Kaempferol làm giảm bớt tổn thương do LD-ty thể bằng cách thúc đẩy quá trình Autophagy: Những tác động trong bệnh Parkinson Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Trừu tượng:Bằng chứng mới nổi chỉ ra rằng sự lắng đọng và peroxy hóa giọt lipid (LD) bất ngờ có thể đẩy nhanh quá trình căng thẳng của bào quan và đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các bệnh thoái hóa thần kinh (NDD). Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã xác nhận rằng kaempferol (Ka), một phân tử nhỏ flavonoid tự nhiên, có tác dụng bảo vệ thần kinh trên những con chuột mắc bệnh Parkinson do LPS (PD). Ngoài ra, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự lắng đọng LD của tế bào. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã chỉ ra rằng Ka đã bảo vệ chống lại sự mất tế bào thần kinh và thiếu hụt hành vi ở chuột PD do MPTP / p gây ra, kèm theo giảm stress oxy hóa lipid ở loài chuột biển substantia nigra pars compacta (SNpc). Trong các tế bào thần kinh được nuôi cấy, Ka thể hiện một phạm vi nồng độ tương đối an toàn và ức chế đáng kể sự tích tụ LD và quá trình chết rụng tế bào do MPP plus gây ra. Nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ của Ka phụ thuộc vào autophagy, cụ thể là lipophagy. Quan trọng là, Ka đã thúc đẩy autophagy để làm trung gian sự phân hủy LD trong lysosome, sau đó làm giảm sự lắng đọng lipid và quá trình peroxy hóa và dẫn đến tổn thương ty thể, do đó làm giảm sự chết của tế bào thần kinh. Hơn nữa, AAV-shAtg 5- qua trung gian hạ gục Atg5 đã loại bỏ tác dụng bảo vệ thần kinh của Ka chống lại quá trình oxy hóa lipid ở chuột PD. Công trình này chứng minh rằng Ka ngăn ngừa thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic trong PD thông qua việc ức chế tổn thương ty thể qua trung gian peroxy hóa lipid bằng cách thúc đẩy lip-ophagy và cung cấp một chiến lược điều trị mới tiềm năng cho PD và các NDD liên quan.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

1. Giới thiệu

Bệnh Parkinson (PD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến (NDD) có đặc điểm bệnh lý là sự mất dần các tế bào thần kinh dopaminergic (DA) trong chất nền (SNpc). Mặc dù căn nguyên chính xác và diễn biến tự nhiên của sự khó chịu này vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn,nhiềucác quá trình và rối loạn chức năng cấp hệ thống, bao gồm các chức năng của ty thể, cân bằng nội môi dopamine, viêm thần kinh và autophagy, có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của PD [1,2]. Các báo cáo gần đây cho thấy liên quan đến giọt lipid (LD)độc tínhcó thể tham gia vào bệnh lý PD [3,4]. LDs là các bào quan có tính năng động cao xuất hiện từ màng lưới nội chất (ER) và thường đóng vai trò như các vị trí nội bào lưu trữ lipid trung tính [5]. LDs gần đây đã được chứng minh là đóng một vai trò rộng hơn nhiều so với việc lưu trữ axit béo (FA) và tham gia vào nhiều bệnh. Ví dụ, các tế bào dòng tủy, bao gồm đại thực bào, bạch cầu và bạch cầu ái toan, hình thành LDs để phản ứng với tình trạng viêm và căng thẳng, và LDs là các vị trí sản xuất và lưu trữ cytokine gây viêm và còn tham gia vào quá trình trình bày kháng nguyên và loại bỏ mầm bệnh [6]. Điều quan trọng là trong xơ vữa động mạch, các tế bào bọt giàu LD đã được chứng minh là có hại trong tất cả các giai đoạn của bệnh [7].

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Tuy nhiên, LDs chưa được nghiên cứu rộng rãi trong hệ thần kinh trung ương (CNS), với rất ít tài liệu báo cáo về sự hiện diện mô học của LDs trong mô não người [8,9]. Mặc dù vậy, LD có thể có các chức năng quan trọng trong não, vì các nghiên cứu gần đây đã xác nhận rằng LD tổng hợp trong glia làm tăng tốc độ thoái hóa thần kinh trong mô hình Drosophila [10]. Gần đây đã có báo cáo rằng ở chuột, các tế bào chứa nhiều lipid O dương tính với màu đỏ dầu, bao gồm tế bào thần kinh, protein có tính axit dạng sợi thần kinh đệm (GFAP) cộng với tế bào hình sao và phân tử tiếp hợp canxi ion hóa -1 (IBA {{7} }) cộng với microglia, hiện diện trong nhiều vùng não và đã được chứng minh là tham gia vào các quá trình liên quan đến tuổi tác [1]. Công trình trước đây của chúng tôi cũng đã chứng minh sự gia tăng tích tụ LD trong não ở mô hình chuột PD [12]. Tổng hợp lại, những nghiên cứu này cho thấy rằng LD có thể liên quan đến cơ chế bệnh sinh của PD, cũng như các NDD khác.

Thông thường, các LD nội bào bị thoái hóa tronglysosomevà cung cấp các FA đến ti thể để chúng tiêu thụ như một nguồn năng lượng thay thế trong thời kỳ cạn kiệt chất dinh dưỡng [13]. Tuy nhiên, các tế bào thần kinh có khả năng tiêu thụ FA ti thể thấp để sản xuất năng lượng [14]. Đặc tính này làm cho các tế bào thần kinh đặc biệt nhạy cảm với sự tích tụ LD và quá trình peroxy hóa. Hơn nữa, sự tích tụ LDs làm tăng tốc độ oxy hóa FA và tạo áp lực liên tục lên chuỗi vận chuyển điện tử ty thể, làm tăng sản xuất oxy phản ứng (ROS) bởi các phức hợp chuỗi vận chuyển điện tử I và II [15] để khuếch đại ứng suất oxy hóa. Quá tải lipid cũng dẫn đến sản xuất ROS bởi các nguồn ngoài tế bào như nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase và các chất oxy hóa khácenzim. Kết hợp với sự giảm biểu hiện của các enzym chống oxy hóa và khả năng tiêu thụ FA thấp trong tế bào thần kinh, sự tích tụ LD làm trung gian cho stress oxy hóa và có thể dẫn đến tổn thương ty thể,rối loạn chức năng lysosome, autophagy bị lỗi và kích hoạt các phản ứng viêm [6,17]. Trừ khi các LD tích lũy có thể bị ức chế hoặc loại bỏ, các tế bào thần kinh hoạt động mạnh sẽ trải qua quá trình sinh lý bệnh, dẫn đến thoái hóa thần kinh [17]. Bằng chứng chỉ ra rằng quá trình dị hóa qua trung gian lysosome được gọi là autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi LD tế bào trong nhiều mô [17,18]. Cụ thể, LDs có thể được cô lập một cách có chọn lọc trong thực quản và chuyển đến lysosome để phân hủy bởi lipase axit lysosome, một quá trình đặc biệt được gọi là lipophagy [19]. Do đó, nhắm mục tiêu các LD và con đường loại bỏ tự thực của chúng có thể đại diện cho một cách tiếp cận mới để quản lý sự thoái hóa thần kinh.

Việc nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên và các tác nhân từ chế độ ăn uống làm nguồn cho các phương pháp điều trị và chiến lược NDD tiềm năng đã thu hút được sự quan tâm lớn trong những năm gần đây [20]. Kaempferol (Ka) là một phân tử nhỏ polyphenol tự nhiên có thể được tìm thấy trong một số loại dược liệu và nguồn thực phẩm của Trung Quốc [21]. Ka đã được báo cáo là có tác dụng kháng khuẩn, chống lão hóa và điều hòa miễn dịch, cũng như các hoạt động chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh [20,22,23]. Trước đây, Ka đã được báo cáo là có khả năng ức chế phản ứng viêm ở tế bào vi mô BV2 trong ống nghiệm [24] và tăng sức đề kháng của tế bào thần kinh DA đối với quá trình viêm thần kinh in vivo [25]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của Kaon LDs trong PD vẫn chưa được nghiên cứu.

Do tầm quan trọng của LDs và mối liên hệ mật thiết giữa LDs, ty thể và autophagy [16], tất cả đều liên quan đến PD, chúng tôi giả thuyết rằng Ka ức chế quá trình peroxy hóa LD và ngăn chặn sự thoái hóa thần kinh DA trong PD. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng Ka đã bảo vệ đáng kể chống lại sự thoái hóa thần kinh trong mô hình PD ở chuột bằng cách ức chế sự tích tụ LD. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy Ka kích hoạt quá trình tự động và làm giảm sự tích tụ các LD bị oxy hóa để làm giảm rối loạn chức năng ty thể và sản xuất ROS (mtROS) của ty thể, do đó ngăn ngừa sự chết theo tế bào thần kinh. Những phát hiện thu được trong nghiên cứu này có thể giúp đưa ra các quyết định lâm sàng liên quan đến việc sử dụng phân tử tự nhiên Ka trong NDD như PD.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Động vật thí nghiệm

Chuột C57BL / 6J (đực, 4- tháng tuổi) được lấy từ Động vật lõi của Đại học Y Nam Kinh (Nam Kinh). Chuột được duy trì và nhân giống tại Trung tâm Nguồn lực Động vật thuộc Khoa Y, Đại học Y Nam Kinh, và trong cơ sở động vật tại Bệnh viện Tháp Trống Nam Kinh, Chuột được tự do tiếp cận thức ăn và nước uống trong phòng có nhiệt độ môi trường là 22 độ ± 2 độ C và chu kỳ sáng / tối 12: 12 h Tất cả các quy trình trên động vật được thực hiện theo đúng hướng dẫn của Hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm của Viện Y tế Quốc gia.

2.2. Thuốc thử

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99. 0 phần trăm, 96,353) cho các thí nghiệm trong ống nghiệm được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). BODIPY 493/5 0 3 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) đã được mua từ Thermo Fisher Scientific. Đối với các thí nghiệm trên động vật, Ka được hòa tan trong dung dịch 10 phần trăm DMSO trong 16 phần trăm SBE - - CD trong nước muối vô trùng. Đối với các thí nghiệm tế bào, Ka được chuẩn bị trong DMSO (Sigma-Aldrich) và PBS (nồng độ DMSO cuối cùng là 0,01 phần trăm), pH 7,4.

2.3. Mô hình chuột PD cảm ứng và xử lý metyl -4- phenyl -1, 2,3, 6- tetrahydropyridine (MPTP)

Để đánh giá ảnh hưởng của Ka trong mô hình PD của độc tính MPTP / p, chuột (đực, 4-5 tháng tuổi) được chia ngẫu nhiên thành nhóm được xử lý bằng nước muối, nhóm được điều trị bằng MPTP, MPTP cộng với Ka được điều trị nhóm, và nhóm điều trị một mình Ka. Trong nhóm được điều trị bằng MPTP, những con chuột được sử dụng MPTP mãn tính với quy trình tương tự như đã được mô tả trước đây [26]: MPTP được hòa tan trong nước muối và được tiêm dưới da ở mức 25 mg / kg, sau đó là 250 mg / kg probenecid (hòa tan trong dimethyl sulfoxide) Tiêm trong phúc mạc (ip) cách nhau 1 giờ mỗi 3,5 ngày trong khoảng thời gian 5 tuần. Những con chuột đối chứng được tiêm nước muối và probenecid. Trong nhóm được điều trị MPTP cộng với Ka, những con chuột được tiêm Ka (50 mg / kg, một lần tiêm / ngày trong các thí nghiệm, Jingzhu Biotechnology, Nam Kinh, Trung Quốc) trong phúc mạc (ip) hàng ngày 3 ngày trước khi điều trị bằng MPTP và trên 5 MPTP tuần tiêm. Một tuần sau lần tiêm MPTP cuối cùng, những con chuột được kiểm tra hành vi bị mù theo nhóm. Sau đó, tất cả các con chuột đều được gây mê bằng pentobarbital natri 40 mg / kg và được hy sinh để phát hiện protein trong não và phân tích hóa mô miễn dịch hoặc qPCR.

2.4. Phẫu thuật lập thể in vivo và các phương pháp điều trị thử nghiệm

Phẫu thuật lập thể trong điều kiện gây mê pentobarbital natri (4 0 mg / kg, ip) được thực hiện như mô tả [25]. Chuột Atg5 và shRNA điều khiển đã được truyền với các vectơ đóng gói (AAV-U 6- CMV-shR-NA-EGFP) để tạo AAV. Đối với vi tiêm, những con chuột đã được gây mê được đặt trong một thiết bị lập thể. Họ được tiêm 1μL AAV bằng điện cực thủy tinh nhằm vào DG (AP: -0. 3 mm; ML: ± 0. 13 mm; DV: -0. 45 mm） tại a tốc độ 0,25 μL / phút. Sau đó, kim được giữ lại thêm 2- phút 2 tuần sau khi tiêm vi rút, chuột được dẫn truyền mô hình PD do MPTP gây ra và (hoặc) điều trị Ka.

Atg5 shRNA được lấy từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Hanbio (Thượng Hải, Trung Quốc) Đối với sự im lặng của Atg5, các đoạn mồi được trình bày trong Bảng bổ sung 1.

2.5. Phân tích hành vi

Một tuần sau khi tiêm MPTP hoặc nước muối cuối cùng, thử nghiệm rotarod và thử nghiệm cực đã được thực hiện như đã mô tả trước đây [27]. Đối với thử nghiệm rotarod, những con chuột đã được làm quen với rotarod trong hai thử nghiệm (6 phút với tốc độ tăng nhanh 12-20 vòng / phút) mỗi ngày trong 2 ngày liên tiếp trước khi bắt đầu thử nghiệm. Sau đó, những con chuột được thử nghiệm ở tốc độ 20 vòng / phút trong 300 giây trong 3 ngày liên tiếp khác. Độ trễ để rơi được ghi lại bằng Hệ thống phân tích Rotarod (Jiliang, Thượng Hải, Trung Quốc). Tất cả các con chuột đã quen với thiết bị này 2 ngày trước khi thử nghiệm và sau đó thử nghiệm ba lần trong ngày thứ ba. Tổng thời gian (tổng T, cho đến khi chuột chạm sàn bằng bốn chân) và thời gian quay (T-turn, để chuột quay hẳn đầu xuống dưới) được ghi lại. Thí nghiệm được làm mù đối với các nhóm chuột đối với mỗi thử nghiệm hành vi và thử nghiệm được thực hiện ba lần.

2.6. Bộ sưu tập mẫu não

Sau các bài kiểm tra hành vi cuối cùng, chuột được gây mê bằng natri pentobarbital (40 mg / kg, ip). Đối với phân tích qPCR, Western blotting và sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC), toàn bộ não được nhanh chóng chiết xuất từ ​​động vật, sau đó mô não giữa và thể vân nhanh chóng được mổ xẻ, đông lạnh trước bằng nitơ lỏng. Tất cả các mẫu được lưu trữ ở -80 độ cho đến khi phân tích.

Để phân tích hóa mô miễn dịch, chuột được truyền dịch xuyên tim với 4% paraformaldehyde (PFA). Não được tách ra, sau khi cố định, khử nước, nhúng vào OCT (Mô-Tek), và các phần nối tiếp của não được bảo quản lạnh （30 μm mỗi lát） qua toàn bộ tầng và não giữa bằng cách sử dụng một microtome đóng băng (Leica CM1950, Nussloch, Đức ). Tất cả các phần được thu thập thành sáu loạt riêng biệt và các lát não được lưu trữ trong 50 phần trăm glycerin và được đông lạnh ở -20 độ cho đến khi phân tích.

Đối với TEM, chuột được truyền 2,5% glutaraldehyde và 2% paraformaldehyde như mô tả 【12】. Một phần nhỏ （<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Phân tích hóa mô miễn dịch

Các lát não được rửa trong PBS, sau đó là 3 phần trăm H2O, trong 1 0 phút sau đó ủ với 0. 3 phần trăm Triton X -100 trong PBS bổ sung 5 phần trăm BSA trong 1 giờ. Sau đó, các phiến kính được ủ với các kháng thể chính ở 4 độ qua đêm trong PBS có chứa 5% BSA ở 4 độ qua đêm, sau đó rửa sạch và ủ trong các kháng thể thứ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, tiếp theo là ủ với diaminobenzidine (DAB) hoặc gắn vào DAPI (Life Technologies, Cat P36931) làm phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch trong 5 phút. Đối với phương pháp nhuộm Nissl, các lam được trộn trong dung dịch cresyl tím (CV) (0,1g cresyl tím, 99 ml H, O và 1 phần trăm axit axetic 1 ml) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó khử nước bằng cồn và xylen. Hình ảnh được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Hoa Kỳ). Tổng số tế bào thần kinh dương tính với TH và dương tính với Nissl trong SNpc được thu nhận về mặt huyết thanh học bằng cách sử dụng phương pháp phân đoạn quang học với phần mềm MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, Hoa Kỳ).

2.7. Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Mẫu vân chuột được đồng nhất với {{0}}. 1 M axit perchloric （1 mg mô trong 1 0 0 μL axit perchloric） và 0,1 mM EDTA, được xử lý bằng siêu âm và ly tâm ở 20, 000 vòng / phút trong 30 phút như đã báo cáo [27]. Sau đó, chất lỏng nổi trên mặt nước được thu thập để đo. Pha động là dung dịch hỗn hợp bao gồm 90 mM natri photphat monobasic, 1,7 mM 1- axit sulfonic octan, 50 mM xitrat, 50 μM EDTA, 10 phần trăm axetonitril với tốc độ dòng 0,2 ml / phút. Song song, để tính toán đường chuẩn định lượng, dung dịch chuẩn gốc cho dopamine và axit dihydroxy-phenyl axetic (DOPAC) (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ） được chuẩn bị trong HClO4 0,1 M. vào pha động và được kiểm tra bằng máy dò điện hóa ESA Coulochem ⅢI (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Các mẫu được đo và định lượng đỉnh. Nồng độ của các monoamine được định lượng bằng cách so sánh với chất chuẩn bằng phần mềm ClarityChrom (Knauer, Đức) và sau đó Các thành phần trong tầng được chuyển đổi theo tỷ lệ pha loãng. Đường cong chuẩn của DA và DOPAC được thể hiện trong Hình bổ sung 1a và b.

2.8. Nuôi cấy và điều trị tế bào

Quá trình nuôi cấy tế bào thần kinh sơ cấp của màng não được tiến hành như đã mô tả trước đây [12]. Tóm lại, các mô trung bì của chuột C57BL / 6 vào ngày phôi 14/15 (E14 / 15) đã được loại bỏ cẩn thận, phân ly cơ học để loại bỏ màng và các mạch máu lớn, và sau đó được mổ xẻ. Tiếp theo, chúng được phân hủy bằng trypsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA） và sau đó được lọc qua bộ lọc 100- μm để thu được huyền phù đơn bào. Sau đó, các tế bào được mạ trên poly-L-lysine -đĩa tốt 12- / 24- được tráng phủ trước ở 2,5 × 1 0 ô độ / ml có chứa môi trường Neurobasal (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, Hoa Kỳ) được bổ sung B27 (2% v: v, Cat 17504044, GibcoTM) và penicillin / streptomycin (0,5% v: v). Các mẫu cấy được duy trì trong một buồng làm ẩm (tủ ấm 37 độ, 5% CO2). Môi trường nuôi cấy được thay đổi 3 ngày một lần và các ô có thể được sử dụng sau 7-10 ngày.

Dòng tế bào: Dòng tế bào SH-SY5Y được nuôi cấy trong 1 0 phần trăm FBS và 1 phần trăm penicillin / streptomycin trong tủ ấm được làm ẩm ở 37 độ và 5 phần trăm CO2. Trong các thí nghiệm, các tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng MPP （200 μM） hoặc các liều Ka （0,3,30,60,100,300,600 μM） trong 24 giờ. Ka （3,10,30,60μM, tế bào SH-SY5Y mồi 3 giờ được kích thích bằng MPp cộng với （400 μM） trong 24 giờ. Ka （30 μM, 3 h） với （hoặc không） 3- MA （3 mM, 1 h） hoặc -tocopherol （50 μM, 1h, Sigma-Aldrich, 47783） primed-SH-SH5Y tế bào được kích thích bằng MPP cộng với （200 μM） trong 24 giờ.

2.9. Thử nghiệm CCK8 khả năng sống của tế bào

Khả năng sống sót của tế bào đã thay đổi của phương pháp xử lý Ka đã được phát hiện bằng Bộ đếm tế bào -8 (CCK -8 Kit, Selleck, Houston, TX, Hoa Kỳ). Tóm lại, các tế bào SHSY5Y được tạo hạt trong một 96- tấm giếng và sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của Ka （3,30,60,100,300,600 μM） trong 24 giờ. Sau đó, thuốc thử 10ulof CCK -8 được thêm vào mỗi giếng trong 4 giờ. Cuối cùng, độ hấp thụ được phát hiện bởi Phổ đa năng (Thermo Fisher Scientific) ở bước sóng 450 nm.

2.10.Kiểm traATP

Mức ATP trong tế bào được phát hiện bằng Bộ xét nghiệm phát quang sinh học ATP (Beyotime Biotechnology Co., Trung Quốc〕 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi xử lý, tế bào được ly giải và ly tâm ở tốc độ 12, 000 vòng / phút trong 5 phút ở 4 độ và các chất nổi phía trên đã được thu thập. Dung dịch làm việc （100μL） được thêm vào 20μL mẫu trong đĩa giếng 96- và độ phát quang được đo ngay lập tức trên đầu đọc vi tấm tự động. Các phép đo từ tất cả các mẫu được chuẩn hóa thành nồng độ protein.

2.11. Xét nghiệm Na plus -K -ATPase

Đối với phép đo Na plus -K plus -ATPase (A 070-2-2, Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc), các tế bào được siêu âm và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng / phút trong 10 phút để thu được phần nổi phía trên. Các dung dịch phản ứng phát hiện Na plus -K plus -ATPase được thêm vào và ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm được phát hiện. Các phép đo của tất cả các mẫu được chuẩn hóa về nồng độ protein.

2.12. Phân tích Western blotting

Tế bào hoặc mô não được phân giải trong bộ đệm RIPA (5 0 mM Tris (pH 7,4), 15 0 mM NaCl, 1 phần trăm NP -40 (FNNO021, Thermo), 0,5 phần trăm natri deoxycholate (D6750, Sigma), 0,1% SDS (74255, Sigma) bổ sung chất ức chế protease và phosphatase (Roche, Thượng Hải, Trung Quốc). Nồng độ protein được xác định bằng Micro BCA Kit （Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc）. A {13 }} protein ug của mỗi mẫu được phân tách bằng SDS-PAGE sử dụng gel polyacrylamide TGX (Bio-Rad, Hercules, California, Hoa Kỳ) và sau đó được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Sau khi chặn, PVDF màng được ủ với các kháng thể sơ cấp cụ thể khác nhau trong TBST ở 4 độ qua đêm, sau đó rửa sạch và ủ trong kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase củ cải ngựa (HRP) tương ứng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các dải phản ứng miễn dịch được hình dung và phát hiện bằng phát quang hóa học tăng cường (ECL) cộng với thuốc thử phát hiện (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) và được phân tích bằng hệ thống hình ảnh ImageQuantM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Định lượng thời gian thực (Q) -và phiên mã ngược (RT) -PCR

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​mô não và tế bào nuôi cấy bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng bộ thuốc thử TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Nhật Bản). QPCR thời gian thực được thực hiện bằng SYBR Green Master Mix (Hệ thống sinh học ứng dụng) trong thiết bị StepOnePlus (Hệ thống sinh học ứng dụng). Các lớp sơn lót đã được mua và xác nhận bởi General (Thượng Hải, Trung Quốc). Các mồi được sử dụng cho qPCR được trình bày trong Bảng bổ sung 2.

2,14. Xét nghiệm lactate dehydrogenase (LDH)

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, các tế bào được mạ trong 96- đĩa giếng ở 5000 tế bào / giếng và môi trường nuôi cấy được thu thập để đo mức LDH bằng bộ xét nghiệm (Viện kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng). Sau đó, độ hấp thụ của các mẫu được phát hiện bằng Phổ Multiskan (Thermo Fisher Scientific) ở bước sóng 450 nm.

2.15.BODIPY493 / 503, BODIPY 581/591 C11, và nhuộm màu đỏ đậm MitoTracker

Tế bào sống được rửa sạch bằng PBS và ủ với 2ug / ml BOD-IPY 493/5 0 3 (InvitrogenTM, Cat D3922) hoặc BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1） （2. 0 μM , InvitrogenTM, Cat D3861） trong PBS trong 15 phút ở 37 độ. Đối với nhuộm MitoTracker Deep Red, các tế bào sống được ủ với 0,5 ug / ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) trong PBS trong 30 phút ở 37 độ. Sau đó, tế bào được rửa hai lần trong PBS và cố định trong 3,5 phần trăm PFA trong 10 phút, sau đó rửa và làm đối màu với Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) trong 10 phút trước khi được phủ lên lam kính để chụp ảnh. Hình ảnh được quan sát và chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

2,16. Hoechst và nhuộm PI

Tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33,342 （1 ul được pha loãng trong 5 0 0 ul PBS, Sigma, Cat B2261） và （hoặc） PI （0,1 ul được pha loãng trong 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) trong 10 phút và sau đó cố định và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

2.17. Đo tế bào dòng chảy

Tế bào được tiêu hóa và rửa sạch bằng D-hank's sau đó nhuộm bằng Annexin V-FITC （5 ul pha loãng trong 5 0 0ul PBS） / PI （0,1 ul pha loãng trong bộ dụng cụ apoptosis 500 ul PBS) (CA1020, Solarbio, Bắc Kinh, Chian) theo giao thức của nhà sản xuất. Sau đó, các tế bào apoptotic được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (ổi easyCyteTM 8, Millipore, Mỹ). Các phép đo điện thế màng ty thể và ROS ty thể được thực hiện như đã xuất bản 【12】. Tế bào SH-SY5Y được nhuộm bằng MitoSOX （2,5 μM, Invitrogen, USA） hoặc với Jul （10 ug / ml, T -3168, Invitrogen, USA） ở 37 độ trong 30 phút. Sau khi rửa bằng PBS hai lần, các tế bào sau đó được đưa trở lại trong PBS lạnh có chứa 1% FBS để phân tích tế bào dòng chảy. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Các xét nghiệm về hô hấp của cá ngựa

Chức năng hô hấp của ty thể trong các tế bào SH-SY5Y sống được đo bằng máy phân tích thông lượng ngoại bào Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) thông qua những thay đổi trong tốc độ tiêu thụ oxy (OCR). Tế bàoSH-SY5Y được gieo hạt ở 3 × 103 tế bào / giếng đã được phép dính vào các đĩa nuôi cấy tế bào Cá ngựa và đạt đến độ hợp lưu xấp xỉ 80 phần trăm tại thời điểm thí nghiệm. Ngày hôm sau, các tế bào được xử lý trước bằng Ka và sau đó tiếp xúc với MPp plus trong 24 giờ nữa. OCR được phát hiện trong các điều kiện cơ bản, sau đó bổ sung tuần tự 1 μM oligomycin, 1 μM FCCP, cũng như 1 μM rotenone & antimycin A.

2,19. Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Tầm quan trọng của sự khác biệt được xác định bằng phép thử t của Student, Phân tích phương sai hai chiều hoặc phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là bài kiểm tra sau bài học của Tukey. Sự khác biệt được coi là đáng kể ở P<>

3. Kết quả

Kết quả 1. Ka phục hồi rối loạn chức năng vận động và tăng mức dopamine trong thể vân của chuột mô hình MPTP / p PD

Để điều tra tác dụng bảo vệ thần kinh của cơ chế bệnh sinh Kaon PD, 4- chuột đực C57BL / 6 tháng tuổi được tiêm chất độc thần kinh MPTP để thiết lập mô hình MPTP / p PD và được điều trị bằng Ka (Hình la). Sau khi cảm ứng mô hình, thử nghiệm rotarod và thử nghiệm cực được sử dụng để đánh giá hoạt động vận động và hành vi của những con chuột trong các nhóm khác nhau. Như đã chỉ ra, thời gian hoạt động của rotarod đã giảm rõ rệt ở những con chuột được điều trị bằng MPTP, và hiệu ứng này đã được ngăn chặn bởi Ka (Hình 1b). Ka cũng khôi phục các hành vi thiếu hụt do MPTP gây ra, như được chỉ ra bằng việc giảm thời gian quay và tổng thời gian trong thử nghiệm cực (Hình lc và d), mà không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể của chuột (Hình le). Hơn nữa, phân tích HPLC cho thấy mức độ dopamine trong thể vân đã giảm đáng kể ở những con chuột được thử thách với MPTP / p và mức độ này được phục hồi nhờ điều trị Ka (Hình 1f. Điều trị Ka cũng làm giảm sự giảm dihydroxy do MPTP / p gây ra -phenyl acetic acid (DOPAC, một chất chuyển hóa của dopamine) trong thể vân (Hình 1g).

Kết quả 2. Ka làm giảm bớt sự mất tế bào thần kinh DA trong SNpc của chuột mô hình MPTP / p PD

Tiếp theo, để đánh giá thêm tác dụng bảo vệ thần kinh của suy giảm tế bào thần kinh DA do Kaon MPTP / p gây ra, chúng tôi đã kiểm tra tyrosine hydroxylase (THD cộng với tế bào thần kinh trong SNpc của chuột bằng phương pháp nhuộm miễn dịch. Như được thể hiện trong Hình 2a và b, MPTP / p gây ra sự giảm đáng kể về số lượng tế bào thần kinh TH cộng, đã được giảm bớt bằng phương pháp điều trị Ka. Hơn nữa, số lượng lập thể của tổng số tế bào thần kinh trong SNpc, theo định nghĩa của Nissl

Hình 1. Điều trị Ka làm giảm rối loạn chức năng vận động và tăng mức dopamine trong thể vân của chuột mô hình MPTP / p PD.

