Epigallocatechin -3- Gallate thúc đẩy sự trưởng thành trong ống nghiệm và phát triển phôi sau khi thụ tinh ống nghiệm của tế bào trứng lợn Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Mục đích:Epigallocatechin -3- gallate (EGCG) là một thành phần chính của catechin polyphenol và có tác dụng bảo vệ vì đặc tính chống oxy hóa mạnh của nó. Theo những gì chúng tôi biết, vẫn còn thiếu các nghiên cứu có hệ thống về ảnh hưởng của EGCG đối với sự trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) và thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) của tế bào trứng lợn. Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của EGCG đối với thụ tinh ống nghiệm và thụ tinh ống nghiệm của tế bào trứng lợn.

Phương pháp:Các tế bào trứng của lợn được xử lý với các nồng độ khác nhau của EGCG (5,10 và 20 uM), và sự mở rộng tế bào tích, tỷ lệ trưởng thành của tế bào trứng, các loại oxy phản ứng (ROS), glutathione (GSH) và malondialdehyde (MDA), tổng khả năng chống oxy hóa là xác định. Mức độ biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến stress oxy hóa và quá trình apoptosis được xác định bằng PCR thời gian thực định lượng. Tỷ lệ phân cắt và tỷ lệ phôi bào của tế bào trứng sau khi điều trị 10 uM EGCG trong IVM và IVF cũng được đánh giá. Kết quả: EGCG ở 5, 10 và 20 uM thúc đẩy đáng kể sự mở rộng tế bào tích, và EGCG ở 10 uM làm tăng tỷ lệ trưởng thành của tế bào trứng. Điều trị bằng EGCG （10 μM） làm giảm mức ROS và MDA, đồng thời tăng khả năng chống oxy hóa và nồng độ GSH trong tế bào trứng trưởng thành. Kết quả qRT-PCR cho thấy điều trị bằng EGCG điều chỉnh sự biểu hiện mRNA của catalase, glutathione peroxidase và superoxide dismutase trong tế bào trứng trưởng thành. Ngoài ra, điều trị bằng EGCG cũng làm giảm mức độ biểu hiện mRNA của Bax và caspase -3 và tăng mức độ biểu hiện mRNA Bcl -2 trong tế bào trứng trưởng thành. Ngoài ra, tỷ lệ phân cắt và tỷ lệ phôi bào của tế bào trứng được xử lý với 10uM EGCG trong IVM và IVF cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng.

Sự kết luận:Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng EGCG thúc đẩy quá trình trưởng thành trong ống nghiệm và phát triển phôi sau khi thụ tinh ống nghiệm của tế bào trứng lợn. Tác dụng bảo vệ của EGCG đối với tế bào trứng có thể liên quan đến các đặc tính chống oxy hóa và chống quá trình chết rụng của nó. Từ khóa: EGCG, tế bào trứng lợn, IVM, chất chống oxy hóa, chống quá trình chết rụng, IVF

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Giới thiệu

Quá trình trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) của tế bào trứng là một bước quan trọng trong quá trình tạo phôi trong ống nghiệm cho vật nuôi. Tế bào từ IVM có khả năng thụ tinh và phát triển thành phôi, trong khi tỷ lệ phát triển thành công của phôi từ tế bào trứng IVM thấp hơn so với tế bào noãn noãn đã bão hòa in vivo. Sự trưởng thành của tế bào trứng đòi hỏi cả sự trưởng thành của tế bào chất và nhân, và sự trưởng thành tế bào chất không chính xác đã được cho là góp phần vào khả năng phát triển kém của tế bào trứng IVM. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp là điều cần thiết để tế bào trứng thành công IVM4 Epigallocatechin -3- gallate (EGCG) là một trong những hợp chất hoạt tính sinh học chính trong trà xanh và thuộc về catechin polyphenol. được biết đến với vai trò của nó trong việc chelat hóa các kim loại chuyển tiếp và do đó làm giảm mức độ stress oxy hóa.5 Các nghiên cứu thực nghiệm in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng EGCG sở hữu các chức năng sinh học khác nhau bao gồm ngăn ngừa tổn thương nhiễm sắc thể do các loài oxy phản ứng (ROS), các hoạt động kháng khuẩn, chống - Hoạt động của khối u và ức chế quá trình tạo mỡ.5 Trong IVMoocytes, Huang và cộng sự đã chỉ ra rằng EGCG trong môi trường IVM có thể làm giảm mức ROS và quá trình chết rụng trong tế bào trứng của bò và tăng sự mở rộng tế bào tích. Roth và cộng sự đã chỉ ra rằng tiêm chất chống oxy hóa EGCG vào màng bụng giúp cải thiện khả năng phát triển và chất lượng của phôi phát triển từ tế bào trứng được xử lý nhiệt độ cao ở chuột. Gadani và cộng sự đã chỉ ra rằng việc bổ sung EGCG vào tinh trùng lợn rừng đã được rã đông đã cải thiện khả năng thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) .8 Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây của Bucci và cộng sự đã chứng minh rằng việc bổ sung EGCG vào môi trường rã đông không cải thiện được chất lượng tinh trùng của chó hoặc khả năng liên kết zona. 10 Theo những gì chúng tôi biết, vẫn còn thiếu các nghiên cứu có hệ thống về ảnh hưởng của EGCG đối với thụ tinh ống nghiệm và thụ tinh ống nghiệm của tế bào trứng lợn. Liệu EGCG có thể được sử dụng như một chất chống oxy hóa hiệu quả cho tế bào trứng lợn nuôi trong ống nghiệm hay không vẫn còn được khám phá. Ảnh hưởng của EGCG đối với thụ tinh ống nghiệm và thụ tinh ống nghiệm của tế bào trứng lợn đã được nghiên cứu một cách có hệ thống. Ngoài ra, mức độ ROS, khả năng chống oxy hóa, mức độ biểu hiện mRNA của gen liên quan đến quá trình chống oxy hóa và apoptosis trong tế bào trứng được xác định bằng các xét nghiệm in vitro.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Tài liệu và Phương pháp Tuyên bố Đạo đức

Công việc này đã được sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức về Thí nghiệm Động vật của Đại học Nông nghiệp Nam Trung Quốc.

Điều trị bằng EGCG

Hợp chất EGCG được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, Hoa Kỳ) và được chuẩn bị ở dạng nồng độ gốc 1 mM bằng cách sử dụng môi trường M -199 (Sigma-Aldrich). Để xác định ảnh hưởng của EGCG đến chỉ số giãn nở tích lũy và tỷ lệ trưởng thành trong ống nghiệm của tế bào trứng và sản xuất ROS của tế bào trứng, các nồng độ khác nhau của EGCG (0, 5,1 0 và 2 {{ 16}} uM) được bổ sung trong môi trường IVM (môi trường M -199 được bổ sung với 1 0 phần trăm huyết thanh bò thai, 10 phần trăm dịch nang lợn, 0,57 mM cysteine, 10 ng / mL yếu tố tăng trưởng biểu bì, 10 IU / mL gonadotrophin huyết thanh ngựa cái mang thai và 10IU / mL gonadotrophin màng đệm người). Để xác định ảnh hưởng của EGCG lên tổng khả năng chống oxy hóa, hàm lượng glutathione (GSH), mức malondialdehyde (MDA) và mức độ biểu hiện mRNA, EGCG (0 và 10 uM) đã được bổ sung vào môi trường IVM. Để xác định ảnh hưởng của EGCG đối với tiềm năng phát triển của tế bào trứng, EGCG （0 và 10 μM） được bổ sung trong IVM và / hoặc IVF, hoặc trong IVM và / hoặc IVC.

Thu thập noãn bào và trưởng thành trong ống nghiệm

Buồng trứng được lấy từ những con lợn con được giết mổ tại một lò mổ địa phương (Lò mổ Kongwangji Quảng Châu, Quảng Châu, Trung Quốc) và được chuyển đến phòng thí nghiệm trong 0. 9% nước muối ở 37 độ trong vòng 2 giờ. Dịch nang từ các nang antral 3-8 mm được hút bằng một ống tiêm có gắn kim đo 18-. Như đã mô tả trước đây, 'khoảng 50 phức hợp tế bào tích （COC） được nuôi cấy trong 500 μL môi trường (IVM), phủ dầu khoáng và nuôi cấy trong 44 giờ ở 38,5 độ C trong tủ ấm 5% CO, có không khí ẩm.

Đánh giá sự mở rộng của Cumulus và IVM của Oocytes

Sự giãn nở tích lũy được ghi lại ở 44 giờ của IVM. Đánh giá đã được che mắt để loại bỏ sự thiên vị. Mức độ mở rộng tích lũy cho mỗi COC được đánh giá theo một hệ thống tính điểm chủ quan trên thang điểm 0-4, trong đó 0 cho biết không có sự mở rộng, 1 cho biết sự mở rộng tối thiểu có thể quan sát được, 2 cho biết sự mở rộng bên ngoài các lớp tế bào tích, 3 biểu thị sự mở rộng của tất cả các lớp tế bào vũ tích ngoại trừ bức xạ hào quang và 4 biểu thị sự mở rộng hoàn toàn của tất cả các lớp tế bào tích.12 Điểm trung bình (0. 0-4. {{10} }) cho mỗi nhóm, trong mỗi bản sao (4-6 bản sao), sau đó được tính toán để thu được một giá trị được gọi là chỉ số mở rộng tích lũy. Sự đùn của thể cực đầu tiên trong tế bào trứng được xác định dưới kính hiển vi ánh sáng. Tế bào trứng được phân loại như sau: chưa trưởng thành (không đạt tới chuyển hình), trưởng thành (có đĩa chuyển hình I và thể phân cực), và bất thường (bất kỳ sai lệch nhiễm sắc thể nào như lưỡng bội, chuyển dạng bất thường I, trục xoay đa hướng và phân tán nhiễm sắc thể). Tỷ lệ trưởng thành của tế bào trứng được tính như sau: một số tế bào trứng chín / tổng số tế bào trứng được kiểm tra x 100 phần trăm.

Xác định mức ROS

Để xác định hàm lượng ROS nội bào, 30 tế bào trứng trưởng thành được ủ trong 20 phút ở 38,5 độ trong nước muối đệm phosphat （PBS） chứa 10 μM 2 ', 7'-dichlorofluorescein đầu dò huỳnh quang diacetate (Công nghệ sinh học Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc) trong bóng tối . Các tế bào trứng sau đó được rửa bằng PBS có bổ sung 1% albumin huyết thanh bò. Hình ảnh được chụp bằng hệ thống kính hiển vi tiêu điểm (IX71, Olympus, Nhật Bản) với cài đặt quét giống nhau giữa các nhóm. Cường độ huỳnh quang được tính toán bằng Hình ảnh. Phần mềm J.

Tổng công suất chống oxy hóa

Tổng khả năng chống oxy hóa trong tế bào trứng được phân tích bằng Bộ xét nghiệm tổng khả năng chống oxy hóa với phương pháp ABTS (Beyotime, Bắc Kinh, Trung Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất. Thử nghiệm ABTS đo lường tổng khả năng chống oxy hóa của một mẫu và dựa trên ABTS · cộng với sự đổi màu gốc. Gốc cation ABTS · cộng là một mang màu hấp thụ ở bước sóng 734 nm và được tạo ra bởi phản ứng oxy hóa ABTS (2, 2- azino-bis - (3- ethylbenzthia-zolin {{7 }} amoni sulfonat) với kali persulfat.13

Định lượng hàm lượng GSH

Hàm lượng GSH được đo bằng Total Glutathione Assay Kit (S0053, Beyotime, Bejing, China) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bộ dụng cụ này sử dụng một thử nghiệm tái chế enzym động học, dựa trên quá trình oxy hóa GSH bởi 5,5'-dithiobis - (2- axit nitrobenzoic), [DTNB] để đo tổng hàm lượng glutathione (tGSH) của các mẫu sinh học. Các mẫu chuẩn hoặc đã xử lý glutathione được thêm vào các giếng đĩa microtiter, sau đó là DTNB và glutathione reductase. Việc bổ sung NADPH2 vào các giếng bắt đầu giảm DTNB theo GSH, gây ra sự tăng màu được theo dõi ở bước sóng 405 nm. Một cách ngắn gọn, các mẫu được gieo vào 96- đĩa giếng, và sau đó 150 μL dung dịch phát hiện được thêm vào mỗi giếng. Sau khi các mẫu được cân bằng ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, 50 μ dung dịch -0. 16 mg / mL NADPH được thêm vào. Hàm lượng GSH được xác định bằng cách chia giá trị đo được của 5- thio {{15 }} axit nitro-benzoic bằng số tế bào trứng trong mỗi mẫu.

