Hiệu quả và cơ chế của hợp chất sợi Angelica Sinensis Cistanche để giảm táo bón

Trừu tượng:Táo bónlà một căn bệnh phổ biến có thể ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng cuộc sống của con người và làm tăng một số nguy cơ mắc bệnh liên quan. Trong nghiên cứu này, mô hình chuột bị táo bón mãn tính đã được thiết lập bằng cách sử dụng loperamid hydrochloride. Chuột được cho ăn Hợp chất sợi Angelica sinensis Cistanche, bao gồm Đặng Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Nhu Công Rồng (Cistanche DeserticolaY.C.Ma), chất xơ lúa mì và xylan có trọng lượng phân tử thấp ở liều lượng cao (3,6 g·kg-1, gấp 30liều khuyến cáo cho người) và liều lượng thấp (0,6 g·kg{{8} }, gấp 5 lần liều khuyến cáo ở người) trong 14 ngày. Nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả điều trị của hợp chất bằng cách quan sát hình thái phân, đo hàm lượng nước và tiến hành các thí nghiệm về nhu động ruột non. Hơn nữa, các xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) đã được tiến hành để đánh giá nồng độ trong huyết thanh của các hormone đường tiêu hóa bao gồm motilin (MTL), gastrin (GAS), các yếu tố gây viêm interleukin-1 (IL-1 ) và yếu tố hoại tử khối u - (TNF- ). Kiểm tra mô bệnh học bằng nhuộm H&E được sử dụng để đánh giá tổn thương mô đại tràng. Ngoài ra, các thí nghiệm Western blot và hóa mô miễn dịch đã được tiến hành để kiểm tra mức độ biểu hiện của aquaporin-3 (AQP3) và c-Kit trong đại tràng. Kết quả chỉ ra rằng Hợp chất sợi Angelica sinensis Cistanche có thể cải thiện hình thái phân, tăng hàm lượng nước trong phân và tăng cường tốc độ vận chuyển qua ruột non ở chuột. Ngoài ra, có sự gia tăng đáng kể nồng độ hormone tiêu hóa trong huyết thanh và giảm đáng kể nồng độ các yếu tố gây viêm. Sự cải thiện tổn thương mô bệnh học ở đại tràng đi kèm với sự giảm đáng kể biểu hiện của protein kênh nước AQP3 ở đại tràng và sự gia tăng đáng kể biểu hiện c-Kit. Những kết quả này gợi ý chung về sự tồn tại của mối quan hệ giữa liều lượng và phản ứng. Những phát hiện này chỉ ra rằng Hợp chất sợi Angelicasinensis Cistanche làm giảm táo bón ở chuột một cách hiệu quả. Hoạt động của nó có liên quan đến việc điều hòa biểu hiện protein AQP3 và c-Kit trong kênh nước đại tràng, cùng với việc điều chỉnh các yếu tố gây viêm trong huyết thanh và hormone đường tiêu hóa. Thí nghiệm này đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức thí nghiệm động vật của Đại học Tế Nam.

Từ khóa:táo bón; bôi trơn đường ruột và giảm táo bón; thực phẩm chức năng; Đại tràng; y học cổ truyền Trung Quốc

MẤT BAO LÂU ĐỂ CISTANCHE CÓ HOẠT ĐỘNG?

Táo bónlà mộtbệnh đường tiêu hóa thường gặp. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 tuổi) là 18,9%[1], tỷ lệ mắc bệnh thường cao hơn ở phụ nữ[2]. Nó được đặc trưng bởi khó khăn trong việc đại tiện và táo bón thường xuyên. phân giảm và cứng lại,… dẫn đến cảm giác khó chịu về thể chất, rối loạn chức năng đường tiêu hóa, thậm chí gây ra hoặc làm trầm trọng thêm các bệnh về đường tiêu hóa, bệnh tim mạch [3], v.v., ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống. Các bài thuốc y học cổ truyền Trung Quốc được sử dụng rộng rãi để cải thiện táo bón và có tác dụng lâm sàng tốt và rõ ràng [4,5]. Hợp chất sợi Angelica và Cistanche Deserticola được sử dụng trong nghiên cứu này được điều chế từ Cistanche Deserticola, Angelica sinensis, sợi lúa mì và xylooligosaccharides. Cistanche Deserticola và Angelica sinensis là hai loại thuốc cổ truyền Trung Quốc thường được sử dụng trong thuốc nhuận tràng, có tác dụng điều hòa chức năng đường ruột và cải thiện tình trạng táo bón. [6-9], hai loại thuốc cổ truyền của Trung Quốc có cùng nguồn gốc là thuốc và thực phẩm ở nước tôi. Việc sử dụng kết hợp của chúng có thể đạt được tác dụng bổ sung khí huyết và điều hòa âm dương. Chất xơ lúa mì rất giàu chất xơ không hòa tan và hòa tan, có thể thúc đẩy nhu động ruột và đại tiện, thường được dùng làm thuốc phụ để điều trị táo bón; xylo-oligosacarit là một oligosacarit chức năng có thể điều chỉnh hệ thực vật đường ruột, từ đó kích thích nhu động ruột. , tăng độ ẩm cho phân [10], phối hợp tứ vị, trị tận gốc căn bệnh. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của hợp chất sợi bạch chỉ và cistanche Deserticola này trên chuột bị táo bón và khám phá cơ chế hoạt động có thể có của nó.

Nguyên liệu và phương pháp

Động vật thí nghiệm: 40 con chuột Côn Minh đực loại không có mầm bệnh (SPF), từ 4 đến 5 tuần tuổi, được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Động vật Thực nghiệm Weitong Lihua Bắc Kinh, số giấy phép SCXK (Quảng Đông) 2021-0011, The nhiệt độ môi trường 22 ± 2 độ, độ ẩm 50% ± 10%, chu kỳ ngày đêm là 12h/12h. Các quy trình và quy trình thí nghiệm tuân thủ các nguyên tắc đạo đức về sử dụng và chăm sóc động vật và đã được Ủy ban đạo đức thí nghiệm động vật của Đại học Tế Nam phê duyệt.

Chất thử: Chế phẩm hợp chất sợi Angelica sinensis và Cistanche Deserticola được làm từ Angelica Sinensis và Cistanche Deserticola, được chiết xuất bằng nước, cô đặc, sấy khô và nghiền nát để thu được bột nhão khô (hiệu suất dán là 52,95%). Bột dán khô được trộn với sợi lúa mì và xylo-oligosacarit để sử dụng sau. Angelica sinensis (số lô 230404CP108) và Cistanche Deserticola (số lô 230303CP109) được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Hà Bắc Wanxiu và đã được thử nghiệm tuân thủ phiên bản 2020 của Dược điển Trung Quốc. Xylo-oligosacarit được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Shandong Bailong Chuangyuan. Số lô là 20210829026 và việc kiểm tra tuân thủ GB / T35545; chất xơ lúa mì đến từ J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG và số lô là 07501230126. Dựa trên một người trưởng thành nặng 60 kg, liều lượng khuyến nghị của hợp chất sợi bạch chỉ và cistanche cho con người là 7,118 g·d-1 , trong đó liều lượng chất xơ lúa mì là 3,5g·d-1. Khả năng tương thích của hợp chất này là bạch chỉ: cistanche: sợi lúa mì: xylooligosacarit=2:2:3:2 (liều lượng của các miếng thuốc sắc dựa trên thuốc thô). Uống gấp 30 lần liều lượng khuyến nghị cho người ở nhóm dùng liều cao và gấp 5 lần liều lượng khuyến nghị cho người ở nhóm liều thấp, lần lượt là 3,6 và 0,6 g·kg-1·d-1. Chuẩn bị huyền phù với nước tinh khiết, trộn đều và đặt sang một bên.

Thuốc và thuốc thử Loperamid Hydrochloride (loperamid, LOP), thông số kỹ thuật: Mỗi viên chứa loperamid hydrochloride

Amin 2 mg, 12 viên/hộp, số lô sản phẩm: MIJ3102, mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Xi'an Janssen; Viên nén Mosapride Citrate (Quali), quy cách: Mỗi viên chứa 5 mg Mosapride Citrate, 24 viên/hộp, số lô sản phẩm: 25220603, được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Lunan Beite; bột than hoạt tính, đặc điểm kỹ thuật: bột màu nâu lưới 200, số lô A805337, được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh hóa McLean Thượng Hải; kẹo cao su arabic, đặc điểm kỹ thuật: bột, số lô A108975, được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh hóa Aladdin Thượng Hải.

Ethanol tuyệt đối (Nhà máy thuốc thử hóa học Thiên Tân Damao, 64-17-5); Amoni Persulfate (Công ty TNHH Công nghệ sinh hóa Thượng Hải McLean, A6295-500g); Tris-Base (FD2010), dung dịch đệm 5× (FD002), kháng thể -actin (FD0060), kháng thể thứ cấp chống thỏ (FDR007), kháng thể thứ cấp chống chuột (FDM007) và bộ phát triển màu ECL (FD8020) đều được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Hàng Châu Fude; Dung dịch đệm ly giải RIPA ( Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% paraformaldehyde (Công ty Biosharp, BL539A); Bộ hóa mô miễn dịch (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Giang Tô KGI, KGOS60); Bộ định lượng protein axit bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilin (MTL), gastrin (GAS), và các yếu tố gây viêm interleukin-1 (IL-1 ), yếu tố hoại tử khối u ( yếu tố hoại tử khối u- , TNF- ) Bộ ELISA (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Enzyme Thượng Hải ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); kháng thể aquaporin 3 (aquaporin 3, AQP3) (Công ty Affinity, AF5222); Kháng thể c -Kit (Công nghệ tín hiệu tế bào, 3074S).

Thiết bị: Máy đo nước siêu tinh khiết (Millipore Company, USA, Milli Q); Cân điện tử (Sartorius, Đức)

Công ty, BS224S); Cân phân tích điện tử (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Máy ly tâm lạnh tốc độ cao (Công ty Sigma, Đức, 3K15); Đầu đọc vi bản (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); Công ty microtome paraffin (Leica, Đức), RM2255); Bể kim loại có nhiệt độ không đổi (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Máy nghiền nhanh mẫu hoàn toàn tự động (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Thiết bị điện di (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Liuyi Bắc Kinh, DYY-6C); kính hiển vi quét (Công ty Precipoint, Precipoint M8); hệ thống hình ảnh phát quang hóa học (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Phân nhóm và thiết lập mô hình: 40 con chuột được nuôi thích nghi trong 5 ngày và sau đó được chia ngẫu nhiên thành các nhóm đối chứng âm tính.

(đối chứng), nhóm mô hình (LOP), nhóm phối hợp liều cao và thấp (LOP+PF-H, OP+PF-L), nhóm đối chứng dương tính (mosapride citrate, LOP+MOS). Vào lúc 9 đến 10 sáng hàng ngày, tất cả các nhóm ngoại trừ nhóm đối chứng âm tính được cho uống 10 mg·kg-1 loperamid hydrochloride bằng ống thông để thiết lập mô hình táo bón ở chuột và nhóm đối chứng âm tính được cho một lượng nước tinh khiết bằng nhau bằng ống thông. Từ 14 đến 15 giờ, nhóm dùng liều cao và liều thấp lần lượt được dùng hợp chất 3,6 và 0,6 g·kg-1, còn nhóm đối chứng dương tính được dùng mosapride citrate (MOS) 5 mg·kg{{ 19}}.

, nhóm đối chứng âm và nhóm đối chứng mẫu được cung cấp lượng nước tinh khiết bằng nhau qua ống thông trong 14 ngày liên tiếp.

Tình trạng và đặc điểm phân của chuột được quan sát và ghi nhận trong thời gian can thiệp bằng thuốc. Tình trạng cơ bản và phân của chuột trong mỗi nhóm được ghi lại.

Nhân vật, cân 3 lần một tuần và điều chỉnh liều lượng. Vào các ngày thứ 3, 7, 10 và 14 sau khi dùng thuốc, 3 đến 4 viên phân tươi của mỗi con chuột được thu thập, cân ngay lập tức và ghi lại là trọng lượng ướt, sấy khô trong lò và ghi lại là trọng lượng khô và độ ẩm của phân. nội dung đã được tính toán. Tính độ ẩm trong phân (%)=(trọng lượng ướt - trọng lượng khô)/trọng lượng ướt × 100%.

