyrosinase đáng kể và thu hồi chất phóng xạ [30]. Diện tích đỉnh tương đối của gastrodin trong EFB (1,43 × 106) thấp hơn một chút so với trongETB (2,17 × 106).

95% chiết xuất etanolic của TB và PB có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong ống nghiệm hơn so với polysac-charide thô của chúng. Ngoài ra, EFB thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh hơn ETB, phù hợp với kết quả tìm kiếm trước đó [25]. Hiện tượng này có thể là do EFB chứa hàm lượng hợp chất chống oxy hóa cao hơn, chẳng hạn như militarine và stilbenoids (polyphenol cây tự nhiên). Ví dụ, đỉnh tương đối làaof 4,8,4 ′, 8′-tetramethoxy- [1,1′-biphenanthrene] -2, 7,2 ′, 7′-tetrol, một biphenanthrene với bốn nhóm hydroxyl phenol, là 9,15 × 1 0 6 trong FB, trong khi đó là 0,01 × 106 inTB.

Trong nghiên cứu hiện tại, PPB và PTB cho thấy hoạt động ức chế tyrosinase nhẹ trong cách sử dụng phụ thuộc vào liều lượng.Tuy nhiên, nó chứng minh rằng không có hoạt tính nào được phát hiện trong chiết xuất nước của PB (chứa PPB) [25]. Hiện tượng thisphenome có thể do cách chuẩn bị mẫu khác nhau. Dịch chiết nước của PB được sử dụng để ức chế hoạt tính evaluatetyrosinase trong thí nghiệm của Jiang [25], trong khi trong nghiên cứu này, dịch chiết nước được kết tủa với etanol để thu được polysaccharid thô.

Gần đây, mô hình cá ngựa vằn được sử dụng rộng rãi để đánh giá hiệu quả chống hình thành hắc tố in vivo [47, 48]. Arbu-tin, một hợp chất hydroquinone glucoside thực vật bất biến hiện có, đã được sử dụng thương mại trong ngành công nghiệp vũ trụ, được coi là đối chứng tích cực. Các hoạt động chống hình thành hắc tố của ETB và EFB là mạnh mẽ của arbutin, cho thấy ETB và EFB có thể được sử dụng như các chất làm sáng da trong ngành mỹ phẩm.

Diện tích đỉnh tương đối của blestrin D trong EFB (1,91 × 1 0 6), xấp xỉ bốn lần diện tích trong ETB (0. 46 × 1 0). Diện tích đỉnh tương đối của hợp chất 56 (8,73 × 1 0 6) và 93 (0,64 × 106) trong EFB cũng cao hơn đáng kể so với trong ETB (nhỏ hơn 0,01 × 106 và 0,10 × 106). Đây có thể là một trong những lý do tại sao EFB cho thấy tác dụng chống tạo hắc tố mạnh hơn ETB. Điều thú vị là ba phối tử hàng đầu hướng tớityrosinase và adenylate cyclase đều thuộc stilbenoids (bibenzyls, phenanthrenes và dẫn xuất của nó). đã thu hút sự quan tâm lớn trong những năm qua vì các hoạt tính sinh học đáng chú ý của chúng như hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa [49] .Resveratrol là stilbenoid phổ biến nhất. Nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng resveratrol và các dẫn xuất của nó có thể ức chế đáng kể hoạt động xúc tác, biểu hiện gen và các sửa đổi sau giao hợp củatyrosinase. Do đó, chúng cho thấy có khả năng hữu ích như chất làm sáng da và chống lão hóa trong mỹ phẩm [41, 50].

Cistanche cho thấy có khả năng hữu ích như chất làm sáng da và chống lão hóa trong mỹ phẩm.

Để biết thêm thông tin, xin vui lòng bấm vào hình ảnh.

Kết luận

Trong nghiên cứu này, chất chống oxy hóa và chống tạo hắc tố của polysaccharide thô từ củ B. thể vân (PTB) và rễ sợi (FPB), và 95% ethanolextract của củ B. thể vân (ETB) và rễ sợi (EFB) đã được nghiên cứu một cách có hệ thống . Kết quả cho thấy EFB sở hữu hoạt động thu gom gốc DPPH, ABTS mạnh nhất và hoạt động khử sắt sắt. Ngoài ra, ETB và EFB có thể làm giảm đáng kể hoạt động củatyrosinase trong ống nghiệm và sự tổng hợp melanin của phôi cá ngựa một cách phụ thuộc vào liều lượng. Việc gắn molec-ular chỉ ra rằng có một lượng lớn các hợp chất numberof, chủ yếu thuộc về stilbenoids, thể hiện các ái lực liên kết mạnh hơn đối với tyrosinase vàadenylate cyclase, so với ái lực liên kết của phối tử ban đầu. Những phát hiện hiện tại đã hỗ trợ cơ sở cho việc sử dụng ETB và EFB làm chất làm trắng da tự nhiên trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm.