Thí nghiệm 3 Tác dụng của Cistanche Deserticola Phenylanol Glycoside trên mô hình chuột tiền mãn kinh Ⅲ

Thí nghiệm 3 Tác dụng của Cistanche Deserticola phenylanol glycoside trên mô hình chuột tiền mãn kinh

1 Vật liệu thí nghiệm

1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột Wistar, loại SPF, con cái, do Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd. cung cấp, số chứng nhận chuột cho lô này: 0017216; số chứng chỉ phòng thí nghiệm SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Thuốc thử nghiệm

Cistanche Deserticola phenyletanol glycosideđược điều chế theo phương pháp của Thí nghiệm 1, hàm lượng đạt 66,47%. Viên nang Gengnian'an, thành phần: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, vỏ hoa mẫu đơn, Poria cocos, xà cừ, curculigo, Schisandra chinensis, magnetite, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, lúa mì nổi, Polygonum multiflorum . Chức năng và chỉ dẫn:Nuôi dưỡng âm và khuất phục dương, giảm bớt rắc rốivà làm dịu tâm trí. Dùng cho người mãn kinh bốc hỏa, đổ mồ hôi, chóng mặt, ù tai, khó chịu và mất ngủ. Thông số kỹ thuật: 0,3g mỗi viên. Cách dùng và liều lượng: Uống, mỗi lần 3 viên, ngày 3 lần. Nhà sản xuất: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Số lô sản xuất: 121104. Số phê duyệt: Giấy phê duyệt thuốc quốc gia số Z14021848.

Isoflavone đậu nành và viên nang mềm vitamin E, danh sách thành phần: bột isoflavone đậu nành, vitamin E, dầu hướng dương, gelatin, glycerin, nước, tartrazine, titan dioxide. Thành phần và hàm lượng mang tính biểu tượng: Mỗi 100g chứa 55,2 mg isoflavone đậu nành (được tính bằng genistein) và 608,5 mg vitamin E. Chức năng sức khỏe: Tăng mật độ xương. Hướng dẫn sử dụng và liều lượng: Uống 1 viên ngày 2 lần với nước ấm. Quy cách: 500mg×100 viên. Nhà sản xuất: Công ty TNHH Phát triển Công nghệ sinh học Weihai Ziguang. Số lô sản xuất: 13070302. Số phê duyệt: National Food Health G20080032.

MẤT BAO LÂU ĐỂ CISTANCHE CÓ HOẠT ĐỘNG?

1.3 Thuốc thử thí nghiệm

Carboxymethylcellulose natri, Công ty TNHH Sản xuất thuốc thử hóa học Thiên Tân Hengxing, số lô: 20120418; penicillin natri pha tiêm, Công ty TNHH Dược phẩm Bắc Trung Quốc, quy cách: 4 triệu đơn vị, số lô sản xuất: c1206807;

Dung dịch formaldehyde (tinh khiết phân tích), Công ty TNHH Hóa chất Shuangshuang Yên Đài, số lô sản xuất: 20130902; Thuốc tiêm natri clorua 0,9%, Công ty TNHH Dược phẩm Hà Nam Shuanghe Huali; quy cách: 250ml, số lô sản xuất: 13082405B;

Chloral hydrat, Viện nghiên cứu hóa chất tốt Quảng Phúc Thiên Tân, số lô 20120827; Bộ phát hiện ELISA Rat E2, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Bộ phát hiện ELISA Rat T, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Bộ phát hiện ELISA Rat LH, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Bộ phát hiện ELISA Rat FSH, Công ty R&D, số lô: 20140101A;

