Tác dụng bảo vệ và cơ chế của Procyanidins đối với bệnh Parkinson trong Vivo và In Vitro Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Trừu tượng:Nghiên cứu này đánh giá cơ chế phân tử của procyanidin (PC) chống lại chất độc thần kinh 1- methyl -4- phenyl -1, 2,3, 6- tetrahydropyridine (MPTP) và chất chuyển hóa của nó {{6 }} methyl -4- phenylpyridinium (MPP plus) gây ra các mô hình bệnh Parkinson (PD). Trong ống nghiệm, các tế bào PC12 được ủ với PC hoặc deprenyl trong 24 giờ và sau đó tiếp xúc với 1,5 mM MPP cộng trong 24 giờ. In vivo, ấu trùng cá ngựa vằn (chủng AB) sau khi thụ tinh 3 ngày (pdf) được ủ với deprenyl hoặc PCs trong 400 uM MPTP trong 4 ngày. So với MPP * / MPTP một mình, PC cải thiện đáng kể các hoạt động chống oxy hóa (ví dụ: glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT)) và giảm mức độ của các loại oxy phản ứng (ROS) và malondialdehyde (MDA ). Hơn nữa, PC làm tăng đáng kể sự tích tụ Nrf2 nhân trong tế bào PC12 và làm tăng sự biểu hiện của NQO1, HO -1, GCLM và GCLCin ở cả tế bào PC12 và cá ngựa vằn so với chỉ MPP * / MPTP. Nghiên cứu hiện tại cho thấy PC có tác dụng bảo vệ thần kinh, kích hoạt con đường liên quan đến yếu tố hạt nhân 2- yếu tố nhân tố 2 (Nrf2) / yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) và làm giảm tổn thương oxy hóa trong các mô hình PD do MPP cộng / MPTP gây ra.

Từ khóa:procyanidins; Bệnh Parkinson; Ô PC12; cá ngựa vằn; Đường dẫn Nrf2 / ARE

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

1. Giới thiệu

Bệnh Parkinson (PD) là một hội chứng thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra bởi sự vắng mặt của các tế bào thần kinh dopaminergic trong lớp nền. Biểu hiện lâm sàng của nó bao gồm chậm vận động, run, cứng và mất ổn định tư thế [1-6]. Các phương pháp hiệu quả để ngăn ngừa hoặc đảo ngược sự thoái hóa tế bào thần kinh ở bệnh nhân PD vẫn chưa rõ ràng. Do đó, việc phát hiện và phát triển các loại thuốc chống bệnh ung thư mới vẫn là ưu tiên hàng đầu trong việc tìm kiếm các phương pháp điều trị PD.

Mặc dù cơ chế bệnh sinh của PD vẫn chưa rõ ràng, nhưng các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong việc mất các tế bào thần kinh dopaminergic [7,8]. Dopamine có thể trải qua quá trình oxy hóa tự động hoặc xúc tác bởi enzyme để dẫn đến việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và các phân tử quinone electrophin [9], cả hai quá trình có thể làm cơ sở cho sự dễ bị tổn thương của tế bào thần kinh dopaminergic đối với stress oxy hóa và electrophin [10-12 ]. Do đó, một phương pháp khả thi để phòng ngừa hoặc điều trị PD có thể là bổ sung điều trị bằng chất chống oxy hóa để loại bỏ ROS quá mức. Thật vậy, các hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên có ưu điểm là chúng thường an toàn cho người tiêu dùng và có rất ít phản ứng phụ (nếu có) [13]. Do đó, các hợp chất chống oxy hóa từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên có thể hỗ trợ điều trị PD.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Procyanidins (PC) là các hợp chất phenol tự nhiên của flavonoid, bao gồm các oligomer của monomer catechin và epicatechin [14]. PC là chất dinh dưỡng và chất chống oxy hóa tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn vitamin C và E [15]. Con đường Nrf2 / ARE là một con đường chống oxy hóa đáng kể. Nrf2 được giải phóng khỏi Keap1 bởi ROS hoặc thông qua phản ứng electrophin. Sau đó, hợp chất sau đó liên kết với yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) trong nhân và làm trung gian cho sự biểu hiện của peroxiredoxin và các enzym giải độc giai đoạn II (HO -1, GCLC, GCLM và NQO -1), hoạt động như những người nhặt rác ROS và bảo vệ các tế bào khỏi bị tổn thương do quá trình oxy hóa [16].

