Chiết xuất Phenylethanoid Glycoside từ Cistanche Tubulosa bằng chiết xuất đồng nhất hóa cắt tốc độ cao

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei và Ruili Guo

Tiểu sử:

Cistanche tubulosalà một loại thuốc cổ truyền nổi tiếng của Trung Quốc có nguồn gốc ở Tân Cương. Nó được phân bố rộng rãi ở bắc Phi, Ấn Độ, vv Mục tiêu: Thành phần hoạt tính sinh học chính củaC. tubulosalà glycoside phenylethanoid (PhGs). Echinacoside và acteoside là các thành phần chỉ định để xác định PhG và chủ yếu được sử dụng để bảo vệ gan, bảo vệ miễn dịch, vv Vì vậy, việc chiết xuất PhG từ C. tubulosa là rất quan trọng. Phương pháp: Trong nghiên cứu này, các phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE), chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) và chiết xuất đồng nhất hóa cắt tốc độ cao (HSHE) đã được so sánh. Hơn nữa, các điều kiện chiết xuất của phương pháp HSHE đã được tối ưu hóa. Kết quả: Kết quả cho thấy phương pháp HSHE tốt hơn cả phương pháp UAE và MAE, và các thông số chiết xuất tối ưu của HSHE là nồng độ etanol là 5 0 phần trăm, nhiệt độ chiết là 70 độ, tốc độ quay là 16000 vòng / phút, thời gian chiết 2 phút, tỷ lệ rắn-lỏng là 1: 9 và một chu kỳ chiết. Sản lượng của echinacoside và acteoside lần lượt là 1,366 và 0,519 phần trăm, và tỷ lệ chuyển echinacoside và acteoside lần lượt đạt 87 và 94 phần trăm. Kết luận: Có thể kết luận rằng phương pháp HSHE là một kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả để chiết xuất PhG từ C. tubulosa. Điểm nổi bật: Một phương pháp HSHE thân thiện với môi trường và hiệu quả đã được nghiên cứu để chiết xuất PhGs từ C. tubulosa. Các điều kiện tối ưu của phương pháp HSHE để chiết xuất PhG từ C. tubulosa đã thu được. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp mới để chiết xuất PhG trong công nghiệp từC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosalà một loại thuốc truyền thống phổ biến của Trung Quốc có nguồn gốc từ Tân Cương. Nó được phân bố rộng rãi ở phía bắc châu Phi, bán đảo Ả Rập, Pakistan, và Ấn Độ và được chính thức ghi trong Dược điển Trung Quốc vào năm 2010. Thành phần hoạt tính sinh học chính củaC. tubulosalà phenylethanoid glycoside (PhGs), một nhóm các sản phẩm tự nhiên hòa tan trong nước bao gồm echinacoside, acteoside, isoacteoside và 2- acetylacteoside (1, 2). Cấu trúc của PhG bao gồm axit cinnamic và gốc hydroxyphenylethyl, cả hai đều được gắn với a -glucopyranose thông qua liên kết este và glycosidic, tương ứng (3). Các nghiên cứu dược lý đã chỉ ra rằng PhG của C. tubulosa có nhiều chức năng y học, chẳng hạn như chống mệt mỏi (4), bảo vệ thần kinh (5–7), bảo vệ gan (8–10) và tác dụng bảo vệ miễn dịch (11). Do đó, việc chiết xuất hiệu quả PhGs từ C. tubulosa có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển và sử dụng các sản phẩm tự nhiên.

Các phương pháp chiết xuất PhG truyền thống hiện nay là chiết xuất hồi lưu nóng, chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE) và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE; 12–16). Các phương pháp này có những nhược điểm khác nhau, chẳng hạn như hiệu quả thấp, thời gian khai thác lâu và chi phí cao. So với các phương pháp truyền thống, phương pháp chiết xuất đồng nhất cắt tốc độ cao (HSHE) là một phương pháp chiết xuất mới, mới lạ và có ưu điểm là thời gian chiết xuất nhanh hơn, ít lãng phí dung môi hơn, năng suất cao hơn, thiết bị đơn giản hơn và vận hành dễ dàng hơn (17). Nguyên lý làm việc của phương pháp HSHE dựa trên một máy cắt quay bên trong được dẫn động bởi một động cơ tốc độ cao. Một lực cắt mạnh mẽ được tạo ra bởi máy cắt bên trong và bên ngoài để phá vỡ và trộn lẫn các mẫu. Trong khi đó, máy cắt với tốc độ quay cao gây ra chênh lệch áp suất giữa các khoang bên trong và bên ngoài của máy cắt, dẫn đến sự truyền khối lượng giữa các mẫu và dung môi. Với sự kết hợp của lực cắt lớn, lực va chạm, áp suất và các lực khác, có thể nhanh chóng đạt được sự cân bằng hòa tan giữa các mẫu rắn và dung môi (18). Do đó, quá trình trích xuất HSHE có thể hoàn thành trong vài phút, và thậm chí nhanh hàng chục giây (19–22).

Gần đây, HSHE đã được khám phá trong việc chiết xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ các sản phẩm tự nhiên khác nhau (23–25). Cheng và cộng sự. đã sử dụng HSHE để chiết xuất năm lignans từ quả của cây Schisandra Chinensis (26). Kết quả cho thấy rằng các điều kiện tối ưu là nồng độ etanol là 75 phần trăm, thời gian chiết là 1 phút, tỷ lệ rắn-lỏng là 1:19, điện áp chiết là 18 0 V và hạt mẫu kích thước 120 mắt lưới. Tổng sản lượng của năm lignans là 13,89 ± 0,014 mg / g trong các điều kiện tối ưu hóa. Tang và cộng sự. đã sử dụng HSHE để thu được dầu hoạt tính sinh học từ hạt tía tô (27). Các điều kiện tối ưu là thời gian chiết là 2 phút, tỷ lệ rắn-lỏng là 1:10, điện áp chiết là 150 V và hai chu kỳ chiết. Sản lượng dầu hạt tía tô đạt 59,3%. Kết quả trên cho thấy HSHE có ưu điểm là thời gian khai thác ngắn, chi phí thấp và năng suất cao. Tuy nhiên, còn thiếu nghiên cứu về việc chiết xuất PhG của HSHE.

Trong nghiên cứu này, HSHE đã được sử dụng để khám phá ứng dụng tiềm năng của nó trong việc chiết xuất PhGs từC. tubulosa. Sản lượng của PhGs được xác định bởi HPLC. Ba phương pháp chiết xuất, HSHE, UAE và MAE, được so sánh trong cùng điều kiện. Ảnh hưởng của nồng độ etanol, nhiệt độ chiết, tốc độ quay, thời gian chiết, tỷ lệ rắn-lỏng, và số chu kỳ chiết đến năng suất đã được nghiên cứu. Những thuận lợi và khó khăn của công việc này và các tài liệu tham khảo được so sánh và thảo luận.

Nguyên liệu và phương pháp

Vật liệu và Thuốc thử Hóa học

C. tubulosađược mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Congrongtang Tân Cương (Tân Cương, Trung Quốc). Các tiêu chuẩn của echinacoside (độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 98%) và acteoside (độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 98%) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học tiêu chuẩn Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc). Acetonitril, metanol và axit axetic thuộc loại HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Ethanol cấp phân tích được mua từ Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Thiên Tân, Trung Quốc). Nước khử ion đã được sử dụng trong suốt các thí nghiệm.

Phân tích HPLC

Một phân tích HPLC được thực hiện trên máy sắc ký lỏng Waters e2695 (Waters, Milford, MA) được trang bị Máy dò UV / Visible 2489 và cột Đối xứng C18 (Waters), kích thước hạt 250 × 4,6 mm, 5 μm. Nồng độ của echinacoside và acteoside được phân tích bằng phương pháp HPLC. Pha động bao gồm (1) axetonitril và (2) dung dịch nước axit axetic băng 2%. Chương trình rửa giải gradient được trình bày trong Bảng 1.