2 phương pháp thí nghiệm

2.1 Mô hình hóa và Quản lý Dược

Phương pháp mô hình hóa: Lấy 1 con chuột Wistar cái có trọng lượng cơ thể từ 210~230g, chọn ngẫu nhiên 12 con chuột làm nhóm trống và trải qua phẫu thuật giả, những con chuột còn lại sẽ được sử dụng để tạo ra thời kỳ mãn kinh các mô hình. Sau khi cân chuột, chuột được gây mê bằng cách tiêm 10% cloral hydrat (0,3ml/100g) vào màng bụng và cố định tư thế bụng. Sau đó, chuột được cắt tỉa từ dưới xương sườn cuối cùng trên lưng tại điểm giao nhau của đường nách giữa và cách mặt ngoài cột sống khoảng 2 cm rồi khử trùng. Da và cơ lưng được rạch khoảng 1 cm, trong tầm nhìn của vết mổ có thể nhìn thấy một khối mỡ sáng bóng màu trắng sữa, buồng trứng được nhúng vào trong đó. Dùng nhíp nhỏ nhẹ nhàng nắm lấy khối mỡ rồi kéo ra khỏi vết mổ, tách khối mỡ ra, bạn sẽ thấy một nhóm buồng trứng mỏng, không đều, màu vàng đỏ. Khi cắt, trước tiên hãy dùng một sợi chỉ mỏng buộc ống dẫn trứng (kể cả mỡ) phía dưới buồng trứng, cắt bỏ hoàn toàn buồng trứng trái, cắt bỏ 80% buồng trứng phải. Sau ca phẫu thuật, sừng tử cung được đưa trở lại khoang bụng, các cơ và da được khâu lại, đồng thời cả hai buồng trứng cũng được cắt bỏ theo cách tương tự. Sau phẫu thuật, động vật được nuôi dưỡng cẩn thận và tiêm bắp 200,000 u/kg penicillin (mỗi loại 0,1ml) để ngăn ngừa nhiễm trùng, mỗi ngày một lần trong 3 ngày liên tiếp. 5 ngày sau khi phẫu thuật, việc kiểm tra phết tế bào âm đạo của chuột được bắt đầu từng con một, mỗi ngày một lần trong 5 ngày liên tiếp. Những con chuột có phản ứng động dục trong vết bẩn sẽ bị loại bỏ. 72 con chuột bị thiến hoàn toàn được chọn và chia ngẫu nhiên thành 6 nhóm. Đối với mục đích thử nghiệm, chúng là nhóm mô hình, nhóm Gengnianan, nhóm isoflavone đậu nành và nhóm Cistanche Deserticola phenylanol glycoside liều lượng lớn, trung bình và nhỏ.

Phương pháp điều chế: Phương pháp điều chế: {{0}},5% CMC Phương pháp điều chế: Cân 4g natri carboxymethyl cellulose và trộn với nước cất để tạo thành 800ml. Liều lượng lớn, trung bình và nhỏ của nhóm Cistanche Deserticola phenylanol glycoside lần lượt là 133,33mg/kg, 66,67mg/kg và 33,33mg/kg (thể tích dùng 1ml/100g). Cách bào chế: Cân lần lượt 1333,3mg, 666,7mg và 333,3mg tổng flavonoid mâm xôi, hòa tan chúng với một lượng nhỏ 0,5% CMC, sau đó điều chỉnh thể tích thành 100ml, trộn đều, thế là xong. Viên nang Gengniangan (450mg/kg, pha với nước cất thành 45 mg/ml, 1ml/100g, tương đương 10 lần liều lâm sàng); Cách pha chế: Lấy 15 viên Gengniangan, hòa tan trước với một lượng nhỏ 0,5% CMC, sau đó điều chỉnh thể tích thành 100ml và trộn đều, đó là liều lượng Huyền phù viên nang Gengnianan (450mg/kg). Viên nang mềm Isoflavone Vitamin E đậu nành (166,67mg/kg, dùng nước cất pha 16,67mg/ml, 1ml/100g, tương đương 10 lần liều dùng trên lâm sàng); Cách bào chế: Lấy 4 viên nang mềm Isoflavone Vitamin E đậu nành, trước tiên Hòa tan với một lượng nhỏ 0,5% CMC, sau đó điều chỉnh thể tích thành 120ml, trộn đều để thu được liều lượng hỗn dịch viên nang mềm isoflavone vitamin E đậu nành (16,67mg/kg). ).

Phương pháp sử dụng: Động vật trong mỗi nhóm được cho dùng loại thuốc tương ứng vào ngày0thứ 1 sau phẫu thuật. Nhóm trống và nhóm mẫu được truyền với cùng một thể tích dung dịch CMC 0,5% (thể tích truyền là 1ml/100g), nhóm Gengnianan được truyền hỗn dịch viên nang Gengniaan (450 mg/kg, tương đương 10 lần liều lâm sàng). ). ), nhóm isoflavone đậu nành được dùng bằng đường uống hỗn dịch viên nang mềm isoflavone vitamin E đậu nành (166,67 mg/kg, tương đương 10 lần liều lâm sàng) và liều lớn, trung bình và nhỏ.Cistanche Deserticola phenyletanol glycosidecác nhóm được thực hiện bằng miệng theo nhóm. Liều lớn, trung bình và nhỏ của Cistanche Deserticola phenylanol glycoside (các liều lần lượt là 133,33mg/kg, 66,67mg/kg và 33,33mg/kg, thể tích liều lượng là 1ml/100g), dùng một lần mỗi ngày bằng cách tiêm vào dạ dày, liên tục . thuốc trong 30 ngày.

2.2 Hạng mục quan sát và phương pháp phát hiện

Điểm số chuyển động ngang-dọc của chuột trong mỗi nhóm được đo 29 ngày sau khi dùng thuốc. 2 giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng (nhịn ăn trong 15 giờ), tháo nhãn cầu để lấy máu, tách huyết thanh vàhuyết tương, và đo hàm lượng E2, T, LH, FSH, GnRH, BGP trong huyết thanh và hàm lượng -EP trong huyết tương; những con chuột đã được mổ xẻ. Loại bỏ tuyến ức, lá lách, tử cung và 20% mô buồng trứng còn lại, cân trọng lượng ướt của chúng và tính chỉ số cơ quan của tuyến ức, lá lách và tử cung (chỉ số cơ quan=trọng lượng ướt của cơ quan mg/trọng lượng chuột g) , sau đó loại bỏ não Đối với vùng dưới đồi và tuyến yên, các chất đồng nhất mô được điều chế từ vùng dưới đồi, tuyến yên và 1/2 tử cung, và hàm lượng các thụ thể estrogen ở vùng dưới đồi, tuyến yên và các chất đồng nhất mô tử cung và androgen Hàm lượng thụ thể trong các chất đồng nhất của mô vùng dưới đồi đã được xác định. Tuyến ức, lá lách, tử cung và buồng trứng được cố định trong dung dịch formaldehyde 10%, nhúng vào parafin, cắt lát và nhuộm bằng HE. Cácnhững thay đổi về mô họctrong mỗi nhóm được quan sát dưới kính hiển vi quang học.

2.2.1 Thử nghiệm phương pháp hiện trường mở

Dụng cụ thí nghiệm là một hộp hình lập phương mở có chiều cao 40cm, chiều dài và chiều rộng 80cm. Các bức tường xung quanh và phía dưới có màu đen. Phía dưới gồm có 25 khối có diện tích bằng nhau, được phân chia bằng các đường màu trắng. Trong quá trình thí nghiệm, con chuột được đặt vào ô vuông ở giữa hộp mở và điểm hoạt động theo chiều ngang của số khối mà con chuột vượt qua ở phía dưới trong vòng 5 phút (có thể đếm được những ô vuông có cả bốn bàn chân được nhập), và số lần chi sau đứng thẳng (hai bàn chân trước giơ lên ​​​​không trung). (hoặc bám vào tường) điểm hoạt động theo chiều dọc. Phân phải được loại bỏ hoàn toàn sau mỗi thí nghiệm và mỗi con chuột được đo 2 giờ một lần sau khi dùng. Thí nghiệm này được tiến hành trong một căn phòng yên tĩnh.

2.2.2 Phương pháp xác định bộ kit

Lấy mẫu huyết thanh: Sử dụng ống nghiệm không có chất gây sốt và nội độc tố. Tránh bất kỳ sự kích thích tế bào trong quá trình hoạt động. Sau khi lấy máu, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để tách huyết thanh và hồng cầu một cách nhanh chóng và cẩn thận. Lấy mẫu huyết tương: chống đông bằng ống chống đông heparin. Ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 30 phút và lấy phần nổi phía trên. Lấy mẫu mô đồng nhất: Thêm một lượng nước muối sinh lý thích hợp vào mô và nghiền nát. Ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút và lấy phần nổi phía trên.

