Thí nghiệm 4 Tác dụng của Cistanche Deserticola Phenylanol Glycoside đối với chuột Hội chứng tiền mãn kinh ở chuột Vật liệu và phương pháp mô hình 1 Vật liệu thí nghiệm

1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột loại SPF, giống Côn Minh, con cái, 18~22g, do Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd. cung cấp, lô chuột này số chứng nhận: 0016003; số chứng chỉ phòng thí nghiệm SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Thuốc thử nghiệm

Cistanche phenyletanol glycosideđược điều chế theo phương pháp của Thí nghiệm 1, hàm lượng đạt 66,47%. Viên nang Gengnian'an, thành phần: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, vỏ hoa mẫu đơn, Poria cocos, xà cừ, curculigo, Schisandra chinensis, magnetite, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, lúa mì nổi, Polygonum multiflorum . Chức năng và chỉ dẫn:Nuôi dưỡng âm và khuất phục dương, giảm bớt rắc rốiVàlàm dịu tâm trí. Dùng cho người mãn kinh bốc hỏa, đổ mồ hôi, chóng mặt, ù tai, khó chịu và mất ngủ. Thông số kỹ thuật: 0,3g mỗi viên. Cách dùng và liều lượng: Uống, mỗi lần 3 viên, ngày 3 lần. Nhà sản xuất: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Số lô sản xuất: 121104. Số phê duyệt: Giấy phê duyệt thuốc quốc gia số Z14021848.

MẤT BAO LÂU ĐỂ CISTANCHE CÓ HOẠT ĐỘNG?

Isoflavone đậu nành và viên nang mềm vitamin E, danh sách thành phần: bột isoflavone đậu nành, vitamin E, dầu hướng dương, gelatin, glycerin, nước, tartrazine, titan dioxide. Thành phần và hàm lượng mang tính biểu tượng: Mỗi 100g chứa 55,2 mg isoflavone đậu nành (được tính bằng genistein) và 608,5 mg vitamin E. Chức năng sức khỏe: Tăng mật độ xương. Hướng dẫn sử dụng và liều lượng: Uống 1 viên ngày 2 lần với nước ấm. Quy cách: 500mg×100 viên. Nhà sản xuất: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Số lô sản xuất: 13070302. Số phê duyệt: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Thuốc thử thí nghiệm

Natri carboxymethyl cellulose, Công ty TNHH Sản xuất Thuốc thử Hóa chất Thiên Tân Hengxing, số lô: 20120418; penicillin natri pha tiêm, Công ty TNHH Dược phẩm Bắc Trung Quốc, quy cách: 4 triệu đơn vị, số lô sản xuất: c1206807; dung dịch formaldehyde (cấp phân tích), Công ty TNHH Hóa chất Shuangshuang Thành phố Yên Đài, số lô sản xuất: 20130902; Thuốc tiêm natri clorid 0,9%, Công ty TNHH Dược phẩm Chenxin; quy cách: 250ml, số lô sản xuất: 1301265303;

Chloral hydrat, Viện nghiên cứu hóa chất tốt Quảng Phúc Thiên Tân, số lô 20120827; bộ phát hiện ELISA chuột E2, Công ty R&D, số lô: 20140101A; bộ phát hiện ELISA chuột T, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Bộ phát hiện ELISA chuột LH, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Bộ phát hiện ELISA chuột FSH, Công ty R&D, số lô: 20140101A;

Bộ phát hiện ELISA chuột DA, Công ty R&D, số lô: 20140101A; Chuột 5-Bộ phát hiện HT ELISA, Công ty R&D, số lô: 20140101A. 1.4 Dụng cụ thí nghiệm

Cân điện tử, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., model: JY601; cân phân tích điện tử, Công ty Ohaus (Thượng Hải), model: AR1140/C; máy ly tâm để bàn tốc độ cao, Nhà máy dụng cụ khoa học Anting Thượng Hải, model: TGL-168 ; Bể điều nhiệt bằng điện, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., model: HWS12; Máy kiểm tra hoạt động tự động của chuột, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: ZZ-6; Máy đo tránh bóng tối của chuột, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. , model: BA-200; máy thử hệ thống treo đuôi, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: TS{7}}; máy ly tâm làm lạnh tốc độ cao, Chi nhánh Zhongjia của HKUST Innovation Co., Ltd., model: KDC-160HR; dụng cụ pipet có thể điều chỉnh, Công ty TNHH dụng cụ phân tích Leibo Thượng Hải;

Đầu đọc vi bản, Công ty BIO-RAD của Mỹ, model: 680;

Kính hiển vi điện tử, hãng OLYMPUS Nhật Bản, model: BX61.

2 phương pháp thí nghiệm

2.1 Mô hình hóa và quản lý thuốc

90 chuột Côn Minh cái có trọng lượng cơ thể 23-25g đã được chọn và 10 được chọn ngẫu nhiên làm nhóm trống và trải qua phẫu thuật giả, còn những con chuột còn lại được sử dụng để tạo mô hình tiền mãn kinh. Sau khi cân, chuột được gây mê bằng cách tiêm trong màng bụng 10% chloral hydrat (0,03ml/10g) và cố định vị trí bụng. Sau đó, lông được cắt từ phía sau lưng chuột, dưới xương sườn cuối cùng, tại điểm giao nhau của đường nách giữa và cách mặt ngoài cột sống khoảng 1cm rồi rạch sau khi khử trùng. Da và cơ lưng rộng khoảng 0,5-1cm. Có thể nhìn thấy một khối mỡ sáng bóng màu trắng đục ở vết mổ và buồng trứng nằm trong đó. Dùng nhíp nhỏ nhẹ nhàng nắm lấy khối mỡ rồi kéo ra khỏi vết mổ, tách khối mỡ ra, bạn sẽ thấy một nhóm buồng trứng mỏng, không đều, màu vàng đỏ. Khi cắt, trước tiên hãy thắt ống dẫn trứng (kể cả mỡ) dưới buồng trứng bằng những sợi chỉ mỏng, sau đó cắt bỏ buồng trứng. Sau khi phẫu thuật, sừng tử cung được đưa trở lại khoang bụng, các cơ và da được khâu lại, đồng thời cả hai buồng trứng cũng được cắt bỏ theo cách tương tự. Sau phẫu thuật, động vật được nuôi dưỡng cẩn thận và penicillin 200,000 u/kg (mỗi loại 0,1 mL) được tiêm bắp để ngăn ngừa nhiễm trùng trong 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày một lần. 5 ngày sau phẫu thuật, xét nghiệm phết tế bào âm đạo được thực hiện trên từng con chuột một, mỗi ngày một lần trong 5 ngày liên tiếp để xác định xem buồng trứng đã được cắt bỏ hoàn toàn hay chưa. Những con chuột biểu hiện phản ứng động dục trong phết tế bào đã bị loại bỏ và 60 con chuột bị thiến hoàn toàn được chia ngẫu nhiên và đồng đều thành 6 nhóm cho mục đích thử nghiệm, cụ thể là nhóm mô hình, nhóm Mennianan, nhóm isoflavone đậu nành, lớn, trung bình vàNhóm glycoside Cistanche phenyletanol liều thấp. Động vật trong mỗi nhóm được cho dùng thuốc tương ứng vào ngày thứ 10 sau phẫu thuật. Sau 6 ngày dùng thuốc, chuột trong nhóm trống được nuôi với mật độ 5 con/lồng, với thức ăn và nước uống bình thường, không có bất kỳ kích thích nào. Tất cả 6 nhóm mô hình đều được nuôi với mật độ 1 con chuột trong mỗi lồng và được cung cấp các kích thích khác nhau một cách ngẫu nhiên mỗi ngày. Bảy yếu tố stress được áp dụng ngẫu nhiên trong vòng 18 ngày: chất độn chuồng ẩm (1g chất độn chuồng/1ml nước); bơi trong nước đá (4 độ, 5 phút); ứng suất nhiệt (45 độ, 5 phút); chiếu sáng qua đêm (24h); kẹp đuôi (1 phút); thiếu nước (24 giờ); nhịn ăn (24h). Một kích thích được đưa ra ngẫu nhiên mỗi ngày và mỗi kích thích không thể xuất hiện liên tục trong 18 ngày.

Phương pháp điều chế: 0,5% CMC Phương pháp điều chế: Cân 4g natri carboxymethyl cellulose và trộn với nước cất thành 800ml.

Liều lượng lớn, trung bình và nhỏ của nhóm Cistanche phenylanol glycoside là 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg và 50mg/kg tương ứng (thể tích dùng 0,1ml/10g). Cách pha chế: Cân lần lượt 2000mg, 1000mg và 500mg Cistanche phenylethanoid glycoside, hòa tan chúng với một lượng nhỏ 0,5% CMC, sau đó điều chỉnh thể tích thành 100ml, trộn đều, thế là xong. Viên nang Gengniangan (675mg/kg, pha với nước cất thành 67,5 mg/ml, 0,1ml/10g, tương đương 15 lần liều dùng trên lâm sàng); Phương pháp chuẩn bị: lấy 9 viên Gengniangan, đầu tiên sử dụng một lượng nhỏ 0,5% CMC Dissolve, sau đó điều chỉnh thể tích thành 40ml và trộn đều để thu được liều Hỗn dịch viên nang Gengnianan (675mg/kg). Viên nang mềm Isoflavone Vitamin E đậu nành (250mg/kg, dùng nước cất pha 25mg/ml, 0,1ml/10g, tương đương 15 lần liều dùng trên lâm sàng); Cách bào chế: Lấy 2 viên nang mềm Isoflavone Vitamin E đậu nành, dùng trước. Hòa tan một lượng nhỏ 0,5% CMC, sau đó điều chỉnh thể tích thành 40ml, trộn đều để thu được liều lượng hỗn dịch viên nang mềm isoflavone vitamin E đậu nành (250mg/kg). ). Cách bảo quản: bảo quản lạnh, giữ ấm trong quá trình sử dụng.

Phương pháp sử dụng: Động vật trong mỗi nhóm được cho uống thuốc tương ứng vào ngày thứ 10 sau phẫu thuật. Nhóm Gengnian'an được dùng bằng đường uống hỗn dịch viên nang Gengnian'an 675 mg·kg-1, nhóm isoflavone đậu nành được dùng bằng đường uống 250 mg·kg-1 hỗn dịch viên nang mềm isoflavone vitamin E đậu nành và nhóm lớn, trung bình vàliều lượng nhỏ Cistanchephenyletanol. Nhóm glycoside được dùng qua đường uống với liều lượng lớn, trung bình và nhỏ Cistanche phenylanol glycoside 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1ml/10g tương ứng. Nhóm trống và nhóm mô hình được cho uống cùng một thể tích dung dịch CMC 0,5% mỗi ngày một lần trong 30 ngày liên tiếp.

2.2 Hạng mục quan sát và phương pháp phát hiện

Buộc phải bơi: Vào ngày đầu tiên sau khi kết thúc quá trình kích thích căng thẳng mãn tính, thời gian bất động của chuột trong mỗi nhóm trong vòng 6 phút được đo là 2-6 phút. (Cho chuột ở mỗi nhóm vào cốc thủy tinh 2000mL. Nhiệt độ nước là 25 độ. Ngoài chuyển động tối thiểu cần thiết để duy trì trạng thái nổi, các chi của chuột ngừng cử động và được ghi nhận là bất động. Ghi tổng thời gian bất động từ 2 đến 6 phút trong vòng 6 phút) Thử nghiệm hoạt động tự nguyện: Vào ngày thứ hai sau khi kết thúc quá trình kích thích căng thẳng mãn tính, số lượng hoạt động tự phát của chuột trong mỗi nhóm trong vòng 5 phút được đo.

Phương pháp tránh bóng tối: Vào ngày thứ 3 sau khi kết thúc quá trình kích thích căng thẳng mãn tính, hãy đặt đuôi chuột vào hộp đo đối diện với khe hở nhỏ vào phòng tối và tiến hành huấn luyện. Sau 24 giờ, đo lại độ trễ chuột vào phòng tối lần đầu và thời gian chuột vào phòng tối trong vòng 5 phút. Số lần bị điện giật.

Thử nghiệm treo đuôi: Vào ngày thứ 5 sau khi kết thúc quá trình kích thích căng thẳng mãn tính, thời gian bất động của chuột trong mỗi nhóm trong vòng 6 phút được đo là 2-6 phút.

