Chất ức chế Kinase LRRK2 Làm trẻ hóa sự phát triển tế bào do căng thẳng oxy hóa gây ra trong tế bào thần kinh Phần 2

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

3. Kết quả

3.1. Rotenone điều chỉnh hoạt động của LRRK2 Kinase và sự phát triển của tế bào trong các tế bào dSH.

Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng rotenone điều chỉnh hoạt động của LRRK2 kinase bằng cách điều chỉnh biểu hiện LRRK2 [16,19]. Tuy nhiên, tỷ lệ apoptosis cao hơn so với các kiểu hình liên quan đến lão hóa tế bào khác trong các nghiên cứu này do sử dụng nồng độ rotenone cao. Do đó, các tế bào được xử lý với nồng độ rotenone thấp (1uM) để

FrGURE 3: Senescence thúc đẩy rối loạn chức năng lysosome bằng cách điều chỉnh hoạt động kinase LRRK2 ở người đã biệt hóau nguyên bào thần kinhdòng tế bào. (a, b) nhuộm glycogen (Xanh lục) của các tế bào dSH sống. Cường độ nhuộm của GlycoGREEN được chuẩn hóa thành cường độ của Hoechst 33342. Cường độ chuẩn hóa ở nhóm xử lý được biểu thị bằng phần trăm (phần trăm) so với ở nhóm được xử lý bằng phương tiện (dimethyl sulfoxide-). n =4; số lượng tế bào =15-40. (c, d) Các lysosome hoạt động, được kết hợp với các điều kiện axit, được nhuộm bằngLysoSensorDND màu xanh lam -167. Cường độ nhuộm được biểu thị theo phần trăm (phần trăm) so với cường độ ở nhóm được xử lý bằng xe.n =4; số ô =17-38. （e, f Các mức phản ứngôxycác loài trong tế bào dSH được xử lý bằng rotenone （1 μM） và GSK-KI (1 uM) được đo bằng cách sử dụng diacetate 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCFDA). Cường độ DCFDA ở các nhóm điều trị được bình thường hóa bằng cường độ ở các nhóm được điều trị bằng phương tiện. Cường độ ước tính của DCFDA được biểu thị bằng phần trăm (phần trăm) .n =4; số ô=25-44.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

thời gian kéo dài (48h) như đã báo cáo trước đây [15]. Rote-none đã kiểm soát các mức LRRK2. Tuy nhiên, việc đồng xử lý với rotenone và GSK-KI không dẫn đến việc điều chỉnh mức LRRK2 (Hình 1 (a) và 1 (b)). Điều trị bằng GSK-KI làm giảm nhẹ quá trình phosphoryl hóa S1292 do rotenone gây ra của LRRK2 (Hình 1 (a) -1 (c)). Tương tự, việc điều trị bằng GSK-KI không làm giảm đáng kể sự điều chỉnh tăng mức p53 do rotenone gây ra (Hình 1 (a) và 1 (d)). LRRK2

FicuRE 4: Chất ức chế kinase LRRK2 làm giảm thiểu quá trình tự thực hiện suy giảm do rotenone gây ra và tăng cường tích tụ a-synuclein trong dòng tế bào u nguyên bào thần kinh đã biệt hóa, các tế bào dSH được điều trị bằng rotenone, GSK-KI, vàa-svnucleinfibril (70 nM) được phụ thuộc vào phương pháp thấm tây (a). Mật độ của các protein mục tiêu được bình thường hóa thành -actin (bd và f). Mật độ của LC3B II được chuẩn hóa thành mật độ của LC3BI (e). n =3.

FicuRE 5: Ức chế kinase LRRK2 làm giảm quá trình lão hóa tế bào do rotenone gây ra và thúc đẩy quá trình thanh thải -synuclein tự động thần kinh trong tế bào thần kinh vỏ não chính của chuột. Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng dSH được xử lý bằng -synuclein fibril （70 nM）, rotenone （1μM）, và GSK-KI (1 uM) trong 48 giờ được lặp lại với tế bào thần kinh vỏ não chính của chuột.Miễn dịchcác tín hiệu trong Western blot (a) được hình dung bằng cách sử dụng các kháng thể chống lại các protein đích. Mật độ của tất cả các protein, ngoại trừ LC3B II / I, được chuẩn hóa thành -actin (bi).-galactosidasekhảo nghiệm hoạt động.n=3.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

đã được báo cáo là phosphorylate p53 tại vị trí TXR [20]. Xử lý bằng rotenone tăng cường nội địa hóa hạt nhân của p53, được giảm thiểu khi điều trị bằng GSK-KI (Hình 2 (a) -2 (e)). Ngoài ra, GSK-KI giảm nhẹ sự điều chỉnh do rotenone gây ra đối với p21 (Hình 1 (a) và 1 (e)). Rotenone đã điều chỉnh giảm quá trình phosphoryl hóa của Rb, tham gia vào giai đoạn cuối của con đường p 53- p21 lão hóa. Điều trị bằng GSK-KI làm giảm nhẹ quá trình phosphoryl hóa Rb do rotenone gây ra (Hình 1 (a) và 1 (f)). Vì con đường p 53- p21 không phải là con đường tín hiệu duy nhất làm trung gian cho quá trình lão hóa, mức mRNA của p21 và pl6 đã được kiểm tra. Điều trị bằng GSK-KI làm giảm nhẹ quá trình điều chỉnh p21 do rotenone gây ra. Mức độ mRNA p16 không khác biệt đáng kể giữa nhóm được điều trị bằng rotenone và nhóm được điều trị bằng rotenone / GSK-KI (Hình 2 (f). Hình 1 (a) và 1 (g)). Hơn nữa, kết quả PLA của pS1292 LRRK2 và tổng LRRK2 trong các tế bào dSH cho thấy rotenone làm tăng mức -gal và hoạt động kinase LRRK2 (Hình 1 (h) {{39 }} i). Những kết quả này chỉ ra rằng rotenone thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào thông qua các con đường p53, p21, Rb và -gal bằng cách điều chỉnh mức LRRK2 và hoạt động kinase của nó mà sự ức chế LRRK2 đã giảm thiểu sự lão hóa tế bào do rotenone gây ra trong các tế bào dSH.

3.2. Suy giảm sự phát triển của tế bào -Sự thoái hóa tế bào trong tế bào dSH và tế bào thần kinh vỏ não chính của chuột bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của LRRK2 Kinase.

Sự già đi của tế bào làm suy yếu hoạt động của con đường tự thực-lysosome [14, 21]. Do đó, hoạt động của lysosome (LysoSensor) đã được kiểm tra cùng với các dấu hiệu lão hóa, hoạt tính SA -gal và mức ROS trong các điều kiện thí nghiệm giống hệt nhau (Hình 1). Rotenone làm tăng hoạt tính SA -gal (Hình 3 (a) và 3 (b)) và giảm hoạt tính của lysosome (Hình 3 (c) và 3 (d)), được giảm thiểu khi điều trị chung với GSK-KI. Ngoài ra, GSK-KI giảm nhẹ sự điều chỉnh mức độ ROS do rotenone gây ra, chỉ ra rằng rotenone thúc đẩy sự lão hóa bằng cách gây ra ứng suất oxy hóa (Hình 3 (e) và 3 (f)). Trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng quá trình phosphoryl hóa p53 qua trung gian LRRK 2-, cũng như đột biến LRRK2 G2019S, đã thúc đẩy sự tích lũy -syn [10]. Ảnh hưởng của sự lão hóa tế bào đối với sự kết hợp của -syn, làm trầm trọng thêm sự tiến triển của PD, đã được kiểm tra bằng cách sử dụng -syn fibrils. Rotenone đã điều chỉnh các mức p62 và LC3BI / I, thể hiện sự đình chỉ của thông lượng autophagy, các tập hợp -syn (Hình 4 (a), 4 (d) và 4 (f), và hoạt động kinase LRRK2 (Hình 4 (a ) -4 (c)) trong các tế bào dSH. Điều trị bằng GSK-KI làm giảm nhẹ sự điều tiết do rotenone gây ra đối với các tổng hợp p62, LC3B I / l và -syn nhưng không ảnh hưởng đến mức LRRK2. Ngoài ra, điều trị bằng GSK-KI giảm thiểu sự điều chỉnh SA do rotenone gây ra

HÌNH 6: Rotenone thúc đẩy sự lão hóa tế bào ở não giữa của chuột bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của kinase LRRK2. (a) Sơ đồ thí nghiệm mô hình chuột. (b) Các phép đo thời gian rơi từ rotarod được biểu diễn. Thời gian rơi rụng của mỗi con chuột trong nhóm thí nghiệm (n =4) được ghi lại ba lần, Các khối u ở não giữa đã được thử nghiệm hoạt tính -galactosidase liên quan đến lão hóa (c), phương pháp thấm nước (de), và chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym xét nghiệm để phát hiện oligomer -synuclein (f), n =4 dạng sợi. * cho biết kết quả của phép phân tích phương sai hai chiều (ANOVA), tiếp theo là bài kiểm tra bài học của Tukey. # cho biết kết quả của bài kiểm tra một chiều ANOVA, tiếp theo là bài kiểm tra bài học của Tukey. "* p<0.01 and="" p=""><0.001. β-gal="" and="" downregulation="" of="" lysosomal="" enzyme(cathepsin="" d)activities="" (supplementary="" figure="" 1).="" to="" determine="" the="" mechanism="" underlying="" rotenone-mediated="" lrrk2="" kinase="" activation="" and="" cellular="" senescence,="" the="" experiments="" performed="" with="" dsh="" cells="" were="" repeated="" using="" rat="" primary="" cortical="" neurons.="" rotenone="" and="" gsk-ki="" exerted="" similar="" effects="" on="" lrrk2="" kinase="" activity(figures="" 5(a)-5(c)),="" p53-p21="" pathway="" activation="" (figures="" 5(a),="" 5(d),="" and="" 5(e)),β-gal="" levels="" (figures="" 5(a)="" and="" 5(f)),="" autophagy(figures="" 5(a),5(g),="" and="" 5(h)),="" α-syn="" aggregation(figures="" 5(a)="" and="" 5(i)),and="">

HÌNH 7: Vai trò của chất ức chế kinase LRRK2 trong việc gây lão hóa tế bào trong quá trình tiến triển của bệnh Parkinson. Một đại diện sơ đồ của những phát hiện của nghiên cứu này. Chất ức chế kinase LRRK2 làm giảm thiểu sự lão hóa tế bào do rotenone gây ra, suy giảm con đường lysosome tự động và tăng cường kết hợp -synuclein trong tế bào thần kinh dopaminergic.

hoạt động -gal (Hình 5 (j)) trong tế bào thần kinh vỏ não chính của chuột như những gì được quan sát thấy trong các tế bào dSH. Do đó, sự lão hóa tế bào do rotenone gây ra thúc đẩy quá trình điều hòa LRRK2 kinase và làm suy yếu các hoạt động autophagy-lysosome, dẫn đến tăng cường kết hợp -syn.

3.3.LRRK2 Ức chế Kinase làm giảm nhẹ sự phát triển tế bào do Rotenone gây ra ở não giữa của chuột.