Phương pháp xác định kit ELISA chuột (Rat) estradiol (E2) giống như Thí nghiệm 2. Nồng độ của chất chuẩn (S0-S5) là 0, 4, 8, 16, 32 và 64 giờ chiều/L.

Phương pháp xét nghiệm của Bộ ELISA chuột (Rat) Testosterone (T) giống như phương pháp xét nghiệm của Bộ ELISA Estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{0}}S5) là {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 và 320 pg /mL. Phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA hormone tạo hoàng thể (LH) chuột (Rat) giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S0-S5) là 0, 3, 6, 12, 24 và 48 ml/ml. Phương pháp xét nghiệm bộ ELISA hormone kích thích nang trứng (FSH) chuột (Rat) cũng giống như phương pháp xét nghiệm bộ ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{17}}S5) là 0, 0,75, 1,5, 3, 6 và 12 IU/L. Phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) chuột (Rat) cũng giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{28}}S5) là 0, 5, 10, 20, 40 và 80 mlU/ml.

Phương pháp xác định bộ phát hiện ELISA của chuột (Rat) Osteocalcin (BGP/OCN) giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{0}}S5) là 0, 0,75, 1,5, 3, 6 và 12 ng/ml. Phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA chuột (Rat) -endorphin ( -EP) giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S0-S5) là 0, 3, 6, 12, 24 và 48 pg/mL. Phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA thụ thể estrogen (ER) chuột (Rat) giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{{20}}S5) là 0, 4, 8, 16, 32 và 64 pg/mL. Phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA thụ thể androgen (AR) chuột (Rat) giống như phương pháp xác định của bộ phát hiện ELISA estradiol. Nồng độ của chất chuẩn (S{28}}S5) là 0, 25, 50, 100, 200 và 400 pg/mL.

2.3 Phương pháp xử lý thống kê

Để phân tích dữ liệu, gói thống kê y tế SPSS17.0 đã được sử dụng để xử lý dữ liệu thống kê. Dữ liệu đo được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (-x±s). Phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh giữa các nhóm. Phương pháp LSD được sử dụng để kiểm tra tính đồng nhất của phương sai. , bài kiểm tra Games-Howell được sử dụng cho các phương sai không đồng đều và bài kiểm tra Ridit được sử dụng cho dữ liệu điểm số.

Có thể thấy từ Bảng 11 và Hình 14 cho thấy so với nhóm trống, chỉ số tuyến ức, chỉ số lá lách và chỉ số tử cung của chuột trong nhóm mô hình đã giảm đáng kể (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Ảnh hưởng đến mức chỉ số sinh hóa máu ở chuột mô hình tiền mãn kinh

Hàm lượng E2, T, LH, FSH, GnRH và BGP huyết thanh cũng như hàm lượng -EP huyết tương của chuột trong mỗi nhóm được trình bày trong Bảng 12~13 và Hình 15~17.

Có thể thấy trong Bảng 12~13 và Hình 15~18 rằng so với nhóm trống, nồng độ E2 và T trong huyết thanh của chuột trong nhóm mô hình đã giảm đáng kể (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Bảng 14 Ảnh hưởng của Cistanche Deserticola phenylanol glycoside lên nồng độ GnRH huyết thanh và -EP huyết tương trong mô hình chuột tiền mãn kinh (-x±s)

Có thể thấy trong Bảng 14 và Hình 19-20 so với nhóm trống, nồng độ GnRH trong huyết thanh của chuột trong nhóm mô hình đã tăng lên đáng kể và mức -EP trong huyết tương giảm đáng kể (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Ảnh hưởng đến hàm lượng ER và AR trong mô của chuột mô hình tiền mãn kinh

Hàm lượng ER và AR trong các mô liên quan của chuột trong mỗi nhóm được thể hiện trong Bảng 16~17 và Hình 22~23.