2 giờ sau liều cuối cùng (12 giờ không ăn, không uống nước), cân chuột, lấy nhãn cầu, lấy máu, tách huyết thanh và xác định hàm lượng E2, T, LH, FSH trong huyết thanh. đo; những con chuột sau đó bị giết do trật đốt sống cổ và những con chuột bị mổ xẻ. , loại bỏ mô tuyến ức, lá lách và tử cung, cân trọng lượng ướt của chúng và tính chỉ số cơ quan (chỉ số cơ quan=trọng lượng ướt cơ quan mg/trọng lượng chuột g), sau đó lấy não, cắt một nửa và chuẩn bị não mô đồng nhất. Xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng để xác định hàm lượng chất dẫn truyền thần kinh monoamine 5-HT và DA trong chất đồng nhất của mô não. Tuyến ức, lá lách, tử cung và các mô não được cố định trong dung dịch formaldehyde 10%, nhúng vào parafin, cắt lát và nhuộm bằng HE. Những thay đổi về hình thái của từng nhóm được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng. 2.3 Phương pháp xác định bộ kit

Lấy mẫu huyết thanh: Sử dụng ống nghiệm không có chất gây sốt và nội độc tố. Tránh bất kỳ sự kích thích tế bào trong quá trình hoạt động. Sau khi lấy máu, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để tách huyết thanh và hồng cầu một cách nhanh chóng và cẩn thận. Lấy mẫu mô đồng nhất: Thêm một lượng nước muối sinh lý thích hợp vào mô và nghiền nát. Ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút và lấy phần nổi phía trên.

Phương pháp xác định bộ ELISA của chuột (Chuột) estradiol (E2) giống như Thí nghiệm 2. Nồng độ của sản phẩm chuẩn (S0-55) là: 0, 4, 8, 16, 32 , và 64 giờ chiều/L.

Phương pháp xác định bộ ELISA Testosterone (T) của chuột cũng giống như phương pháp xác định Estradiol (E2). Nồng độ của sản phẩm chuẩn (S{1}}) là: 0, 50, 100, 200, 400, 800pg/mL.

Phương pháp xác định bộ ELISA hormone kích thích nang trứng (FSH) của chuột cũng giống như phương pháp xác định estradiol (E2). Nồng độ của các sản phẩm tiêu chuẩn (S0-55) là: 0, 5, 10, 20, 40 và 8{{30} }mIU/mL. Phương pháp xác định bộ ELISA hormone tạo hoàng thể (LH) của chuột (Chuột) cũng giống như phương pháp xác định estradiol (E2). Nồng độ của chất chuẩn (S{10}}) là: 0, 0,5, 1, 2, 4 và 8mIU/mL. Phương pháp xác định bộ ELISA 5-hydroxytryptamine (5-HT) của chuột cũng giống như phương pháp xác định estradiol (E2). Nồng độ của sản phẩm chuẩn (S{21}}) là: 0, 15, 30, 60, 120, 240ng/ml. Phương pháp xác định bộ phát hiện ELISA của chuột (Chuột) dopamine (DA) cũng giống như phương pháp xác định estradiol (E2). Nồng độ của sản phẩm chuẩn (S{29}}) là: 0, 7,5, 15, 30, 60 và 120pg/ml.

Có thể thấy từ Bảng 21 và Hình 25 cho thấy so với nhóm trống, thời gian bất động của chuột ở nhóm mô hình tăng lên đáng kể trong các thí nghiệm bơi cưỡng bức và treo đuôi (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Ảnh hưởng đến hoạt động tự chủ ở chuột mô hình trầm cảm tiền mãn kinh

Kết quả thử nghiệm hoạt động tự chủ của chuột trong mỗi nhóm thử nghiệm được thể hiện trong Bảng 22 và Hình 26.

Có thể thấy từ Bảng 23 và Hình 27 và 28 cho thấy so với nhóm trống, thời gian tiềm ẩn của chuột trong nhóm mô hình giảm đáng kể và số lần bị điện giật tăng lên đáng kể (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Ảnh hưởng đến chỉ số cơ quan ở chuột mô hình trầm cảm tiền mãn kinh

Có thể thấy trong Bảng 24 và Hình 29 so với nhóm trống, chỉ số tuyến ức, chỉ số lách và chỉ số tử cung của nhóm mô hình giảm đáng kể (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche phenyletanol glycosidenhóm Chỉ số tuyến ức và chỉ số tử cung của chuột có thể tăng lên đáng kể (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).