Fisetin làm giảm phản ứng viêm do Lipopolysaccharide gây ra ở đại thực bào

Để biết thêm thông tin, liên lạctina.xiang@wecistanche.com

Một số nghiên cứu đã báo cáo về hiệu quả và độ an toàn của polyphenol đối với sức khỏe con người; tuy nhiên, việc xác minh hiệu quả của chúng vẫn chưa đủ. Mục đích của nghiên cứu này là để kiểm tra xem liệu fisetin, một trong những flavonoid hiện diện phổ biến trong trái cây và rau quả, có thể ngăn chặn lipopolysaccharide- (LPS-) gây ra hay khôngviêmphản ứng trong đại thực bào. LPS làm tăng sự phong phú mRNA tiền viêm （MCP 1, IL -1 ß, và iNOS） nhưng bị ngăn chặn bởi fisetin. Sự gia tăng oxit nitric bởi LPS, một yếu tố gây stress oxy hóa, đã bị làm suy yếu bởi fisetin. Ngoài ra, sự phosphoryl hóa tăng cường LPS của protein kinase hoạt hóa mitogen (ERK và JNK) đã giảm. Cuối cùng, fisetin làm giảm biểu hiện hoặc hoạt động của uPA, uP AR, MMP -2 và MMP -9, được gọi là các yếu tố liên quan của việc tuyển dụng hoặc thâm nhập đại thực bào. Tóm lại là,fisetinlà một chất điều trị đầy hứa hẹn cho các bệnh viêm liên quan đến đại thực bào, như nhiễm trùng huyết và xơ vữa động mạch.

Nhấn vào đây để tìm hiểu thêm thông tin.

1. Giới thiệu

Việc sử dụng trị liệu của các thành phần tự nhiên đã được chú ý nhiều hơn trong 2 thập kỷ qua. Dựa trên hiệu quả tuyệt vời và độc tính thấp, 40% tác nhân điều trị được FDA chấp thuận là các thành phần có nguồn gốc tự nhiên hoặc các dẫn xuất của chúng [1]. Độc tính liên quan đến các loại thuốc khác đã được ngăn chặn thành công bằng các sản phẩm tự nhiên khác nhau [2]. Do đó, việc khám phá thêm các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật là rất quan trọng và có ý nghĩa.

Polyphenollà các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật và có mặt rộng rãi trong thực phẩm và đồ uống có nguồn gốc thực vật, trái cây, rau, gia vị, trà và rượu. Mặc dù chúng không được coi là vi chất dinh dưỡng thiết yếu, nhưng một số loại tài liệu đã chứng minh tác dụng có lợi của chúng đối với sức khỏe con người, đặc biệt là trong chế độ ăn uống liên quan đến tiêu thụ nhiều trái cây và rau quả [3-5]. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trong nhiều thập kỷ để điều tra tác dụng dược lý của polyphenol, cho thấy những lợi ích đối với sức khỏe. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy một số polyphenol sở hữuchống viêmđặc tính

[6-8]. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng một số loại polyphenol có thể ức chế các enzym điều hòa hoặc các yếu tố phiên mã có liên quan đến chứng viêm [9].

Chế độ ăn uống ảnh hưởng đến các giai đoạn viêm khác nhau và thể hiện tác động quan trọng đến một số bệnh viêm [10,11]. Viêm đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các bệnh như tiểu đường, hen suyễn, các bệnh tim mạch và ung thư [12]. Do đó, kiểm soát tình trạng viêm có thể ngăn ngừa các bệnh này. Vì các đại thực bào là chất trung gian chính của quá trình viêm, chúng có các chức năng đa dạng trong việc cân bằng nội môi và viêm ở mô. Do đó, các tác nhân điều chỉnh hiệu quả các chức năng của chúng có giá trị lâm sàng rất lớn vì sự hoạt hóa không bình thường của các đại thực bào có thể gây ra các phản ứng miễn dịch bất lợi. Xu hướng nghiên cứu hiện nay chỉ ra rõ ràng rằng các sản phẩm tự nhiên là một trong những nguồn quan trọng nhất của các loại thuốc mới [13].

Một polyphenol, isetin (3,3 ', 4', 7- tetrahydroxyflavone), có nhiều trong dâu tây, táo, cà chua, hành tây, cam, đào, nho, kiwi, hồng, trà và rượu vang [14] . Cho đến nay, fisetin đã báo cáo khả năng chống viêm mạnh [15-17],

chống oxy hóa [18], chống ung thư [19,20, kháng ung thư [21], chống đái tháo đường [22], bảo vệ thần kinh [23], và tác dụng bảo vệ tim mạch [24] cả trong nuôi cấy tế bào và trên các mô hình động vật có liên quan đến các bệnh ở người. Mặc dù fisetin có nhiều tác dụng sinh lý, nhưng tác dụng của nó đối với đại thực bào không được báo cáo nhiều.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng có lợi của fisetin đối với phản ứng viêm của các đại thực bào được kích hoạt bởilipopolysaccharide(LPS).

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Phân lập các đại thực bào phúc mạc thường trú.

Chuột BALB / c được lấy từ Viện Khoa học Y tế của Đại học Tokyo và được duy trì tại Trung tâm Nguồn lực Động vật của Đại học Okayama. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được thực hiện để tuân theo các hướng dẫn của NIH (Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm). Quy trình thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đánh giá Đạo đức cho Thử nghiệm Động vật của Trường Cao học Y khoa, Nha khoa và Dược phẩm Đại học Okayama (OKU -2018449). Tất cả những con chuột được duy trì trong một cơ sở rào cản và cho ăn một chế độ ăn bình thường trong phòng thí nghiệm. Chuột BALB / c đực và cái, 16 ± 4 tuần tuổi được gây mê bằng isoflurane và cho tử vong bằng cách thắt cổ tử cung. Các đại thực bào được thu hoạch thông qua rửa phúc mạc bằng nước muối (5mL). Dung dịch rửa phúc mạc được ly tâm ở tốc độ 1500 vòng / phút trong 5 phút. Trầm tích được lơ lửng trong một DMEM nhỏ (SIGMA, Cat. No.D6046). Các tế bào hồng cầu được ly giải bằng cách sử dụng dung dịch amoni clorua. Số lượng đại thực bào được tính bằng máy đo huyết cầu, sau đó được tiếp tục lại trong DMEM có chứa FBS bất hoạt nhiệt (10 phần trăm vv), penicillin (10 U / mL) và streptomycin (10mg / mL), và được mạ vào 6- giếng tấm (Corning Incorporated, Cat. No.3516) [25,26].

2.2. Điều kiện nuôi cấy tế bào.

Sau khi bỏ đói huyết thanh qua đêm, các đại thực bào được ủ với các nồng độ fisetin （10, 30 và 100 μM đã chọn; SIGMA, Cat. F4043) hoặc phương tiện trong 3 giờ và được ủ trong điều kiện có hoặc không có LPS (10ng / mL; SIGMA, Cat. No.L4391) trong một thời gian thích hợp. Sau đó, môi trường và tế bào được thu thập. Môi trường được sử dụng cho xét nghiệm oxit nitric (NO) và phương pháp chụp cắt lớp gelatin. Ly giải tế bào được sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase định lượng (qPCR) và thấm phương tây.

2.3. Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực.

mRNA được chiết xuất từ ​​đại thực bào bằng cách sử dụng RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. No.74104). Phiên mã ngược được thực hiện bằng Bộ công cụ tổng hợp cDNA iScript (Bio-Rad, Cat. Số 1708891). qPCR được thực hiện với Hệ thống PCR thời gian thực ABI Bước một (Hệ thống sinh học ứng dụng, QuantStudio 3) sử dụng Bộ kết hợp PCR thời gian thực màu xanh lá cây nhanh SYBR (Hệ thống sinh học ứng dụng, Cat. No.4385612) [27). Mồi cho protein hóa học monocyte 1 (MCP -1) (Takara Bio Inc, Cat. No. MA066003), interleukin 1 beta (IL -1) (Takara Bio Inc., Cat. No. MA025939), tổng hợp oxit nitric cảm ứng (iNOS) (Takara Bio Inc, Cat. No. MA083369), matrix metalloproteinase- (MMP-) 2 (Takara Bio Inc., Cat. No. MA127110), MMP -9 (Takara Bio Inc ., Cat. No.MA031311), và RNA ribosome 18S (18S) (Takara Bio Inc., Cat. No. MA050364) đã được bán trên thị trường. Mỗi mẫu được chuẩn hóa thành các giá trị biểu hiện mRNA 18S (phương pháp AACT) [27].