Có thể thấy trong Bảng 17 và Hình 23 so với nhóm trống, mức AR ở vùng dưới đồi của nhóm mô hình thấp hơn đáng kể (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Ảnh hưởng đến hình thái mô cơ quan ở chuột mô hình tiền mãn kinh

Kết quả quan sát bệnh lý và mô học của tử cung, tuyến ức và lá lách của chuột ở mỗi nhóm thử nghiệm như sau. Các bức ảnh bệnh lý được trình bày trong Phụ lục 1 về các bức ảnh bệnh lý của chuột mô hình tiền mãn kinh.

5.1 Ảnh hưởng đến hình thái mô tử cung ở chuột mô hình tiền mãn kinh

Theo mức độ thay đổi khác nhau ở nội mạc tử cung, các tuyến và nội mạc tử cung của chuột trong mỗi nhóm thử nghiệm, các tiêu chuẩn bán định lượng được sử dụng để chia hình thái mô bệnh lý thành bốn cấp độ và tử cung của chuột trong mỗi nhóm thử nghiệm được xác định. đã đo. Kết quả quan sát được trình bày ở Bảng 18.

"-" Các tế bào biểu mô nội mạc tử cung, các tuyến, nội mạc tử cung và thanh mạc đều bình thường; "+" tế bào biểu mô nội mạc tử cung và các tuyến bị teo, nội mạc tử cung và thanh mạc bình thường; "++" biểu mô nội mạc tử cung Các tế bào và tuyến bị teo một phần, lớp cơ teo nhẹ, thanh mạc bình thường; Các tế bào và tuyến biểu mô nội mạc tử cung "+++" bị teo đáng kể và huyết thanh vẫn bình thường.

Sau thử nghiệm Ridit, có thể thấy từ Bảng 18 so với nhóm trống, tử cung của chuột trong nhóm mô hình cho thấy các tổn thương mô bệnh lý đáng kể (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Ảnh hưởng đến hình thái mô buồng trứng ở chuột mô hình tiền mãn kinh

Theo mức độ thay đổi khác nhau của nang trứng, hoàng thể, tế bào hạt và mạch máu trong buồng trứng của chuột trong mỗi nhóm thí nghiệm, tiêu chuẩn bán định lượng được sử dụng để chia hình thái mô bệnh lý thành bốn cấp độ. Buồng trứng của chuột trong mỗi nhóm thí nghiệm được đo và quan sát. Kết quả được thể hiện ở Bảng 19.

Bảng 19 Tác dụng của Cistanche Deserticola phenylanol glycoside đối với những thay đổi bệnh lý buồng trứng ở chuột mô hình tiền mãn kinh Đơn vị: chỉ

"-" có thể hiển thị các nang đang phát triển, nang trưởng thành và hoàng thể ở mọi cấp độ. Hoàng thể phát triển tốt, có nhiều lớp tế bào hạt, nhiều dịch nang và giàu mạch máu; "+" có thể hiển thị các nang đang phát triển, nang trưởng thành và thể vàng, nhưng số lượng nang trưởng thành và thể vàng ít. , các nang nhỏ hơn và các tế bào hạt ít phân lớp hơn; "++" có thể hiển thị các nang trưởng thành và thể vàng, với nhiều hoàng thể hơn, ít tế bào hạt hơn và ít mạch máu hơn; "+++" không có nang trứng, nhiều hoàng thể hơn và buồng trứng teo, vô mạch.

Sau thử nghiệm Ridit, có thể thấy từ Bảng 19 so với nhóm trống, buồng trứng của chuột trong nhóm mô hình cho thấy các tổn thương mô bệnh lý đáng kể (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Ảnh hưởng đến hình thái mô tuyến ức và lá lách ở chuột mô hình tiền mãn kinh

Dùng micromet đo độ dày phần dày nhất và hẹp nhất của vỏ tuyến ức của từng con chuột trong từng nhóm thí nghiệm để lấy giá trị trung bình; Dùng micromet vạch nền vào các nốt lách, đo độ dày các nốt lách hai bên lấy động mạch trung tâm làm trung tâm và tính giá trị trung bình. Kết quả đo được thể hiện ở Bảng 20 và Hình 24.

Có thể thấy trong Bảng 20 và Hình 24 rằng so với nhóm trống, độ dày của vỏ tuyến ức và thể tích các nốt lách trong nhóm mô hình đã giảm đáng kể (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).