Biểu hiện của Nitric Oxide Synthase và Renin thần kinh ở thận loạn sản của chó non

TRỪU TƯỢNG.

Renin vàtổng hợp oxit nitric tế bào thần kinhở thận kiểm soátRenin angiotensinVàhệ thống phản hồi ống cầu thận. Nghiên cứu hiện tại đã điều tra sự biểu hiện của renin và tế bào thần kinhtổng hợp oxit nitricbên trongthận loạn sảncủa ba con chó nhỏ. Hoạt động miễn dịch renini, xảy ra ở các tế bào cận cầu thận và hình ống của thận loạn sản, không khác biệt so với thận bình thường của chó nhỏ. Các tế bào có mật độ điểm vàng ở thận bình thường cho thấy khả năng miễn dịch tổng hợp oxit nitric của tế bào thần kinh, nhưng các tế bào ở thận loạn sản không có tín hiệu rõ ràng. Quan sát này có thể tương quan với cơ chế bệnh lý của bệnh suy thận ở chó nhỏ.

TỪ KHÓA: bệnh thận mãn tính, thận loạn sản, hóa mô miễn dịch, tổng hợp oxit nitric tế bào thần kinh, renin

Suy thậnđôi khi xảy ra ở chó nhỏ. Trong những trường hợp như vậy, kiểm tra mô học thường xuyên cho thấy tổn thương thận loạn sản. Tuy nhiên, cơ chế sinh lý bệnh xảy ra ở thận loạn sản ở chó vẫn chưa rõ ràng. Gần đây, chúng tôi đã chứng minh sự suy giảm của cyclooxygenase (COX)-2 trong bệnh thận mãn tính ở chó non mắc bệnh thận loạn sản bằng cách sử dụng phân tích hóa mô miễn dịch [19].

Hỗ trợ bổ sung CistancheBổ sung chức năng thận

COX-2 là một enzyme gây viêm cần thiết cho sự phát triển bình thường của thận ở giai đoạn bào thai và trẻ sơ sinh [12, 15]. Sau khi sinh, COX-2 được biểu hiện chủ yếu ở thận và tập trung ở vùng hạn chế của macula densa (MD) của các chi dày lên [1, 4, 22]. MD là một vùng chuyên biệt nằm cạnh cực mạch máu của cầu thận. Nó kiểm soát sự bài tiết renin và hệ thống phản hồi ống thận (TGF). COX-2 được biểu thị trong các tế bào MD điều chỉnh các cơ chế này [6, 8]. Ngoài COX{10}}, enzyme tổng hợp oxit nitric tế bào thần kinh (nNOS), cũng được biểu hiện trong các tế bào MD, được biết đến là chất điều chỉnh chính của hệ thống TGF [3, 18]. Hai phân tử này cùng biểu hiện trong MD, được biết là có tương tác với nhau [2, 5, 9]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã nghiên cứu sự biểu hiện của renin và nNOS ở thận loạn sản bằng phương pháp hóa mô miễn dịch để xác định xem liệu sự suy giảm COX{17}} ở thận loạn sản có gây ra sự gián đoạn hệ thống renin-angiotensin và hệ thống TGF ở chó non hay không

Các khối parafin cố định bằng formalin của thận loạn sản ở chó non (n=3), thận bình thường của chó nhỏ (n=3) và thận bình thường của chó trưởng thành (n=4) là giống như những nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó lịch sử lâm sàng và việc chuẩn bị mô đã được mô tả trước đây [19]. Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Thí nghiệm Động vật của Đại học Kagoshima, Nhật Bản (VM15020). Các phần được chuẩn bị với độ dày 3-µm và phân tích hóa mô miễn dịch đối với renin và nNOS được thực hiện theo các quy trình sau: (1) khử parafin; (2) thu hồi kháng nguyên bằng cách đun nóng vi sóng trong 10 mM dung dịch đệm citrate (pH 6,0) đối với nNOS; (3) ủ với 3% H2O2 trong 30 phút; (4) chặn bằng albumin huyết thanh bò 3% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) đối với renin hoặc 0,25% casein (Sigma-Aldrich) đối với nNOS, pha loãng trong dung dịch muối đệm photphat, trong 30 phút; (5) ủ qua đêm ở 4 độ với độ pha loãng 1:3,000 của kháng huyết thanh đa dòng renin kháng tái tổ hợp của thỏ (được cung cấp bởi Tiến sĩ Murakami, Đại học Tsukuba, Nhật Bản) hoặc 1:3,{{32 }} pha loãng huyết thanh kháng đa dòng kháng nNOS của thỏ (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), trong dung dịch ngăn chặn; (6) ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng với kháng thể phổ quát liên hợp peroxidase-polymer (globulin miễn dịch chống chuột (Ig) G và IgG chống thỏ; nhuộm đơn giản MAX-PO [MULTI]; Nichirei Bioscatics, Tokyo, Nhật Bản) ; và (7) phát hiện tín hiệu miễn dịch bằng hệ thống 3,3ʹ-diaminobenzidine (viên đệm 3,3ʹ-diaminobenzidine; Merck, Darmstadt, Đức). Đối với các phần kiểm soát âm tính, IgG bình thường của thỏ (Lab Vision, Fremont, CA, USA) đã được sử dụng thay cho kháng thể chính.

Hình 1. Hóa mô miễn dịch đối với renin ở thận chó bị loạn sản. A: Các tín hiệu dương tính với renin đã được quan sát thấy ở các tế bào cạnh cầu thận gần các cực mạch máu và một số tế bào cầu thận (mũi tên). Thanh: 50 µm. B: Một vùng khác của mặt cắt được hiển thị trong bảng A. Các ống trong đoạn nephron không xác định cho thấy khả năng miễn dịch renin. Thanh: 50 µm.

Phân tích hình thái ngẫu nhiên về khả năng miễn dịch renin được thực hiện theo phương pháp được mô tả trước đây [20]. Tóm lại, chỉ số renin được định nghĩa là tỷ lệ giữa tổng số tiểu động mạch dương tính với renin trên tổng số cầu thận và được biểu thị trên 100 cầu thận. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phương pháp so sánh đa biến của Bonferroni với SPSS phiên bản 24 (IBM SPSS Statistic, Armonk, NY, USA).

Chẩn đoán mô bệnh học được thực hiện theo tiêu chuẩn vi thể của bệnh loạn sản thận ở chó bởi Picut và Lewis [14]. Các phần mô học của cả ba trường hợp đều cho thấy sự biệt hóa không đồng bộ, cho thấy sự hiện diện của các tổn thương ở cầu thận của thai nhi/chưa trưởng thành. Những thay đổi thứ cấp có mức độ nghiêm trọng khác nhau như tổn thương ống thận, xơ hóa kẽ và xơ cứng cầu thận đã được quan sát thấy trong các mô thận trưởng thành.

Ở thận loạn sản, các tín hiệu phản ứng miễn dịch renin được quan sát thấy trong các tế bào cận cầu thận (JGC) (Hình 1A) và các tế bào hình ống nằm ở các nephron xa (Hình 1 B). Ở một số cầu thận, một số tế bào cho thấy tín hiệu dương tính với renin ở gần các cực mạch máu (Hình 1A). Ở thận đối chứng còn non, tín hiệu renin cũng được phát hiện ở cả JGC và ống lượn xa, bao gồm cả tế bào MD. Ở thận đối chứng của người trưởng thành, tín hiệu dương tính với renin bị hạn chế ở JGC. Theo thống kê, số lượng vùng dương tính với renin ở thận loạn sản cho thấy không có sự khác biệt đáng kể so với ở thận trẻ và người trưởng thành.

Sự kích thích sản xuất renin được biết là có vai trò trong việc truyền tín hiệu COX-2 và các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng hoạt động và nồng độ renin trong huyết tương đã giảm sau khi sử dụng chất ức chế COX-2 hoặc khi loại bỏ COX -2 gen [10, 11]. Khi thận loạn sản được kiểm tra trong nghiên cứu hiện tại cho thấy không có biểu hiện của COX ở thận-2 [19], việc giảm tín hiệu miễn dịch của renin trong JGC ban đầu bị nghi ngờ là một bất thường sinh lý có thể xảy ra ở thận loạn sản. Tuy nhiên, phân tích hóa mô miễn dịch hiện tại không thể xác nhận giả thuyết này và không có sự giảm renin rõ ràng nào được đề xuất trong JGC. Mặc dù vai trò sinh lý của renin ở ống thận chưa được làm rõ trước đây, việc xử lý natri ở thận có thể là một vai trò có thể có của renin ở ống thận, vì sự tăng cường biểu hiện renin được tạo ra ở ống thận xa sau khi cho chuột ăn chế độ ăn ít muối. [16], và thận loạn sản của những con chó được khảo sát trong nghiên cứu này có thể đã duy trì chức năng ống thận này.

COX-2 cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa hệ thống TGF, hệ thống này rất quan trọng để duy trì tốc độ lọc cầu thận. Một nghiên cứu trên chuột sử dụng phương pháp vi chọc đã chứng minh sự ức chế phản ứng TGF sau khi điều trị bằng chất ức chế COX-2 [2]. Phản ứng TGF ở thận loạn sản có thể bị suy giảm do thiếu biểu hiện COX-2 ở thận. Tuy nhiên, không có phát hiện liên quan nào được báo cáo trước đây. Ở thận, nNOS được biểu hiện trong các tế bào MD và giúp điều chỉnh hệ thống TGF [18].

Trong phân tích nNOS hiện tại, không phát hiện thấy tín hiệu rõ ràng nào ở vùng MD của tất cả các trường hợp (Hình 2). Sự giảm nNOS này được coi là một sự kiện gây bệnh ở thận loạn sản hơn là mắc phải sau các trường hợp suy thận. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi sử dụng chuột OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), làm mô hình của bệnh tiểu đường loại 2, đã chứng minh rằng nNOS đã được biểu hiện quá mức ở MD và các tế bào xung quanh ống thận trong giai đoạn sau của bệnh thận tiểu đường [21]. Trong quy định của hệ thống TGF, chức năng của nNOS tương tự và tương tác với chức năng của COX-2. Một số nghiên cứu cho rằng nNOS được đặt ở vị trí ngược dòng của đường truyền tín hiệu và kích thích sự biểu hiện của COX-2 [5, 9]. Mặt khác, các nghiên cứu khác lại đề xuất điều ngược lại rằng COX-2 được đặt ở vị trí thượng nguồn của NOS [2, 13]. Bất kể sự khác biệt trong đường truyền tín hiệu, việc thiếu tín hiệu miễn dịch nNOS trong tế bào MD có thể kích hoạt sự điều hòa giảm biểu hiện COX{12}} ở thận ở thận loạn sản.