Não cá ngựa vằn phôi thai chứa một số cụm tế bào thần kinh dopaminergic, noradrenergic và adrenergic ở các vị trí tương tự như các tế bào được tìm thấy trong não người lớn [17-19]. Vào 3 ngày sau khi thụ tinh (pdf), các tế bào thần kinh dopaminergic được quan sát thấy ở não thất, tiền bảo vệ, vị trí coeruleus, khứu giác và võng mạc [20]. So với mô hình chuột thí nghiệm, mô hình cá ngựa vằn có thời gian thí nghiệm ngắn hơn, chi phí thấp hơn và giảm độ phức tạp trong thao tác gen [21. Tế bào pheochromocytoma của chuột (tế bào PC12) rất giống tế bào thần kinh về hình thái, cấu trúc và chức năng [22]. Chúng rất phù hợp với các tế bào thần kinh được nuôi cấy sơ cấp và có ưu điểm là nuôi cấy dễ dàng và ổn định [23]. Tế bào PC12 đã được sử dụng rộng rãi làm mô hình nghiên cứu tế bào thần kinh [24-26].

Chất độc thần kinh 1- methyl -4- phenyl -1, 2,3, 6- tetrahydropyridine (MPTP) đã được chứng minh là gây ra hội chứng ở người tương tự như bệnh Parkinson. MPTP gây ra thoái hóa chọn lọc tế bào thần kinh dopaminergic ở vùng đệm và bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng bao gồm run, bất động và dáng đi loạng choạng [27]. MPTP được chuyển hóa thành 1- metyl -4- phenylpyridinium (MPP) trong thần kinh đệm tế bào trong não. Sau khi giải phóng khỏi tuyến đệm, MPP plus được vận chuyển vào tế bào thần kinh dopaminergic thông qua chất vận chuyển dopamine (DAT) [28] và tích tụ trong ty thể, nơi nó được cho là gây chết tế bào bằng cách phá vỡ các enzym hô hấp và gây ra tổn thương oxy hóa [29,30] . Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng PC ngăn chặn một số quá trình lão hóa của chuột cái [31] và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với dây thần kinh [32,33]. Tuy nhiên, liệu PC có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược sự thoái hóa tế bào thần kinh trong PD bằng cách điều chỉnh con đường Nrf2 / ARE hay không vẫn chưa rõ ràng. Nghiên cứu này sử dụng tế bào PC12 được xử lý MPP [34,35] và cá ngựa vằn được xử lý MPTP [36] để đánh giá tác dụng bảo vệ và cơ chế tiềm năng của PC trên mô hình PD.

2. Kết quả

2.1 Ảnh hưởng của PC đối với MPP cộng - Gây độc tế bào của tế bào PC12

Việc ủ các tế bào PC12 lên 1,5 mM MPP cộng thêm trong 24 giờ dẫn đến khả năng sống sót của tế bào là 58,88% (Hình la). Tiền xử lý tế bào bằng PC đã bảo vệ các tế bào PC12 khỏi tổn thương do MPP cộng thêm bằng cách tăng khả năng sống của tế bào (Hình 1b). Không có sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ sống sót của tế bào giữa nhóm PC 4ug / mL và nhóm chứng dương tính với nhóm deprenyl 30 μM) (Hình 1b).

2.2. PC Giảm MPP cộng với Căng thẳng oxy hóa gây ra và Tăng hoạt động của Enzyme Chống oxy hóa

Mức ROS và malondialdehyde (MDA) cho biết mức độ nghiêm trọng của thiệt hại do oxy hóa. Để các tế bào PC12 tiếp xúc với 1,5 mM MMP cộng thêm trong 24 giờ làm tăng mức ROS và MDA, các mức này bị PC ức chế ở 4ug / mL (Hình 2a-c). Để đánh giá thêm tác động của PC đối với khả năng chống oxy hóa của các tế bào PC12 được điều trị bằng MPP cộng với điều trị, chúng tôi đo glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) và hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và quan sát thấy rằng điều trị MPP cộng với ức chế GSH-Px , CAT và hoạt động SOD. Tuy nhiên, những hiệu ứng cộng thêm MPP này đã được cứu vãn bằng cách tiếp xúc với PC ở 4 ug / mL （Hình 2d-f）.