(a) Sơ đồ thiết kế thí nghiệm. (b) Thời gian trên thanh được đo cho thử nghiệm rotarod trong ba ngày liên tiếp. (cd) Thời gian quay vòng (thời gian quay) và hạ xuống cột (thời gian leo lên) được ghi lại cho thử nghiệm cực. (e) Trọng lượng cơ thể chuột được đo khi kết thúc nghiên cứu. (fg) Dopamine (DA) và axit dihydroxy-phenyl axetic (DOPAC) trong thể vân được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM.n =9-10 cho mỗi nhóm trong (b, c, d); n =6-8 cho mỗi nhóm trong (f, g) .ns, không đáng kể, * P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

nhuộm, xác minh rằng sự mất đi các tế bào TH phản ánh sự chết của tế bào chứ không phải sự điều hòa biểu hiện TH và cho thấy rằng điều trị Ka đã khôi phục sự giảm số lượng tế bào thần kinh dương tính Nissl trong SNpc của những con chuột được điều trị MPTP từ 43,3% xuống 25,4% ( Hình 2c và d) Ngoài ra, Ka cải thiện đáng kể sự giảm biểu hiện protein TH và DAT do MPTP gây ra, được đo bằng phương pháp Western blotting (Hình 2e-g). Bằng chứng này xác nhận tác dụng bảo vệ thần kinh của Ka trên mô hình chuột PD.

Kết quả 3. Ka làm giảm sự tích tụ của không bào LD và stress oxy hóa trong SNpc của chuột được điều trị bằng MPTP / p

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự liên quan của LDs trong NDDs [10], nhất quán, công trình trước đây của chúng tôi đã xác định LDs tăng lên trong SNpc của chuột PD do MPTP gây ra [12]. LDs có thể được xác định dễ dàng và cho thấy cấu trúc tròn, mật độ thấp với nội dung vô định hình đồng nhất [28]. Thông thường, LD có thể bị phân hủy thông qua autophagy để tránh tích tụ [29]. Để điều tra xem Ka có thể điều chỉnh LDs trong PD hay không, sự tích tụ của LD được phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) trong SNpc của chuột đối chứng, MPTP / p và MPTP / p cộng với Ka. Như đã trình bày trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [12], số lượng và kích thước LDs đã tăng lên ở chuột MPTP / p so với đối chứng được xử lý bằng nước muối (Hình 3a và b) và giảm đáng kể ở chuột được điều trị bằng Ka (Hình 3c- e). Hơn nữa, ở những con chuột được điều trị bằng Ka, LD được quan sát thấy thường xuyên hơn ở gần, được bao bọc hoặc bị phân hủy bởi các tự phân tử, được định nghĩa là các hạt lipofuscin đậm đặc điện tử. Nhuộm mô học hơn nữa của tế bào thần kinh TH * với BODIPY, một loại thuốc nhuộm đặc biệt đánh dấu lipid trung tính và thường được sử dụng để phát hiện LD [30], cho thấy rằng cả số lượng và kích thước của BODIPY LDs trong SNpc ở chuột PD đều cao hơn so với đối chứng, và đã giảm đáng kể khi xử lý Ka (Hình 3f-h).

Nếu LDs không được phân hủy kịp thời, các LD tích lũy có thể trải qua quá trình peroxy hóa và góp phần gây ra căng thẳng qua trung gian ROS của ty thể [4], làm khuếch đại độc tính thần kinh và sự phát triển của bệnh. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra thêm các cấu hình biểu hiện của các gen liên quan đến việc bảo vệ chống lại độc tính FA tự do (Gpx8), trung hòa các loài oxy hóa, các gốc superoxide (Sod3) và hydrogen peroxide (Cat), và chuyển hóa FA (Acsbg1 và Dbi) như đã báo cáo [31] , tất cả đều giảm đáng kể ở SNpc của chuột được điều trị bằng MPTP so với đối chứng, và những tác động này được cải thiện ở chuột PD được điều trị bằng Ka (Hình 3i). Tương tự, MPTP / p cũng làm tăng mức độ biểu hiện mRNA

Hình 2. Ka cải thiện sự mất các tế bào thần kinh DA trong SNpc của chuột mô hình MPTP / p PD.

(ab) Hình ảnh vi mô của tế bào thần kinh dương tính tyrosine hydroxylase (TH) (a) và số lượng lập thể của tế bào thần kinh dương tính với TH trong chất nền (SNpc) (b). Các thanh tỷ lệ như được chỉ ra. (cd) -tế bào dương tính (c) và số lượng lập thể của tế bào dương tính với cresyl tím trong SNpc (d). Thanh tỷ lệ, 120μm. （Ví dụ: phân tích Western blot về biểu hiện của protein TH và DAT trong SNpc （e） và phân tích định lượng （f, g）. Dữ liệu định lượng được chuẩn hóa cho nhóm kiểm soát mặn. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM. * P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Kết quả 4. Ka bảo vệ tế bào SH-SY5Y chống lại quá trình chết rụng do MPP cộng thêm

MPP plus, chất chuyển hóa có hoạt tính của MPTP, ức chế enzym com-plex của ty thể và gây chết tế bào liên quan trực tiếp đến PD [32]. Tiếp theo, chúng tôi điều tra xem liệu Ka có thể ngăn chặn quá trình chết rụng tế bào thần kinh do MPP cộng với gây ra trong ống nghiệm hay không. Như được thể hiện trong Hình 4a và b, MPPt （400 μM, 24 giờ gây ra sự giải phóng LDH từ các tế bào SH-SY5Y, và Ka (30 và 60 μM） giải phóng LDH giảm đáng kể mà không ảnh hưởng đến sự sống còn của tế bào (Hình 4a). Vì Ka gây ra tác dụng bảo vệ đáng kể ở nồng độ 30 μM （Hình 4b）, chúng tôi đã sử dụng nồng độ này trong các thí nghiệm tiếp theo. (Hình 4c và d) và quá trình chết rụng tế bào, được chứng minh bằng cường độ huỳnh quang Hoechst tăng lên (Hình 4c) và tỷ lệ tế bào nhuộm Hoechst / PI (Hoechst plus / PI plus) (Hình 4e). Ngoài ra, như được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy, quá trình chết rụng tế bào do MPPt gây ra, bằng chứng là phần trăm tế bào nhuộm Annexin V tăng lên (AV plus / PI- và AV plus / Prt) được bảo vệ bởi Ka (Hình 4f và g). Ngoài ra, Ka bị đảo ngược đáng kể MPP cộng với những thay đổi gây ra trong biểu hiện protein liên quan đến quá trình apoptosis, được chứng minh bằng sự điều chỉnh của B cl -2, điều hòa giảm Bax (Hình 4hi-j) và giảm sự phân cắt của caspase -3 (Hình 4h, k). Những dữ liệu này cho thấy rằng Ka có thể loại bỏ các tác động bất lợi của MPp plus đối với Sự sống còn của tế bào.

Kết quả 5. Ka ngăn chặn sự tích tụ LD gây ra bởi MPp và quá trình peroxy hóa lipid, làm trung gian tổn thương ty thể trong tế bào SH-SY5Y

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng sự tích tụ LD không mong muốn có thể dẫn đến tăng căng thẳng qua trung gian peroxy hóa lipid và tăng tốc độ rối loạn chức năng ty thể, thúc đẩy quá trình thoái hóa thần kinh [10]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cũng chỉ ra rằng LDs tăng lên trong SNpc có liên quan đến bệnh lý PD ở chuột [12]. Để điều tra xem liệu tác dụng bảo vệ của Ka có liên quan đến sự tích tụ LD trong ống nghiệm hay không, trước tiên chúng tôi thực hiện nhuộm đặc hiệu LD trong các tế bào SH-SY5Y bằng cách sử dụng BODIPY 493/503 và quan sát thấy sự lắng đọng LD tăng lên (tăng mức độ lipid trung tính)

Hình 3. Ka làm giảm sự tích tụ của không bào LD dày đặc điện tử và quá trình oxy hóa lipid trong SNpc của chuột được điều trị bằng MPTP / p.

(ac) Hình ảnh EM đại diện cho thấy không bào sáng điện tử (giọt lipid), không bào tự sinh dày đặc điện tử có chứa tự phân bào (ALS), hoặc lysosome chứa lipofuscin (Lys) trong SNpc của chuột được điều trị bằng nước muối (a), MPTP / p (b), và MPTP / p cộng với Ka (c). vạch tỷ lệ, 500 nm. Với (a, b) như đã chỉ ra trong công việc trước đây của chúng tôi (PMID: 29967574). (de) Định lượng không bào LD sáng electron trên mỗi tế bào thần kinh trong SNpc ở những con chuột được chỉ định. n =3 chuột, 10-12 tế bào thần kinh mỗi nhóm. (fh) Các phần não giữa từ nước muối, MPTP / p-, và MPTP / p cộng với chuột được điều trị bằng Ka được nhuộm màu để tìm BODIPY (LDs) và TH (tế bào thần kinh DA). Các bảng ngoài cùng bên phải hiển thị độ phóng đại của các tế bào thần kinh BODIPY cộng với TH. Các mũi tên cho biết LD. (Gh), định lượng BODIPY cộng với số lượng và kích thước LD. (ii) biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến độc tính FFA (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 và Dbi) (i) và các gen stress oxy hóa (Nox1, Nox2 và Nox4) (j) trong SNpc của những con chuột được chỉ định đã được phân tích theo thời gian thực qPCR.n=4-5 cho mỗi nhóm, ba thử nghiệm độc lập. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM; ns, không đáng kể, * P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Bài viết này được trích từhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Nhận ngày 23 tháng 11 năm 2020