Định lượng mức Malondialdehyde (MDA)

Mức MDA trong tế bào trứng được phân tích bằng bộ xét nghiệm MDA (Beyotime) theo quy trình của nhà sản xuất. MDA phản ứng với axit thiobarbituric (TBA) để tạo ra hợp chất màu đỏ có độ hấp thụ cực đại là 532 nm. Thuốc thử TBA được chuẩn bị bằng cách trộn 0. 2 mL SDS (8,1 phần trăm), 1,5 mL axit axetic (2 0 phần trăm, pH =3. 5) và 1,5mL TBA (0,8 phần trăm) với nhau, sau đó 100 μL của mỗi mẫu tế bào trứng đồng nhất được trộn với thuốc thử 200 μL TBA này. Hỗn hợp này được ủ trong nồi cách thủy sôi trong 15 phút và sau đó làm lạnh trên đá. Sau khi làm nguội, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 4000 vòng / phút trong 10 phút. Độ hấp thụ của phần nổi phía trên được xác định ở bước sóng 532 nm so với mẫu trắng.

Thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi, Thí nghiệm IVF đã được tiến hành như đã báo cáo trước đây.14 Tóm lại, tế bào trứng thu thập từ lò mổ địa phương được nuôi cấy trong 44 giờ và loại bỏ I mg / mL hyaluronidase trong DPBS bằng cách dùng pipet cơ học; sau đó, 10-15 tế bào trứng được nhóm lại và chuyển sang môi trường thụ tinh 5 0 μL TBM (113,1 mm NaCl, 3. 0 mM KCl, 7,5 mM CaCl22H2 O, 2 0 . 0 mM Tris, 11. 0 mM glucose, 5,0 mM natri pyruvate) chứa 2,5 mM caffeine và 2 mg / mL BSA (phần V) được phủ bằng dầu khoáng. Tinh dịch tươi (từ lợn Duroc ~ 12 tháng tuổi và có tiền sử chăn nuôi nhiều lần) do Công ty TNHH Yangxiang Quảng Tây (Quảng Tây, Trung Quốc) cung cấp được rửa ba lần bằng cách ly tâm với DPBS bổ sung 0,1% BSA ở 1500 vòng / phút cho 4 phút Các viên tinh trùng được trộn lại và pha loãng thành tinh trùng 1 × 10 độ / mL bằng TBM để dung dịch trong tủ ấm CO2 trong 30 phút. Sau đó, tinh trùng có năng lực được thêm vào các tế bào trứng chứa giọt với nồng độ tinh trùng cuối cùng là 1 × 10² tinh trùng / mL và cùng ủ trong 6 giờ ở 39 độ trong môi trường có 5% CO2 trong không khí. Sau khi thụ tinh, tế bào trứng được rửa 3 lần với môi trường PZM3 và nuôi cấy với môi trường PZM3 ở 39 độ C; 5% O2,5% CO2 và 90% N2; và độ ẩm 100 phần trăm. Sự phân cắt phôi và sự hình thành phôi nang được đánh giá lần lượt ở 48 giờ và 6 ngày sau khi thụ tinh. Các công thức để đánh giá tỷ lệ phân cắt và tỷ lệ phôi nang như sau=một số lần phân cắt / số lượng tế bào trứng chín; tỷ lệ phôi bào=số lượng phôi bào / số tế bào trứng chín.

Định lượng Real-Time PCR (qRT-PCR) RNA tổng số được chiết xuất từ ​​tế bào trứng chín bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ), và được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm. RNA được phiên mã ngược lại thành cDNA bằng cách sử dụng bộ HiScript III-RT SuperMix (Vazyme, Nanjing, Trung Quốc). PCR thời gian thực được thực hiện trên qTOWER³thermal cycler （Analytik Jena Germany) bằng cách sử dụng bộ kết hợp tổng thể ChamQrM Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme). Mức độ biểu hiện mRNA của các gen được phát hiện đã được chuẩn hóa bằng GAPDH và được tính toán bằng phương pháp 2- △ c. Trình tự của các mồi được trình bày trong Bảng Bổ sung S1.

Phân tích thống kê

Tất cả phân tích dữ liệu được thực hiện bằng Phần mềm Thống kê R (Phiên bản 3.6.3). Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm điều trị khác nhau được đánh giá bằng cách sử dụng các thử nghiệm Permutation. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Bài báo này được trích từ Bài báo này đã được xuất bản trên tạp chí Dove Press sau: Thiết kế, Phát triển và Trị liệu Thuốc