Bước sóng phát hiện là 330 nm, tốc độ dòng chảy là 1 mL / phút, thể tích tiêm là 10 μL và nhiệt độ lò được đặt ở 30 độ. Đỉnh sắc ký của chất phân tích được xác nhận bằng cách so sánh thời gian lưu của chất này với thời gian lưu của chất chuẩn. Việc định lượng được thực hiện bằng cách tích phân pic bằng phương pháp chuẩn bên ngoài.

Phép thử độ chụm được thực hiện bằng cách bơm các mẫu chiết giống nhau năm lần. Đối với thử nghiệm độ ổn định, các mẫu tương tự được phân tích theo từng bước 0, 1, 2, 4, 12, 24 và 48 giờ. Các phép thử thu hồi echinacoside và acteoside được thực hiện bằng cách thêm các chất chuẩn vào các mẫu chiết. Tất cả các diện tích đỉnh và thời gian lưu của echinacoside và acteoside đã được ghi lại. Kết quả của đường chuẩn cho echinacoside và acteoside được liệt kê trong Bảng 2.

Tính toán lợi nhuận

Echinacoside và acteoside được sử dụng làm thành phần chỉ định để xác định PhG. Sản lượng của echinacoside hoặc acteoside được tính theo công thức sau:

Y=CV / W × 100 phần trăm (1)

trong đó Y=sản lượng echinacoside hoặc acteoside (phần trăm); C=ẩn chứa echinacoside hoặc acteoside (mg / mL); V=thể tích của dung dịch chiết (mL); và W=trọng lượng của bột C. tubulosa (mg).

Phương pháp chiết xuất PhGs

Đầu tiên, thân của C. tubulosa được xay bằng máy xay điện (JC -500 g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Trung Quốc) và lọc bằng rây lọc (khoảng 380 μm). Sau đó, bột C. tubulosa được làm khô trong lò ở nhiệt độ 70 độ cho đến khi trọng lượng không đổi. Năm gam C. tubulosa bột được trộn với dung môi chiết xuất và đặt trong một chai chiết. Sau đó, hỗn hợp lỏng được làm nóng trước (30–80 độ) trong 5 phút trong nồi cách thủy nhiệt độ không đổi (DF -101 S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Trung Quốc).

(a) Phương pháp HSHE. — HSHE được thực hiện bởi một hệ thống FA25 (FLUKO Co., Ltd, Thượng Hải, Trung Quốc), bao gồm máy cắt quay, động cơ tốc độ cao và bộ điều khiển. Tốc độ quay của dao cắt bên trong được điều chỉnh trong khoảng 10000–28000 vòng / phút và thời gian chiết được điều chỉnh trong khoảng 2–15 phút.

(b) Phương pháp UAE. — Năm gam mẫu khô và 300 mL metanol được cân chính xác và cho vào bình chiết. Chai chiết được ngâm vào bể siêu âm và thực hiện ở công suất siêu âm 300 W trong 10 phút. Nhiệt độ chiết được đặt ở 30 độ.

(c) Phương pháp MAE. — Năm gam mẫu khô và 300 mL metanol được cân chính xác và cho vào bình chiết. Chai chiết được đưa vào lò phản ứng vi sóng và thực hiện ở 180 W trong 10 phút. Nhiệt độ chiết được đặt ở 30 độ.

Phương pháp HSHE được so sánh với các phương pháp của UAE và MAE với cùng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ chiết, tỷ lệ rắn-lỏng và số chu kỳ chiết. Dung dịch chiết được lọc bằng màng 0. 22 μm và phân tích qua HPLC để xác định nồng độ của echinacoside và acteoside. Tất cả các quá trình chiết xuất được lặp lại ba lần

Xác định tỷ giá chuyển nhượng

Dựa trên phương pháp tiêu chuẩn trong 2 {10}} 15 Dược điển Trung Quốc, hàm lượng echinacoside và acteoside trong bột C. tubulosa được xác định (28). Một gam C. tubulosa bột và 50 mL metanol 50% được cân chính xác và cho vào bình định mức màu nâu 50 mL. Hỗn hợp lỏng được cân và ngâm trong 30 phút. Sau đó, bình định mức màu nâu được ngâm trong bể siêu âm và thực hiện ở công suất siêu âm 250 W và tần số 35 kHz trong 40 phút. Hỗn hợp chất lỏng được cân lại, và 50% metanol được thêm vào để cung cấp cho sự thất thoát dung môi. Dung dịch chiết được lọc bằng màng 0,22 μm và được phân tích bằng HPLC để xác định nồng độ của echinacoside và acteoside. Các quá trình chiết xuất được lặp lại ba lần.