Để xác minh những phát hiện trong ống nghiệm, một thử nghiệm in vivo đã được thực hiện. Chuột được tiêm vào màng bụng với rotenone (0. 75 mg / kg thể trọng) và MLi -2 (1mg / kg thể trọng), một chất ức chế kinase LRRK2 có thể thẩm thấu qua hàng rào máu não, cứ hai lần một lần ngày trong hai tuần (Hình 6 (a)). Trong các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng nồng độ rotenone cao, apoptosis là kiểu hình liên quan đến lão hóa tế bào chiếm ưu thế. Do đó, các tế bào dSH và tế bào thần kinh chính của chuột được xử lý với nồng độ thấp của rotenone trong một thời gian dài. Rotenone làm giảm đáng kể hoạt động vận động của chuột bằng chứng là thời gian rơi khỏi rotarod giảm (Hình 6 (b)). Tuy nhiên, rotenone đã điều chỉnh hoạt động SA -gal ở não giữa, hoạt động này được giảm thiểu đáng kể khi điều trị bằng MLi -2 (Hình 6 (c)). Ngoài ra, việc điều trị bằng MLi -2 đã giảm nhẹ đáng kể sự kích hoạt do rotenone gây ra đối với con đường LRRK2 kinase và p 53- p21 trong não giữa (Hình 6 (d) và 6 (e)). Hơn nữa, rotenone đã điều chỉnh đáng kể mức -gal, mức độ này được giảm nhẹ khi xử lý chung với MLi -2. ELISA được thực hiện để đo mức độ của các oligome fibrillar -syn trong dịch não giữa [17]. Điều trị bằng MLi -2 làm giảm nhẹ sự điều hòa tăng lên do rotenone của các oligome fibril-lar -syn (Hình 5 (f)). Do đó, việc sử dụng rotenone liều thấp trong màng bụng đã thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào ở não giữa của chuột, dẫn đến kết tụ -syn ở não giữa. Điều trị bằng chất ức chế LRRK2 kinase làm giảm nhẹ sự lão hóa tế bào do rotenone gây ra ở não giữa.

4. Thảo luận

Cơ chế cơ bản của sự lão hóa tế bào trong tế bào thần kinh dopaminergic vẫn chưa được làm sáng tỏ. Lão hóa là một yếu tố nguy cơ đối với PD. Do đó, mối tương quan giữa sự lão hóa và sự lão hóa của tế bào phải được xem xét. Các nghiên cứu gần đây đã gợi ý rằng sự lão hóa tế bào liên quan đến PD có liên quan đến việc mất các chức năng tế bào [14,22,23), chẳng hạn như mất chức năng LRRK2 trong tế bào thần kinh do bãi bỏ điều tiết của con đường tự phân lysosome [24, 25] . Trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng gen đột biến G2019s LRRK2 đã làm suy giảm khả năng tự thực thi trong dòng tế bào dopaminergic của chuột bằng cách phosphoryl hóa leucine-tRNA synthetase [26]. Một con đường tự phân ly-lysosome bị suy yếu thúc đẩy sự kết hợp -syn [1l, 27]. Do đó, hoạt động LRRK2 có thể làm trung gian cho sự tổng hợp -syn. Việc ức chế hoặc ngăn chặn sự tập hợp -syn bằng cách sử dụng kháng thể kháng syn - - là một chiến lược điều trị tiềm năng đối với PD [28-30]. Tuy nhiên, kháng thể syn kháng - - không có tác dụng điều trị rõ rệt đối với bệnh PD ở người. Điều này có thể là do sự thanh thải không hoàn toàn của các tập hợp -syn, bao gồm fibrin, protofibrils và các oligomer độc hại. Các kháng thể đặc hiệu biến đổi cho các oligome -syn có thể không loại bỏ tất cả các oligome độc ​​hại hoặc dễ bị LB trong não của bệnh nhân PD. Sự ức chế kinase LRRK2 có thể kích hoạt con đường tự phân lysosome và thúc đẩy quá trình thanh thải a-syn. Do đó, việc sử dụng đồng thời chất ức chế kinase LRRK2 và kháng thể kháng syn - - tạo ra tác dụng hiệp đồng điều trị trên PD.

