Ảnh hưởng của chất chiết xuất hạt dẻ cười Deserticola đối với thương tích của RTEC thỏ bằng H2O2

trừu tượng: Các tế bào biểu mô ống thận thỏ được nuôi cấy trong ống nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đối với sự tăng sinh tế bào và chiết xuất Cistanche Deserticola trên các tế bào biểu mô ống thận bị tổn thương bởi H2O2. Hình thái tế bào được sử dụng để quan sát ảnh hưởng của H2O2 đối với sự tăng sinh tế bào biểu mô ống thận thỏ bằng phương pháp MTT và tác dụng bảo vệ của 2,20 và 200 mg·L － 1 C． chiết xuất nước sa mạc và chiết xuất rượu đã được nghiên cứu bởi sự giải phóng LDH. Kết quả cho thấy số lượng tế bào biến đổi hình thái tăng dần. Số lượng tế bào đính kèm đã giảm dần. Tốc độ ức chế tăng sinh tế bào và giải phóng LDH tăng lên cùng với việc tăng nồng độ H2O2. C liều cao. chiết xuất Deserticola có thể làm giảm đáng kể tác dụng ức chế sự tăng sinh ＲTECs bằng H2O2 ( P ＜ 0． 01) ． Lực kéo nước và chiết xuất cồn của C． Deserticola có thể làm giảm đáng kể việc giải phóng LDH( P ＜ 0． 01) ． H2O2 có một số ảnh hưởng đến phản ứng tăng sinh của ＲTECs của thỏ, trong khi C． Chiết xuất Deserticola có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương ＲTECs do H2O2 ．

từ khóa: Cành sa mạc; tế bào biểu mô ống thận; lời nói đầu tổn thương tế bào

Cistanche Deserticola hay còn gọi là nhân sâm sa mạc là thân diệp hạ châu khô, có vảy của cây Cistanche Deserticola YC Ma hoặc Cistanche tubulosa (Schenk) Wish trong họ Orobaceae. Nó có tác dụng bổ thận dương, ích tinh huyết, nhuận ruột, giảm táo bón. Theo truyền thống được sử dụng cho các chứng thận dương bất túc, tinh huyết bất túc, liệt dương và vô sinh, eo và đầu gối đau nhức, cơ xương yếu, khô ruột và táo bón, đây là loại thuốc bổ thận dương được sử dụng nhiều nhất trong lịch sử. 

quả hồ trăn sa mạc

H2O2, là một dạng của các loại oxy phản ứng, có tác dụng mạnh trong việc gây ra quá trình peroxy hóa lipid và có thể phản ứng với hầu hết mọi thành phần tế bào, gây ra quá trình peroxy hóa lipid chuỗi, dẫn đến quá trình chết theo chương trình và rối loạn chức năng của tế bào [2,3]. Thí nghiệm chủ yếu nghiên cứu tác dụng của chiết xuất Cistanche Deserticola đối với sự ức chế tăng sinh H2O2-gây ra và tổn thương tế bào biểu mô ống thận của thỏ và khám phá sơ bộ tác dụng bảo vệ của nó đối với tế bào biểu mô ống thận.

1 Vật liệu và phương pháp

1.1 Thuốc thử nghiệm

Cistanche Deserticola ma được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Chuannan Tứ Xuyên (số lô 151201).

Cistanche sống ở sa mạc

1.2 Động vật

Thỏ trắng New Zealand, đực, 20 ngày tuổi, được mua từ cơ sở thí nghiệm của Viện nghiên cứu chăn nuôi Quý Châu, với số giấy phép động vật SCXK (Quý Châu) 2012-001.

1.3 Thuốc thử

DMEM/F-12 (1:1), Tập đoàn Gbico; Huyết thanh bào thai bò, Công ty TNHH Công nghệ sinh học Chiết Giang Tianhang; Dimethyl sulfoxide (DMSO), Công ty TNHH Công nghệ sinh học Dingguo Changsheng Bắc Kinh; H2O2, Công ty TNHH Dược phẩm Kim Sơn Tứ Xuyên; Trypsin, Công ty Amresco; Thiazole blue (MTT), Genview; Bộ xét nghiệm độc tính tế bào không phóng xạ, Promega Corporation; Ethanol khan, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Dụng cụ

Tủ ấm CO2, Type 3111, Thermo Fisher Scientific; Chất đánh dấu enzym, loại 1510, Thermo Fisher Scientific; Bàn làm việc siêu sạch, SW-CJ-1FD, Suzhou Purifying Equipment Co., Ltd; Kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược, Ningbo Shunyu; Máy bay hơi quay, RE-52AA, Nhà máy dụng cụ sinh hóa Yarong Thượng Hải; Máy sấy đông lạnh, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Phương pháp

1. 5.1 Chuẩn bị chiết xuất Cistanche Deserticola

Lấy dược liệu Cistanche Deserticola đã phơi khô đem xay nhỏ. Cân chính xác 100 g mỗi loại bột và thêm lượng nước cất gấp 10 lần và etanol 75 phần trăm đun nóng hồi lưu để chiết 3 lần. Lần thứ nhất là 3 giờ, lần thứ hai là 1 5 giờ, lần thứ ba là 1 giờ, hợp nhất 3 dịch lọc, giảm áp suất và cô đặc đến dịch chiết, tính hiệu suất dịch chiết là 22 30 phần trăm, chiết xuất etanol 21 70 phần trăm , cồn dư dễ bay hơi, cơ chế đông khô để thu được nước và cồn chiết xuất từ ​​Cistanche Deserticola, được đậy kín, sấy khô và bảo quản ở nơi tối để sử dụng trong tương lai.

1. 5. 2 Nuôi cấy tế bào

Xây dựng mô hình tế bào biểu mô ống thận bằng phương pháp được mô tả bởi Zhao Dan et al. [4], phân lập và nuôi cấy các tế bào biểu mô ống thận sơ cấp từ 20-thỏ một ngày tuổi và đợi các tế bào này phát triển đến hơn 90 phần trăm của đĩa nuôi cấy, sau đó tiêu hóa chúng bằng trypsin. Sử dụng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh DMEM/F-12 chứa 1% huyết thanh bào thai bò với tỷ lệ 1 hai × 104 tế bào được cấy trên đĩa 96 giếng và nuôi cấy ở 37 độ và 5% CO2.

1. 5. 3 Xây dựng mô hình tổn thương tế bào biểu mô ống thận thỏ do 3 H2O2 gây ra

Tham khảo 1 5. 2 Cấy tế bào, sau 48 giờ tế bào nuôi ổn định thì dùng H2O2 cho tổn thương. Thiết lập một nhóm thử nghiệm và một nhóm kiểm soát trống, với 4 lần lặp lại trong mỗi nhóm, lặp lại ba lần. Nhóm thực nghiệm: Thay môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh bằng các nồng độ H2O2 khác nhau, với nồng độ H2O2 lần lượt là 550, 500, 450, 400 và 350 μ Mol · L-1, nhóm đối chứng để trống: Thay môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, tiếp tục nuôi cấy trong 24 giờ ở điều kiện 37 độ và 5% CO2, tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi và thu thập hình ảnh. Phương pháp MTT [5] được sử dụng để đo sự tăng sinh của tế bào sau tác dụng của H2O2, và giá trị độ hấp thụ (giá trị OD) được đo ở bước sóng 490 nm. Sử dụng bộ phát hiện độc tính tế bào không phóng xạ để xác định những thay đổi trong quá trình giải phóng LDH trong tế bào sau khi xử lý H2O2, lượng LDH giải phóng ( phần trăm )=Lượng LDH nổi trên bề mặt/(Lượng LDH nổi phía trên cộng với lượng LDH ly giải) × 100 phần trăm . Nhuộm huỳnh quang AO/EB [6]: Lấy lần lượt 100 μ G/mL dung dịch AO và 100 μ 100 g/mL EB mỗi μ L. Trộn đều và thêm 10 μ L vào mỗi giếng. Ngay lập tức đặt nó lên một chất tương phản pha. kính hiển vi huỳnh quang để quan sát, duy trì trường quan sát không thay đổi trong vòng 5 phút và thu thập hình ảnh dưới ánh sáng xanh dương ở 450 ± 10 nm và ánh sáng lục ở 532 ± 10 nm, tương ứng. Sử dụng hệ thống thu thập huỳnh quang để tổng hợp huỳnh quang để thu được hình ảnh nhuộm huỳnh quang.