2.3.Ảnh hưởng của PC trên Con đường Nrf2 / ARE trong MPP cộng với Tế bào PC12 gây ra

Sự biểu hiện của yếu tố hạt nhân-erythroid 2- liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2) được điều chỉnh và mức độ Keap1 được điều chỉnh giảm sau khi điều trị PC (Hình 3a-c). PC （4 ug / mL） tạo điều kiện cho Nrf2 bản địa hóa hạt nhân trong điều kiện tổn thương MPP (Hình 3d-f). Ngoài ra, dữ liệu Western blot cho thấy sự điều tiết rõ rệt trong biểu hiện của heme oxygenase 1 (HO -1), quinone oxidoreductase 1 (NQO1), tiểu đơn vị xúc tác glutamate-cysteine ​​ligase (GCLC) và tiểu đơn vị điều chế glutamate-cysteine ​​ligase (GCLM ) biểu hiện sau điều trị PC (4 ug / mL), so với chỉ phơi nhiễm MPPt (Hình 3g-k).

2.4.Nf2 / ARE Tín hiệu liên quan đến các hiệu ứng bảo vệ thần kinh và chống oxy hóa do PCS trung gian

Việc đánh sập Nrf2 bởi siRNA đã loại bỏ một cách hiệu quả sự biểu hiện của Nrf2 (Hình 4a, b). Thật vậy, việc xử lý siRNA Nrf2 đã thay thế các hoạt động bảo vệ của PC chống lại tổn thương oxy hóa do MPP cộng với điều trị, bằng chứng là khả năng tồn tại của tế bào giảm trong nhóm được chuyển nạp siRNA Nrf2 (Hình 4c). Ngoài ra, tác động của PC lên MDA và SOD đã bị đảo ngược bởi Nrf2 hạ gục trong điều kiện giảm MPP (Hình 4d, e.

2.5 Ảnh hưởng của PC đối với Động lực của Cá ngựa vằn Laroae khi Điều trị MPTP

MPTP đã giảm tổng quãng đường bơi của cá ngựa vằn. Điều trị bằng PC (4,8 và 16 ug / mL) đã giải quyết được các thiếu hụt đầu máy do MPTP gây ra và tăng tổng quãng đường di chuyển so với nhóm MPTP (Hình 5a, b). Hơn nữa, deprenyl dường như cung cấp sự bảo vệ khỏi thiệt hại do MPTP gây ra và được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực. Đáng chú ý, chỉ riêng PC （16 ug / mL） và deprenyl （40 μM） không ảnh hưởng đến hành vi vận động của ấu trùng cá ngựa vằn bình thường.

2.6.Ảnh hưởng của PC đối với Tổn thương thần kinh Dopaminergic do MPTP gây ra ở cá ngựa vằn

Phôi cá ngựa vằn được ủ với MPTP cho thấy mật độ tyrosine hydroxylase (TH) giảm có ý nghĩa thống kê (Hình 6a, b). Tuy nhiên, điều trị với 16 ug / mL PC đã đảo ngược đáng kể việc giảm mật độ tế bào THt （Hình 6a, b）.

Figure 2. PCs reduced MPP+-induced oxidative stress and increased antioxidant enzyme activity. (a) ROSlevels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured by imageJsoftware;(c)MDA levels;(d) GSH-Px activity;(e)CAT activity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons:ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Figure 3. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPP+-induced PC12 cells. (a)Protein levels of Nrf2 and Keep-1, as determined by Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Keap1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(d) protein expression levels of nuclear Nrf2 and cytoplasmic Nrf2, as determined by Western blotting; (e) nuclear Nrf2/LaminB protein relative expression (ratio to control); (f) cytoplasmic Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(g) protein levels of HO-1, NQO1, GCLCand GCLM, as determined by Western blotting;(h)HO-1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(i) NQO1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(j) GCLC/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(k) GCLM/GAPDH protein relative expression (ratio to control). F and pvalues of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">

Figure 4. Nrf2/ARE signaling is related to the neuroprotective and antioxidant effects mediated by PCs.(a) Knockout efficiency was detected by determination of Nrf2 protein expression using Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Cell viability;(d) MDA levels;(e) SODactivity. Find values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Hình 5. Ảnh hưởng của PC lên khả năng vận động của ấu trùng cá ngựa vằn khi điều trị MPTP. (a) Các kiểu bơi điển hình của ấu trùng cá ngựa vằn trong mỗi nhóm; (b) Tổng khoảng cách trung bình của ấu trùng cá ngựa vằn trong mỗi nhóm. Giá trị F và p của phương sai phân tích một chiều được trình bày phía trên biểu đồ. Kết quả của bài kiểm tra sau hoc môn Tukey được trình bày để so sánh được chọn: **, p<0.001; the="" error="" bars="" are="">

Bài này được trích Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules