Đánh giá khả năng vận chuyển qua đường ruột của chiết xuất giàu phenylethanoid Glycoside từ Cistanche Deserticola qua mô hình đơn lớp tế bào Caco-2

Giới thiệu

Dòng tế bào Caco-2, có nguồn gốc từ ung thư biểu mô tuyến đại tràng ở người, biểu hiện các đặc điểm giống tế bào ruột. Trong điều kiện bình thường, tế bào Caco-2 biệt hóa một cách tự nhiên với tế bào trưởng thành và tạo thành các lớp đơn nguyên vẹn. Các tế bào lân cận bám dính thông qua các mối nối chặt chẽ được hình thành ở phía đỉnh của lớp đơn lớp, có thể phân biệt các tế bào một cách thụ động.và vận chuyển tích cực thuốc qua lớp biểu mô. Do sự tương đồng về hình thái và sinh hóa với các tế bào ruột bình thường, các tế bào đơn lớp Caco{0}} đóng vai trò là mô hình in vitro được chấp nhận rộng rãi để nghiên cứu khả năng hấp thu ở ruột và các đặc tính vận chuyển của thuốc.

Ngược lại với hóa chất, chiết xuất thực vật (PE) là hỗn hợp có hoạt tính sinh học và thành phần hoạt tính thường không được xác định rõ ràng. Hơn nữa, đặc tính vận chuyển qua đường ruột của PE, trái ngược với đặc tính của các thành phần của nó, có liên quan chặt chẽ đến việc sử dụng lâm sàng. Các phép đo thông lượng cho mẫu thử nghiệm trên lớp đơn lớp tế bào Caco{0}} thường liên quan đến các phương pháp hóa học, chẳng hạn như HPLC, LC/MS, v.v. Mặc dù các phương pháp này là những công cụ mạnh mẽ nhưng chúng rất phức tạp, tốn thời gian, đắt tiền và đôi khi yêu cầu trang thiết bị phức tạp. Quan trọng hơn, không một thành phần đơn lẻ hay thiểu số nào có thể phản ánh toàn bộ PE. Vì vậy, cần thiết lập một cách tiếp cận mới độc lập với việc xác định các thành phần để xác định và đánh giá các đặc tính vận chuyển của PE.

Cistanche Deserticola YC Ma (CD), một loại cây ký sinh toàn thân, là một loại thuốc truyền thống phổ biến của Trung Quốc, chủ yếu được sử dụng để điều trị chứng suy thận, suy nhược cơ thể và táo bón, và những công dụng này đã được ghi nhận chính thức trong Dược điển Trung Quốc.Phenylethanoid glycoside (PhGs), bao gồm echinacoside (EC), Acteoside (AC) và isoacteoside (IS), v.v., là một nhóm các hợp chất polyphenolic. Chúng được coi là một trong những thành phần hoạt tính sinh học chính của loài Cistanche. Các nghiên cứu dược lý đã chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của PhG rất đa dạng và bao gồm các tác dụng chống oxy hóa, chống mệt mỏi, bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch, chống viêm và bảo vệ thần kinh. Tuy nhiên, đặc điểm vận chuyển qua đường ruột của PhG chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khám phá tính thấm qua ruột của chiết xuất giàu PhG (PRE) từ CD như một hệ thống tích hợp và tính thấm của ba PhG chính (AC, IS và EC) trong các tế bào Caco-2 biệt hóa. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng PRE chủ yếu được vận chuyển thông qua khuếch tán thụ động được hấp thụ kém theo gradient nồng độ mà không chảy ra ngoài, điều này cung cấp cơ sở dược động học cho ứng dụng lâm sàng của PhG trong CD.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên vật liệu

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) được mua từ Công ty Công nghệ sinh học Must (Thành Đô, Trung Quốc). Môi trường Eagle sửa đổi (DMEM), huyết thanh bào thai bò (FBS) và axit amin không thiết yếu (NEAA) của Dulbecco được sản xuất bởi Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-Các tấm TranswellTM giếng (chèn diện tích màng tăng trưởng 4,67 cm2 ) được lấy từ Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Collagen đuôi chuột được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tất cả thuốc thử và hóa chất để phân tích HPLC đều thuộc loại phân tích.