1. 5. 4 Ảnh hưởng của 4 bột chiết xuất từ ​​quả hồ trăn đối với tổn thương do H2O2-gây ra đối với các tế bào biểu mô ống thận của thỏ

bột hồ đào

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Cây chùm ngây trị bệnh thận

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Theo 1 5. 2 Cấy tế bào, và sau 24 giờ nuôi cấy tế bào ổn định, thêm 200 ul môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh có chứa chiết xuất Cistanche Deserticola vào mỗi giếng để bảo vệ trước các tế bào trong 24 giờ. Thiết lập một nhóm thử nghiệm, một nhóm mô hình và một nhóm kiểm soát trống, với ba lần lặp lại cho mỗi nhóm. Nhóm thí nghiệm và nhóm mô hình: thay thế bằng 400 μ Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh với mol·L-1H2O2; Nhóm kiểm soát trống: môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh. Tiếp tục nuôi cấy trong 24 giờ. Sự tăng sinh tế bào được đo bằng phương pháp MTT và những thay đổi trong quá trình giải phóng LDH của tế bào được đo bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm độc tính tế bào không phóng xạ.

1.6 Xử lý thống kê

Kết quả dữ liệu được thể hiện bằng x ± s bằng phần mềm thống kê SPSS 19 0 đã được sử dụng để phân tích thống kê. Phân tích phương sai một yếu tố được sử dụng để so sánh giữa các nhóm và phương pháp LSD được sử dụng để so sánh nhiều nhóm giữa các nhóm, với P<0 05 indicating statistical significance.

2 Kết quả và Phân tích

2.1 Biến đổi hình thái tế bào biểu mô ống thận thỏ do H2O2 gây ra

Sau khi các tế bào biểu mô ống thận thỏ được xử lý với các nồng độ H2O2 khác nhau trong 24 giờ, hình thái của các tế bào biểu mô ống thận thỏ được quan sát dưới kính hiển vi, như thể hiện trong Hình 1. Với sự gia tăng nồng độ H2O2, số lượng tế bào với sự biến đổi hình thái tăng dần, số tế bào bám vào tế bào thành giảm dần, một số tế bào dài ra, độ bóng tế bào giảm, kích thước giảm. Nồng độ H2O2 đạt 550 μ Mol · L-1, sợi trục biến mất, màng tế bào bị vỡ, tế bào co lại, khoảng trống tế bào tăng lên và xuất hiện khoảng trống giữa các mảng tế bào.

Hình 1 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến hình thái thỏRTEC( 100 × )

2.2 Ảnh hưởng của 2.2 H2O2 đến sự tăng sinh tế bào biểu mô ống thận thỏ

Sử dụng các tế bào biểu mô ống thận thỏ được xử lý bằng 350, 400, 450, 500 và 550 μ Mol · L-1 H2O2 trong 24 giờ và độ hấp thụ được đo bằng phương pháp MTT. Kết quả cho thấy các nồng độ khác nhau của H2O2 có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào biểu mô ống thận thỏ, với giá trị IC50 là 439 07 μ mol·L － 1, 500 μ Tác dụng ức chế của H2O2 với mol·L -1 về sự tăng sinh tế bào có thể đạt trên 50 phần trăm sau 24 giờ, vì vậy nồng độ này đã được chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

2.3 Ảnh hưởng của 2.3 H2O2 đến sự giải phóng LDH ở tế bào biểu mô ống thận thỏ

Sau 24 giờ xử lý H2O2 trên tế bào biểu mô ống thận thỏ, giá trị OD của phản ứng LDH trong dịch nổi phía trên tế bào và dịch ly giải tế bào được đo bằng phương pháp phát hiện độc tính tế bào không phóng xạ và tính toán sự giải phóng LDH từ tế bào. Các kết quả được thể hiện trong Bảng 1. Các nồng độ H2O2 khác nhau có thể gây ra sự gia tăng giải phóng LDH từ các tế bào biểu mô ống thận của thỏ và nồng độ H2O2 càng cao thì sự giải phóng LDH theo cách phụ thuộc vào nồng độ càng lớn. H2O2 ở nồng độ 400 mmol · L-1 làm cho tế bào giải phóng LDH vượt quá nhóm trắng hơn 50 phần trăm , dẫn đến tổn thương tế bào nghiêm trọng.

Chuyển hướng. 1 Tác dụng của H2O2 đối với việc giải phóng LDH từ RTEC thỏ

Lưu ý: So với nhóm đối chứng trống, *P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 Kết quả nhuộm huỳnh quang AO/EB của tế bào biểu mô ống thận thỏ được xử lý bằng 2.4 H2O2

Sau khi các tế bào biểu mô ống thận thỏ được xử lý bằng H2O2 trong 24 giờ, các tế bào này được nhuộm huỳnh quang AO/EB, như thể hiện trong Hình 2. Người ta sơ bộ đánh giá rằng cơ chế hoạt động của H2O2 trên các tế bào biểu mô ống thận thỏ chủ yếu là để gây hoại tử. Các nồng độ H2O2 khác nhau có thể gây ra các mức độ hoại tử khác nhau trong các tế bào biểu mô ống thận của thỏ, với nồng độ H2O2 nhỏ hơn 400 μ Ở mol · L-1, chất nhiễm sắc nhân co lại thành một vòng tròn có màu lục, chủ yếu được đánh giá là chết rụng sớm. Khi nồng độ H2O2 tăng lên hơn 450 μ At mol · L-1, các tế bào có dạng hạt không tròn màu đỏ cam và số lượng tế bào hoại tử tăng lên theo cách phụ thuộc vào nồng độ.

2.5 Ảnh hưởng của 2.5 Cistanche Deserticola đối với sự tăng sinh H2O2-của các tế bào biểu mô ống thận thỏ

Nghiên cứu thực nghiệm về Cistanche Deserticola

Tỷ lệ sống sót của các tế bào biểu mô ống thận thỏ dưới các nồng độ khác nhau (2, 20, 200 mg! L-1) nước và chiết xuất rượu từ Cistanche Deserticola cho thấy không có sự khác biệt đáng kể so với các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện bình thường mà không có sự can thiệp. Như thể hiện trong Hình 3, so với nhóm mô hình, nhóm chiết xuất cồn và nước nồng độ cao từ Cistanche Deserticola làm giảm đáng kể tác dụng ức chế của H2O2 đối với sự tăng sinh của tế bào biểu mô ống thận thỏ (P.<0 01).

Hình 2 nhuộm AO/EB của thỏRTEC được xử lý bằng các nồng độ H2O2 khác nhau ( 100 × )

Lưu ý: So với nhóm người mẫu, *P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Hình 3 Ảnh hưởng của C． Deserticola về sự ức chế H2O2 － thỏ gây raRsự phát triển của TEC

2.6 Ảnh hưởng của 2.6 Cistanche Deserticola đối với tổn thương do H2O2 gây ra đối với tế bào biểu mô ống thận thỏ

Kết quả về tác động lên sự giải phóng LDH trong tế bào được thể hiện trong Hình 4. Các nhóm chiết xuất ethanol và chiết xuất nước của Cistanche Deserticola nồng độ cao, trung bình và thấp dẫn đến sự giải phóng LDH thấp hơn đáng kể trong các tế bào biểu mô ống thận thỏ sau khi H2O2 điều trị hơn ở nhóm mô hình (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Lưu ý: So với nhóm người mẫu, *P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Hình 4 Ảnh hưởng của C． Deserticola trên H2O2 － gây ra sự giải phóng LDH từ thỏRTEC

3 Thảo luận

Cistanche Deserticola, được gọi là "nhân sâm sa mạc", có giá trị y học cực cao và là một loại thuốc bổ nổi tiếng của Trung Quốc. “Thần nông dược liệu kinh điển” [7] mô tả thượng phẩm dược là: “Thượng dược... chủ yếu dưỡng sinh ứng thiên, không độc, nên uống thường xuyên sẽ không hại người…” Cistanche Deserticola được xếp vào loại thuốc thượng phẩm, có vị ngọt nhạt, tính ôn. “Danh y danh gia” [8] chỉ ra rằng Cistanche Deserticola có vị “chua, mặn và không độc”. Sau đó, các ghi chép về tính chất, hương vị và kinh mạch của Cistanche Deserticola trong các triều đại y học thảo dược Trung Quốc khác nhau là nhất quán. Tính hơi ấm, vị ngọt chua, mặn, thuộc kinh can thận và ruột già. Theo truyền thống được sử dụng cho thận dương thiếu hụt, đau thắt lưng và đầu gối, yếu cơ và xương, tác dụng dược lý và cơ chế của nó luôn là trọng tâm nghiên cứu. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã chỉ ra rằng Cistanche Deserticola có thể chống lão hóa, cải thiện khả năng học tập và trí nhớ, đồng thời điều chỉnh các chức năng miễn dịch. Nó được sử dụng rộng rãi trong các đơn thuốc lâm sàng của y học cổ truyền Trung Quốc, thuốc bằng sáng chế truyền thống của Trung Quốc, các chế phẩm đơn giản và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

bổ sung cistanche gần tôi

Stress oxy hóa là nguyên nhân chính gây ra một số bệnh chính, do sự mất cân bằng giữa hình thành và loại bỏ các loại oxy phản ứng trong cơ thể, dẫn đến tổn thương oxy hóa ở một mức độ nhất định đối với mô bào. Vì vậy, nghiên cứu sâu về cơ chế phản ứng của stress mới có thể tìm ra phương pháp hợp lý để phòng ngừa, cải thiện thậm chí loại bỏ bệnh cáu kỉnh một cách hiệu quả. Căng thẳng oxy hóa có thể dẫn đến quá trình oxy hóa tế bào và protein khác nhau trong cơ thể [9], và H2O2 được chọn là một trong những chất ngoại sinh gây hại trong nghiên cứu. Nó có tác dụng mạnh trong việc gây peroxid hóa lipid, gây ra các phản ứng peroxid hóa lipid chuỗi, dẫn đến quá trình chết theo chương trình và rối loạn chức năng của tế bào. Hiện tại, nghiên cứu về độc tính trên thận của chất ngoại sinh này và tác dụng đối kháng của nó chủ yếu dựa vào việc thiết lập các mô hình động vật và có rất ít tài liệu báo cáo về việc thiết lập các mô hình in vitro cho các nghiên cứu liên quan. So với các mô hình gây độc cho thận trên động vật, mô hình tế bào gây độc cho thận trong ống nghiệm có những ưu điểm như mục tiêu tác dụng rõ ràng, chu kỳ dùng thuốc ngắn và liều lượng thấp.

cistache thảo mộc Trung Quốc

Nghiên cứu mô hình tế bào gây độc thận in vitro do các chất ngoại sinh gây ra thông qua sự thay đổi hình thái tế bào, tác dụng ức chế của các chất ngoại sinh đối với sự tăng sinh tế bào và thay đổi quá trình giải phóng LDH của tế bào. Nồng độ H2 O2 khác nhau có tác động rõ rệt đến sự biến đổi hình thái của tế bào. Khi nồng độ các chất ngoại sinh tăng lên, người ta thấy rằng số lượng biến dạng tế bào tăng lên. Xét nghiệm MTT là một phương pháp thường được sử dụng để phát hiện số lượng tế bào sống. Trong các thí nghiệm trong đó các nồng độ khác nhau của Cistanche Deserticola bảo vệ các tế bào biểu mô ống thận của thỏ khỏi sự phá hủy của H2O2, các nồng độ khác nhau của Cistanche Deserticola làm giảm đáng kể tỷ lệ ức chế H2O2 trên các tế bào biểu mô ống thận của thỏ, và nó phụ thuộc vào nồng độ. Khi màng tế bào bị tổn thương, LDH nội bào sẽ được giải phóng vào môi trường nuôi cấy, Hàm lượng LDH trong môi trường nuôi cấy tế bào là một chỉ số quan trọng để phát hiện tế bào chết. Nghiên cứu này phát hiện ra rằng mức LDH trong môi trường nuôi cấy tế bào của nhóm mô hình có H2O2-gây tổn thương tế bào biểu mô ống thận thỏ tăng lên đáng kể, trong khi mức LDH trong nhóm thử nghiệm được điều trị bằng các nồng độ Cistanche Deserticola khác nhau tăng đáng kể giảm theo cách phụ thuộc vào nồng độ.Kết quả nghiên cứu cho thấy việc thiết lập mô hình H2O2-gây ra tổn thương tế bào biểu mô ống thận thỏ và khám phá sơ bộ tác dụng bảo vệ của chiết xuất Cistanche Deserticola đối với tế bào biểu mô ống thận, không chỉ đặt nền tảng cho nghiên cứu về tổn thương tế bào gây ra bởi stress oxy hóa mà còn cung cấp dữ liệu cơ bản cho sự phát triển và sử dụng Cistanche Deserticola.

thẩm quyền giải quyết:

［1］ Ch. P(2015) Tập Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ Kim JH,Choi W,Lee JH,et al. Astaxanthin ức chế H2O2 － làm chết tế bào apoptotic qua trung gian ở các tế bào tiền thân thần kinh của chuột thông qua điều biến các con đường truyền tín hiệu p38 và MEK［J］． Công nghệ sinh học Microbiol,2009,19( 11): 1355 － 1363.

［3］ Tiểu PM,Vương Y,Luôn SE. Tín hiệu chết theo chương trình gây ra bởi H2 O2 － stress oxy hóa qua trung gian trong các ống myo C2 Cl2 khác biệt［J］． Life Sci,2009,84( 13): 468 － 481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing, v.v. ］. Tạp chí Sinh học Nông nghiệp Miền núi, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei, et al Nghiên cứu về tác dụng của ipriflavone đối với hoạt động của hủy cốt bào và sự tăng sinh và biệt hóa của nguyên bào xương ［J ］. Tạp chí Sinh học Nông nghiệp Miền núi, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang, et al Phát hiện quá trình chết theo chương trình do paclitaxel gây ra trong các tế bào khối u vú ở chó in vitro bằng phương pháp nhuộm kép AO/EB [J]. Khoa học và Công nghệ Chăn nuôi và Thú y Quảng Đông, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG,Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Bắc Kinh: Xueyuan Press,2013: 73.

［8］ Tao HJ,Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Bắc Kinh: Nhà xuất bản Y học Nhân dân, 1986: 51.

［9］ Cash TP,Pan Y,Simon M C. Ｒloại oxy hoạt tính và cảm biến oxy tế bào［J］． Miễn phí Ｒadic Biol Med,2007,43( 9): 1219 － 1225．