Việc xác định chức năng đẩy của ruột non được thực hiện theo các phương pháp thí nghiệm theo yêu cầu của tài liệu tham khảo [11] và "Phương pháp kiểm tra và đánh giá chức năng chức năng của thực phẩm sức khỏe (Phiên bản 2023)". Sau liều cuối cùng, chuột trong mỗi nhóm được nhịn ăn và không uống nước trong 16 giờ. Nhóm mẫu, công thức hỗn hợp Nhóm dùng liều cao, nhóm dùng liều thấp và nhóm đối chứng dương tính được cho hỗn dịch loperamid hydrochloride (10 mg·kg-1) qua ống thông, và nhóm đối chứng âm tính được cho uống hỗn dịch lượng nước tinh khiết bằng nhau bằng ống thông. 0.5 giờ sau, nhóm dùng liều cao, liều thấp và nhóm đối chứng dương tính được cấp mực (chứa 5%) chứa liều lượng mẫu thử tương ứng (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1) tương ứng. (bột than hoạt tính, 10% gum arabic) và lượng mực tương đương được dùng cho nhóm âm bản và nhóm người mẫu. Các con vật bị giết ngay sau 0,5 giờ do trật khớp cổ tử cung và đo "tổng chiều dài của ruột non" và "chiều dài tiến lên của mực". Tính tốc độ đẩy mực=chiều dài đẩy mực (cm)/tổng ​​chiều dài ruột non (cm) × 100%.

Để phát hiện nồng độ MTL, GAS, TNF- và IL-1 trong huyết thanh, máu được lấy từ nhãn cầu chuột, ly tâm ở 4 độ , 3 500 r·min-1 trong Sau 10 phút, lấy huyết thanh phía trên và xác định MTL và GAS trong huyết thanh chuột theo bộ ELISA. và mức độ TNF- , IL{7}}.

H&E phát hiện những thay đổi bệnh lý trong mô đại tràng. Đại tràng chuột được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và ủ trong dung dịch paraformaldehyde 4%.

Chúng được cố định trong aldehyd, nhúng thường xuyên sau 24 giờ, cắt nhỏ, nướng và nhuộm H&E, và những thay đổi bệnh lý của mô ruột kết được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng.

Phương pháp hóa mô miễn dịch được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của AQP3 và c-Kit trong mô ruột kết. Các mô ruột của chuột từ mỗi nhóm đã được thu thập.

Cắt paraffin, tẩy sáp, hydrat hóa, thu hồi kháng nguyên, ngăn chặn catalase nội sinh, ngăn chặn bằng huyết thanh dê 2%, thêm kháng thể AQP3 và c-Kit tương ứng, và ủ qua đêm ở 4 độ, dung dịch muối đệm phốt phát, PBS) trong 5 phút nhuộm tương phản Hematoxylin, gradient khử nước ethanol, độ trong suốt của xylene, bịt kín kẹo cao su trung tính, quét dưới kính hiển vi quét và sử dụng phần mềm Image J để phân tích kết quả.

Phương pháp Western blot được sử dụng để phát hiện biểu hiện của AQP3 và c-Kit trong mô ruột kết. Lấy 10 mg mô ruột chuột đông lạnh và cho vào ống ly tâm với 150 µL dung dịch đệm ly giải RIPA chứa 1% chất ức chế protease. Sử dụng máy xay nhanh để đồng nhất mô. , ly tâm chất đồng nhất bằng máy ly tâm nhiệt độ thấp ở tốc độ 10 000 r·min-1 trong 10 phút, lấy phần nổi phía trên, xác định nồng độ protein bằng phương pháp định lượng protein BCA, trộn với dung dịch đệm nạp, làm biến tính protein và phân tích kết quả theo từng mẫu. Protein 30 ug được nạp, điện di SDS-PAGE, chuyển ướt sang màng, sau đó được chặn bằng sữa bột gầy 5% ở nhiệt độ phòng trong 1,5 giờ, rửa ba lần bằng TBST, đặt kháng thể chính vào máy lắc và ủ qua đêm 4 độ, lấy ra và rửa bằng đệm TBST Rửa 3 lần bằng dung dịch, ủ với kháng thể thứ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng rồi rửa 3 lần bằng TBST. Giải pháp phát quang hóa học ECL được sử dụng để phát triển màu sắc và hệ thống hình ảnh phát quang hóa học hoàn toàn tự động được sử dụng để phát triển. Phần mềm Image J được sử dụng để phân tích kết quả.

Phương pháp thống kê Tất cả số liệu liên quan đến thí nghiệm này được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. GraphPad Prism được sử dụng để vẽ đồ thị dữ liệu thử nghiệm và so sánh giữa các nhóm được thực hiện bằng ANOVA một chiều hoặc ANOVA hai chiều; khi sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê, phương pháp khác biệt ít ý nghĩa nhất (LSD) đã được sử dụng. ) Thực hiện so sánh theo cặp giữa các nhóm và P < 0,05 được coi là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.