Tốc độ truyền của echinacoside hoặc acteoside được tính theo công thức sau:

X=M1 / ​​M2 × 100 phần trăm (2)

trong đó X=tốc độ truyền echinacoside hoặc acteoside (phần trăm); M 1=chất lượng của echinacoside hoặc acteoside trong dịch chiết (mg); và M 2=chất lượng của echinacoside hoặc acteoside trong bột C. tubulosa (mg).

Kết quả và thảo luận

Xác thực Phương pháp HPLC

Cấu hình HPLC của echinacoside và acteoside từ C. tubulosa sử dụng HSHE được thể hiện trong Hình 1. RSD của vùng đỉnh của echinacoside và acteoside lần lượt là 1,89 và 1,4 0 phần trăm. Kết quả cho thấy phương pháp HPLC có độ chính xác tốt trong phân tích định lượng echinacoside và acteoside. Tại các thời điểm khác nhau (0 - 48 giờ), RSD của các vùng đỉnh của echinacoside và acteoside lần lượt là 1,71 và 1,7 0 phần trăm, cho thấy rằng mẫu ổn định trong 48 giờ. Độ thu hồi của echinacoside và acteoside lần lượt là 99,3 và 99,1%, và RSD của chúng tương ứng là 0,70 và 0,67%, điều này khẳng định độ tin cậy của phương pháp HPLC.

So sánh các phương pháp chiết xuất khác nhau

So sánh giữa phương pháp HSHE với các phương pháp MAE và UAE về sản lượng echinacoside và acteoside đã được tiến hành, kết quả được thể hiện trong Hình 2. Người ta quan sát thấy rằng sản lượng echinacoside và acteoside do HSHE thu được cao hơn so với sản lượng thu được của cả MAE và UAE. So với MAE, sản lượng echinacoside và acteoside mà HSHE thu được lần lượt cao hơn 20,5 và 20,8%. Và so với UAE, sản lượng echinacoside và acteoside do HSHE thu được lần lượt cao hơn 6,6 và 7,4%. Những kết quả này chỉ ra rằng HSHE có thể làm tăng đáng kể sản lượng của PhGs.

Tối ưu hóa Phương pháp HSHE

Các thông số chiết xuất của PhGs bằng HSHE bao gồm nồng độ etanol, nhiệt độ chiết, tốc độ quay, thời gian chiết, tỷ lệ rắn-lỏng và số chu kỳ chiết (26, 29).

Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến việc chiết xuất PhGs

Nồng độ ethanol là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sản lượng của PhGs. Như thể hiện trong Hình 3, sản lượng echinacoside và acteoside từ C. tubulosa ở các nồng độ ethanol khác nhau đã được khảo sát. Nó tiết lộ rằng sản lượng echinacoside tăng từ 0 lên 3 0 phần trăm và sau đó giảm từ 30 đến 90 phần trăm khi tăng nồng độ ethanol. Sản lượng của acteoside tăng từ 0 đến 70 phần trăm và sau đó giảm từ 70 phần trăm đến 90 phần trăm khi tăng nồng độ ethanol. Khi nồng độ etanol là 50 phần trăm, tổng sản lượng echinacoside và acteoside là tối đa. Các nồng độ ethanol khác nhau có độ phân cực khác nhau, dẫn đến khả năng hòa tan của echinacoside và acteoside khác nhau. Do đó, nồng độ etanol tối ưu là 50%.

Ảnh hưởng của tốc độ quay đến việc chiết xuất PhGs

Hình 5 cho thấy ảnh hưởng của các tốc độ quay khác nhau đến sản lượng của PhG. Sản lượng của echinacoside và acteoside tăng lên khi tốc độ quay tăng. Việc tăng tốc độ quay có thể làm tăng lực cắt của dao cắt bên trong và bên ngoài, do đó làm tăng năng suất của PhGs. Tốc độ quay tối ưu là 16000 vòng / phút.

Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất đến việc chiết xuất PhGs

Sản lượng của echinacoside và acteoside trong các thời gian chiết khác nhau được thể hiện trong Hình 6. Sản lượng của echinacoside và acteoside ổn định khi tăng thời gian chiết. Do đó, có thể kết luận rằng PhGs có thể được chiết xuất hoàn toàn từ C. tubulosa trong 2 phút, và thời gian chiết xuất tối ưu là 2 phút.

Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn-lỏng đến việc chiết xuất PhGs

Như thể hiện trong Hình 7, sản lượng của echinacoside và acteoside theo các tỷ lệ rắn-lỏng khác nhau đã được thảo luận. Sản lượng echinacoside và acteoside tăng từ 1: 3 lên 1: 9 và ổn định từ 1: 9 đến 1:24. Vì một lượng nhỏ dung môi chiết không thể hòa tan hoàn toàn echinacoside và acteoside, nên tốc độ truyền khối đã giảm. Việc chiết xuất quá nhiều dung môi gây lãng phí không cần thiết. Do đó, tỷ lệ chất rắn trên chất lỏng tối ưu là 1: 9.

Ảnh hưởng của số chu kỳ chiết xuất đến việc chiết xuất PhGs

Hình 8 cho thấy ảnh hưởng của một số chu kỳ chiết xuất đến năng suất của PhGs. Sản lượng của echinacoside và acteoside tăng lên khi số chu kỳ chiết xuất ngày càng tăng. Tuy nhiên, thời gian chiết xuất tăng lên đáng kể khi chu kỳ chiết xuất ngày càng tăng, và tiêu thụ nhiều năng lượng hơn. Số chu kỳ chiết xuất tối ưu là một.

So sánh phương pháp HSHE với các phương pháp chiết xuất khác để chiết xuất PhG

Kết quả của phương pháp HSHE so với các phương pháp chiết xuất khác để chiết xuất PhG từ C. tubulosa được liệt kê trong Bảng 3. HSHE đơn giản và dễ dàng hơn so với các phương pháp ghép nối như công nghệ chiết hai pha dung dịch nước có hỗ trợ siêu âm và công nghệ chiết vi sóng siêu âm. các phương pháp. Ngoài ra, áp suất chiết của HSHE thấp hơn so với phương pháp chiết lỏng có áp suất và các điều kiện hoạt động của phương pháp trước đây an toàn hơn. Quan trọng hơn, có thể thấy từ Bảng 3, HSHE cho thấy thời gian chiết ngắn nhất và tiêu thụ dung môi ít nhất trong số tất cả các phương pháp chiết. Có thể kết luận rằng phương pháp HSHE có nhiều ưu điểm như hiệu quả cao, điều kiện vận hành nhẹ, mức tiêu hao thấp, thiết bị đơn giản, vận hành dễ dàng để chiết xuất các sản phẩm tự nhiên.

Kết luận

Trong nghiên cứu này, một phương pháp HSHE hiệu quả và thân thiện với môi trường đã được nghiên cứu để chiết xuất PhGs từ C. tubulosa. So với các phương pháp của UAE và MAE, phương pháp HSHE mới tạo ra năng suất PhG cao hơn trong cùng điều kiện. So với phương pháp MAE, sản lượng của echinacoside và acteoside đã tăng lần lượt là 2 0. 5 và 20,8 phần trăm. Và so với UAE, sản lượng echinacoside và acteoside đã tăng lần lượt là 6,6 và 7,4%. Các thông số chiết xuất HSHE của PhGs từ C. tubulosa đã được tối ưu hóa. Theo các thông số được tối ưu hóa, sản lượng của echinacoside và acteoside lần lượt đạt 1,366 và 0,519 phần trăm, và tốc độ truyền của echinacoside và acteoside lần lượt đạt 87 và 94 phần trăm. Phương pháp HSHE có ưu điểm là hiệu quả cao, điều kiện vận hành nhẹ nhàng, mức tiêu hao thấp, thiết bị đơn giản, dễ vận hành và chi phí thấp. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp mới để chiết xuất PhGs từ C. tubulosa trong công nghiệp.