Con đường p 53- p21 có liên quan đến một số quá trình tế bào, bao gồm quá trình chết rụng và lão hóa [31]. Quá trình phosphoryl hóa Rb là bước khởi động của lộ trình tín hiệu hóa già của tế bào [32]. Ngoài ra, việc kích hoạt biểu hiện p16 làm trung gian cho sự lão hóa của tế bào [33]. Mức độ biểu hiện của p16 và p21 được điều chỉnh trong tế bào thần kinh hạch gốc lưng của chuột được tiêm cisplatin [34]. Ngoài ra, phân tích tử thi đối với những bệnh nhân bị bệnh xơ cứng teo cơ / bệnh thần kinh vận động bên cho thấy rằng sự biểu hiện của p16 và p21 được điều chỉnh trong các tế bào hình sao của vỏ não liên quan phía trước. Tuy nhiên, các tế bào thần kinh biểu hiện sự điều chỉnh của p21 với mức p1635 không thể phát hiện được]. Các phát hiện của nghiên cứu này chỉ ra rằng sự già đi của tế bào chủ yếu là qua trung gian của con đường p 53- p21 chứ không phải là pl6 được điều chỉnh (Hình 1,2 và 4). Các phản ứng viêm cũng liên quan đến sự lão hóa. Tế bào hình sao tham gia vào quá trình viêm thần kinh trong não [36]. Sự già đi của tế bào hình sao góp phần vào sự tiến triển của các bất thường về nhận thức [37]. Do đó, chứng viêm thần kinh có thể liên quan đến sự lão hóa ở tế bào hình sao. Các nghiên cứu trong tương lai phải điều tra mối tương quan giữa chứng viêm thần kinh và sự già đi của tế bào và các con đường truyền tín hiệu riêng biệt của nó.

Trong nghiên cứu này, rotenone đã điều chỉnh hoạt động kinase LRRK2. Tuy nhiên, nghiên cứu này không chứng minh được tác dụng của chất ức chế kinase LRRK2 đối với thể đột biến G2019S. Sự già đi của tế bào được kiểm tra sau khi chuyển gen đột biến G2019SLRRK2 trong tế bào dSH và tế bào thần kinh sơ cấp của chuột. Sự biểu hiện kéo dài của G2019S LRRK2 trong các tế bào dSH và tế bào thần kinh chính của chuột đã làm tăng đáng kể mức -gal và hoạt động SA -gal. Điều trị các tế bào bị nhiễm G2019S LRRK 2- bằng chất ức chế kinase LRRK2 hoặc sự biểu hiện của D1994A LRRK2 đã không điều chỉnh mức -gal và hoạt động SA -gal (Hình bổ sung 2). Trước đây, chúng tôi đã báo cáo rằng mức độ tập hợp -gal và -syn trong dịch não của những con chuột biểu hiện G2019S 24- tuần tuổi cao hơn so với những con cùng lứa tuổi [10]. Điều trị bằng chất ức chế LRRK2 không làm giảm rõ rệt sự lão hóa tế bào do rotenone liều thấp gây ra ở chuột. Tuy nhiên, những tiến bộ về dược lý có thể nâng cao hiệu quả điều trị của chất ức chế kinase LRRK2 ở chuột (Hình 6). Các nghiên cứu trong tương lai phải tập trung vào việc cải thiện tác dụng dược lý và tính an toàn của các chất ức chế kinase LRRK2. Việc sử dụng chất ức chế LRRK2 kinase có thể dùng như một chiến lược điều trị khả thi đối với PD có hoạt tính LRRK2 kinase cao vì nó có thể giảm thiểu căng thẳng oxy hóa hoặc tác động độc hại của các đột biến LRRK2 (Hình 7). Hoạt động kinase của LRRK2 trong nước thải sinh học của con người, chẳng hạn như huyết thanh, dịch não tủy và nước tiểu có thể dùng như một dấu ấn sinh học tiên lượng để xác định phương pháp điều trị tối ưu cho những bệnh nhân bị PD có biểu hiện tăng cường hoạt tính kinase LRRK2.

5. Kết Luận

Những phát hiện của nghiên cứu này cho thấy rằng điều trị bằng chất ức chế LRRK2 kinase làm giảm sự lão hóa tế bào do dùng rotenone nhẹ và dài hạn. Nghiên cứu này đã chứng minh vai trò quan trọng của LRRK2 trong con đường p 53- p21, làm trung gian cho sự già đi của tế bào và cung cấp những hiểu biết mới để phát triển liệu pháp PD bằng cách sử dụng chất ức chế kinase LRRK2.

Bài viết này được trích từ Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Long Thọ, 2021, Article ID 9969842, 16 trang https://doi.org/10.1155/2021/9969842