Chuẩn bị PRE từ CD

Vật liệu CD được sấy khô trong không khí được nghiền thành bột và chiết xuất bằng cách thẩm thấu với 70% etanol. Phần giàu PhG được điều chế như mô tả trước đây và chiết bằng rượu n-butyl bão hòa nước. Dịch chiết được cô đặc và sấy khô dưới áp suất giảm. Phương pháp quang phổ UV-nhựa xốp vĩ mô đã đo được hàm lượng PhG là 78,4%. Mẫu cuối cùng đại diện cho hiệu suất nguyên liệu thô là 1,75% tính theo trọng lượng khô. Mẫu thu được được bảo quản ở −20 độ cho đến khi sử dụng tiếp.

Xác định AC, IS và EC bằng HPLC

Hệ thống HPLC Shimadzu được trang bị phần mềm giải pháp LC đã được sử dụng để phân tích hàm lượng AC, IS và EC trong PRE. Cột Intersil C18 pha đảo (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) đã được sử dụng và duy trì ở nhiệt độ phòng. Các pha động là axetonitril và nước chứa 0,1% axit photphoric (v/v) với quá trình rửa giải gradient (Bảng 1) ở tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Máy dò quang phổ UV được đặt ở bước sóng 334 nm. Để xác định chính xác dòng AC và IS, chúng tôi đã phát triển phương pháp phát hiện huỳnh quang HPLC (HPLC-FLD) mới. Sau khi phân tích cấu trúc và quét bước sóng huỳnh quang (dữ liệu không được hiển thị), chúng tôi đã thu được các điều kiện phát hiện huỳnh quang tối ưu cho AC (Ví dụ: 338 nm, Em: 448 nm) và IS (Ví dụ: 320 nm, Em: 434 nm).

Phương pháp phân tích HPLC được xác nhận bằng cách sử dụng các đặc tính hiệu suất sau: độ ổn định, độ tuyến tính, độ nhạy, độ chính xác (biến thiên trong và giữa các ngày) và độ chính xác. Các chất phân tích trong đệm vận chuyển được bảo quản ở nhiệt độ 25 độ trong bóng tối trong 24 giờ và độ ổn định của chúng được đo. Các chất phân tích có độ ổn định cao khi có mặt vitamin C (0,4%) vì giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ở các vùng pic là < 3,5%. Phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan, phạm vi tuyến tính, LOD và LOQ cho AC, IS và EC được trình bày trong Bảng 2. LOD (18–30 nM) và LOQ (60–100 nM) các giá trị minh họa rằng phương pháp HPLC-FLD và HPLC-UV có độ nhạy cao. Các giá trị RSD biểu thị độ chính xác của phương pháp đều < 2% đối với độ biến thiên trong và giữa các ngày, cho thấy độ chính xác tốt. Để đánh giá độ thu hồi, AC, IS và EC được thêm vào đệm vận chuyển để tạo ra ba mức nồng độ (cao, trung bình và thấp). Giá trị thu hồi của phương pháp đối với các chất phân tích được tóm tắt trong Bảng 3. Độ thu hồi trung bình dao động từ 90,0% đến 96,4%, cho thấy độ chính xác tốt. Tóm lại, các phương pháp HPLC đã thiết lập là thỏa đáng về độ tuyến tính, độ nhạy, độ đúng và độ chính xác để định lượng AC, IS và EC trong đệm vận chuyển.

Xác định PRE bằng hệ thống xét nghiệm sinh học

Xét nghiệm sinh học (tổng khả năng chống oxy hóa) dựa trên xét nghiệm FRAP (khả năng khử sắt/chống oxy hóa) mà chúng tôi đã mô tả trước đây [16] và được xác nhận về mặt tuyến tính và độ chính xác (biến thiên trong ngày và giữa các ngày). Độ tuyến tính của phương pháp xét nghiệm sinh học được xác định dựa trên đường cong hiệu chuẩn. Khoảng nồng độ tuyến tính là 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Độ chính xác của phương pháp xét nghiệm sinh học đã thiết lập được xác định dựa trên độ biến thiên trong và giữa các ngày đối với phân tích PRE (10,0 ug/ml). Độ lặp lại trong ngày của phương pháp được xác định dựa trên năm lần xác định liên tiếp trong cùng một ngày. Độ lặp lại giữa các ngày được đo dựa trên năm lần xác định liên tiếp vào ba ngày khác nhau. Các giá trị RSD cho độ chính xác của phương pháp lần lượt là 1,014% và 4,72% đối với độ biến thiên trong ngày và giữa các ngày, cho thấy độ chính xác tốt. Do đó, phương pháp xét nghiệm sinh học đã thiết lập đáp ứng được yêu cầu về tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác để định lượng PRE trong đệm vận chuyển.

Nuôi cấy tế bào

Tế bào Caco{0}} được nuôi cấy ở nhiệt độ 37 độ và độ ẩm tương đối 95% trong môi trường có chứa 5% CO2 và môi trường bao gồm DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamine, penicillin (100 U/ml) và streptomycin (100 ug/ml). Môi trường được thay đổi cách ngày trong quá trình phát triển và biệt hóa tế bào. Các tế bào được nuôi cấy trong bình nhựa 75-cm2 và được thu hoạch 3–5 ngày một lần với 0,05% EDTA-trypsin. Đối với các thí nghiệm vận chuyển, các tế bào được gieo hạt với mật độ 1×105 tế bào/cm2 trên các miếng chèn Transwell được phủ collagen. Khoảng 21 ngày sau khi gieo hạt, các lớp đơn được sử dụng cho các thí nghiệm vận chuyển. Tính toàn vẹn của chúng được xác định bằng cách đo điện trở xuyên biểu mô (TEER) trên các lớp đơn lớp bằng EVOM được trang bị ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Giá trị TEER của lớp đơn tế bào Caco-2 cần vượt quá 500 O∙cm2.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ LÀM DỊU VÀ THUỐC NHẠC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Thí nghiệm vận chuyển

Lớp đơn được rửa bằng dung dịch đệm vận chuyển (dung dịch đệm P chứa 10 mM HEPES, 1 mM natri pyruvate, 10 mM glucose, 3 mM CaCl2 và 145 mM NaCl, pH 7,4) rồi ủ trước trong 20 phút ở 37 độ. Sau khi loại bỏ đệm vận chuyển, đệm vận chuyển mới chứa các mẫu thử nghiệm đã được thêm vào buồng đỉnh (AP) (1,5 ml) trong nghiên cứu định hướng AP đến cơ bản (BL) hoặc buồng BL (2,5 ml) trong nghiên cứu định hướng BL đến AP. Đối với các xét nghiệm AC, IS và EC sử dụng HPLC, một lượng dịch (300 ul) được lấy ra khỏi mỗi buồng thu ở các khoảng thời gian khác nhau (30, 60, 90 và 120 phút). Buồng thu được bổ sung cùng một thể tích đệm vận chuyển mới được làm nóng trước (37 độ) sau mỗi lần lấy mẫu. Các mẫu thu thập được bảo quản ở −20 độ để sử dụng tiếp. Để xác định PRE bằng xét nghiệm sinh học, chỉ lấy mẫu sau 120 phút. Do tính không ổn định của PRE, AC, IS và EC, vitamin C 0,4% (w/v) đã được thêm vào để ổn định các mẫu nhằm xác định hàm lượng AC, IS và EC bằng HPLC và các mẫu dùng cho xét nghiệm sinh học PRE được được xét nghiệm ngay sau khi lấy mẫu. Giá trị hệ số thấm biểu kiến ​​(Papp hoặc 'Papp) của từng mẫu đã được tính toán.

Phân tích dữ liệu

Các giá trị Papp theo các hướng AP BL hoặc BLAP của AC, IS và EC được tính toán dựa trên phương trình sau: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), trong đó Papp là hệ số thấm biểu kiến ​​(cm/s) được xác định bằng HPLC. (4Q/4t) là tốc độ xuất hiện của hợp chất thử nghiệm (AC, IS hoặc EC) ở phía máy thu (μmol/s); A là diện tích bề mặt của hạt dao (cm2); C0 là nồng độ hợp chất thử nghiệm ban đầu ở phía cho (µmol/ml). Cụ thể, đơn vị khối lượng "ug" được sử dụng thay cho "μmol" khi tính giá trị 'Papp. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng phương tiện ± SD.

Kết quả

Thành phần AC, IS và EC trong PRE từ CD

Bởi vì AC, IS và EC được coi là các hoạt chất sinh học chínhPhG của loài Cistanche, chúng tôi đã phân tích nội dung của chúng trong PRE thông qua HPLC-UV. Sắc ký đồ đại diện được thể hiện trong Hình 1. Việc xác định các thành phần này dựa trên việc so sánh thời gian lưu và phổ UV với các tiêu chuẩn đích thực ở bước sóng 334 nm. Hàm lượng AC, IS và EC trong PRE lần lượt là 26,60%, 1,84% và 32,83%. Như vậy, 3 hợp chất này chiếm 61,27% trong PRE; Hơn nữa, kết quả trên cho thấy hàm lượng PhG trong PRE là 78,4%. Do đó, AC, IS và EC chiếm khoảng 80% PhG trong PRE.

Tổng khả năng chống oxy hóa của PRE, AC, IS và EC

Các nghiên cứu củaHoạt tính chống oxy hóa của PhGtừ CD đã được báo cáo và AC, IS và EC chiếm khoảng 80% PhG trong PRE. Do đó, tổng khả năng chống oxy hóa của PRE, AC, IS và EC đã được thử nghiệm và biểu thị bằng các giá trị FRAP (× 10–6 mmol). Như được hiển thị trong Hình 2, khi giá trị FRAP là 8 × 10–6 mmol, nồng độ cuối cùng của PRE, AC, IS và EC là 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml và 4,89 ug /ml tương ứng cho thấy tổng khả năng chống oxy hóa của 4 mẫu này được xếp hạng như sau: AC > EC > PRE > IS. Hoạt tính sinh học của PRE được quy cho các nhóm hoạt chất (AIG). Đối với khoảng 60% PRE, AC và EC cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tổng thể mạnh hơn PRE và IS. Bởi vì IS (1,84%) chiếm một phần rất nhỏ của PRE nên các thành phần khác, chẳng hạn như IS có khả năng chống oxy hóa yếu, cũng hoạt động rõ ràng trong PRE. Điều đáng ngạc nhiên là hoạt tính chống oxy hóa tổng thể khác nhau gần như 7-gấp giữa AC và đồng phân IS của nó, cho thấy rằng không chỉ số lượng nhóm hydroxyl phenolic mà cả vị trí của nhóm phenolic hydroxyl trong phân tử cũng ảnh hưởng đến tác dụng chống oxy hóa .

Xác thực các lớp đơn Caco-2

Để xác thực hệ thống đơn lớp tế bào Caco-2, các giá trị Papp của propranolol (điểm đánh dấu được vận chuyển tốt) và màu vàng Lucifer (điểm đánh dấu được vận chuyển kém) từ AP đến BL trên các đơn lớp Caco-2 là được xác định lần lượt là 1,51 × 10–5 cm/s và 2,8 × 10–7 cm/s, và những giá trị này phù hợp với những giá trị được công bố trong các báo cáo trước đó. Xét nghiệm hoạt tính phosphatase kiềm cũng xác nhận rằng các lớp đơn tế bào Caco{11}} có chất lượng tương đương với biểu mô ruột non.

Độ thấm của AC, IS và EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), trong khi đó những thuốc hấp thu kém thì thấp (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Tính thấm của PRE

Kết quả trên cho thấy tổng khả năng chống oxy hóa của PRE ít nhất là do 61,27% AIG từ PRE. Do đó, chúng tôi đã đánh giá TR của PRE dựa trên đường cong hiệu ứng nồng độ của tổng khả năng chống oxy hóa và tính toán giá trị 'Papp để phản ánh các đặc tính vận chuyển của PRE. Giá trị 'Papp của PRE cho AP!BL và BL!AP là (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s và (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, tương ứng, chỉ ra rằng hợp chất này có khả năng thẩm thấu kém. Hơn nữa, dòng chảy ra ngoài hoặc vận chuyển tích cực không rõ ràng vì tỷ lệ 'Papp BL với AP / 'Papp AP với BL đối với PRE là 1,45. Hơn nữa, TR hai chiều của PRE tăng tuyến tính trong khoảng từ 300 đến 900 ug/ml (Hình 5). Việc thiếu ưu tiên định hướng của kết quả cho thấy khuếch tán thụ động là cơ chế vận chuyển chính của PRE.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cuộc thảo luận

So với các sản phẩm thuốc có độ tinh khiết cao, PE nói chung là hỗn hợp bao gồm hàng trăm thành phần có đặc tính lý hóa rất khác nhau. Do đó, PE thực hiện hoạt động hiệp đồng có hệ thống, đa mục tiêu và đa kênh do AIG phức tạp của chúng [21], điều này cản trở việc phân tích các đặc tính vận chuyển của PE. Để đánh giá các đặc tính vận chuyển của PE một cách khoa học hơn, một số nhà nghiên cứu đã xác định được nhiều thành phần, thay vì một thành phần duy nhất trong PE [22–24]. Tuy nhiên, một số lượng hạn chế các thành phần cấu thành không thể phản ánh toàn bộ PE. Tuy nhiên, việc xác định tất cả các thành phần trong PE là không thể. Hơn nữa, nếu các thành phần đa dạng trong PE thể hiện các đặc tính vận chuyển hoàn toàn khác nhau thì sẽ khó xác định được các đặc điểm vận chuyển tổng thể của PE.

Vào những năm 1990, hệ thống xét nghiệm sinh học đã được sử dụng để đánh giá TR của các chất chống vi trùng [25]. Đến năm 2005, Eguchi và các đồng nghiệp [26] đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất cà rốt bằng cách sử dụng môi trường BL từ các tế bào Caco-2 biệt hóa; cách tiếp cận này phù hợp hơn để phản ánh các tình huống in vivo.

Dựa trên báo cáo trước đây về hoạt động của PhG và kết quả của chúng tôi (Hình 2), TR của AIG trong PRE có thể được đánh giá bằng cách xác định tổng khả năng chống oxy hóa của môi trường trong buồng thu. Sau các thử nghiệm vận chuyển, chúng tôi thấy rằng TR của PRE tương tự nhau theo cả hai hướng và quá trình vận chuyển này không bão hòa và được hấp thụ kém ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), và nó không chỉ ra dòng chảy, cho thấy rằng khuếch tán thụ động xuống gradient nồng độ là cơ chế vận chuyển chính của PRE (Hình 5). Hơn nữa, đặc tính vận chuyển của PRE nhất quán với đặc tính vận chuyển của AC, IS và EC, các thành phần hiệu quả thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trong PRE (Hình 4 và Bảng 4). Kết quả này nằm ngoài dự kiến ​​và chỉ ra rằng hệ thống xét nghiệm sinh học hiện tại phù hợp và đáng tin cậy để đánh giá các đặc tính vận chuyển của AIG trong PRE trong các tế bào Caco{10}} biệt hóa.

Ngược lại với giá trị Papp chuẩn, thường được sử dụng để phản ánh sự vận chuyển của một hợp chất đơn lẻ, giá trị 'Papp thu được từ TR dựa trên đường cong hiệu ứng nồng độ có thể không chỉ phản ánh các thành phần xuyên qua các lớp đơn có cấu trúc nguyên vẹn mà còn cũng liên quan đến các yếu tố khác liên quan đến hoạt động mục tiêu, chẳng hạn như chất chuyển hóa của các thành phần, sản phẩm bị phân hủy về mặt hóa học và thậm chí một số cytokine được tiết ra từ tế bào Caco-2 để đáp ứng với kích thích có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học mục tiêu. Do đó, đa yếu tố được đề cập ở trên, thay vì chỉ các thành phần nguyên vẹn được vận chuyển, sẽ xác định 'giá trị Papp'. Do đó, 'Papp có thể tương quan mạnh mẽ hơn với các tình huống in vivo so với giá trị Papp chuẩn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã làm rõ bản chất khuếch tán thụ động và hấp thu kém của PRE dựa trên giá trị 'Papp của nó và bản chất này có thể liên quan đến liều lượng cao và thời gian điều trị lâm sàng dài của CD. Tuy nhiên, những phát hiện này sẽ cung cấp hướng dẫn có hệ thống hơn cho các bác sĩ lâm sàng trong việc áp dụng CD khi chỉ xác định được các đặc điểm vận chuyển của hầu hết AIG trong CD chứ không chỉ PhG.

Tuy nhiên, mục hoạt tính sinh học được chọn phải đủ nhạy để được phát hiện trong môi trường của buồng thu, điều này đặt ra thách thức đối với việc thiết lập hệ thống xét nghiệm sinh học để đánh giá các đặc tính vận chuyển của PE. Hơn nữa, hoạt tính sinh học cũng nên phụ thuộc vào càng nhiều thành phần càng tốt. Trong nghiên cứu của chúng tôi, xét nghiệm tổng khả năng chống oxy hóa thích hợp hơn một số phương pháp khác (Hình S1). Nhưng ngay cả như vậy, xét nghiệm của chúng tôi chỉ có thể phát hiện TR của PRE sau 120 phút.

Nói chung, nghiên cứu hiện tại đã thiết lập một hệ thống xét nghiệm sinh học mới để đánh giá tính thấm qua ruột của PRE trong các tế bào Caco-2 biệt hóa. Kết quả thu được cho thấy cơ chế khuếch tán thụ động kém hấp thụ theo gradient nồng độ mà không chảy ra ngoài là cơ chế vận chuyển chính của PRE (Hình 5), cung cấp cơ sở dược động học cho ứng dụng lâm sàng của PhGs trong CD. Việc sử dụng hệ thống xét nghiệm sinh học mới để đánh giá TR và từ đó tính toán giá trị 'Papp để đánh giá đặc tính vận chuyển qua đường ruột của AIG trong PE là khả thi. Cách tiếp cận này cũng có thể phù hợp với các PE khác có hoạt tính sinh học thích hợp.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%