2.4. Thử nghiệm oxit nitric.

Các chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào riêng lẻ được thu thập và ly tâm 10 phút ở tốc độ 14, 000 vòng / phút ở 4 độ. Sau đó, phần nổi phía trên được sử dụng cho xét nghiệm oxit nitric (NO). Xét nghiệm NO được thực hiện như được mô tả trong các bộ dụng cụ bán sẵn trên thị trường (Hệ thống BioAssay, Cat. Số D2NO -100). BioAssay Systems'QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit là một xét nghiệm so màu để xác định sản sinh NO sau khi khử nitrat thành nitrit bằng phương pháp Griess cải tiến.

2.5. Western Blotting.

Protein toàn bộ tế bào được chiết xuất từ ​​đại thực bào bằng cách sử dụng đệm ly giải (Tín hiệu tế bào, Cat. No.9803). Mỗi mẫu được áp dụng vào 10 phần trăm SDS-PAGE và được chuyển sang màng polyvinylidene fluoride, được gắn miễn dịch với các kháng thể chính (sự phosphoryl hóa kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (p-ERK); Tín hiệu tế bào, Cat. 9101, phosphoryl hóa của c-Jun N-terminal kinase (p-JINK); Tín hiệu tế bào, Cat. 9251, chất kích hoạt plasminogen urokinase (uPA); Abcam, Cat. No.

ab20789, chất hoạt hóa plasminogen urokinase và thụ thể (uPAR); R&D, Cat.No.AF534 và -actin; Mèo Sigma. Số A5441) [28]. Các màng sau đó được ủ với các kháng thể thứ cấp thích hợp, và các phức hợp miễn dịch được hình dung trên hiện tượng hóa phát quang (Merck Millipore, Cat. No. WBLUF0100, Cat.no. WBLUC0100) và được định lượng bằng Máy chụp ảnh điện tổng quát (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Gelatin Zymography.

Các chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào được phân giải trong các điều kiện không giảm tế bào bởi SDS-PAGE (1 0 phần trăm wt / thể tích) được polyme hóa với sự có mặt của gelatin (0. 1 phần trăm wt / wt) để đánh giá các hoạt động của MMP { {4}}. Gel được rửa bằng Triton X -100 (2,5 phần trăm thể tích / vo) trong 60 phút và nước cất trong 15 phút hai lần. Sau đó, gel được ủ qua đêm ở 37 độ Cin 50mM đệm Tris có chứa canxi clorua (5mM) pH8.0. Sau khi ủ, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R -250 (Bio-Rad, Cat. No. { {18}}) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó khử bằng dung dịch hủy diệt Coomassie Brilliant Blue R -250 (Bio-Rad, Cat. No. 161-0438) cho đến khi xuất hiện các dải trong. Hình ảnh gel được định lượng bằng Máy chụp ảnh điện chung (GE Healthcare, LAS 4000 mini); các khu vực tiêu hóa trong mờ, không nhuộm màu đại diện cho các khu vực hoạt động của MMP [30].

2.7. Số liệu thống kê.

Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng Sigma Plot v14. 0 (Systat Software Inc, California, Hoa Kỳ). Dữ liệu được trình bày dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình. Ý nghĩa thống kê giữa nhiều nhóm được đánh giá bằng phân tích phương sai một chiều hoặc hai chiều, sau đó là bài kiểm tra sau bài học Holm-Sidak hoặc bài kiểm tra bài học sinh viên Newman-Keuls. pvalue<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Kết quả

3.1. Fisetin làm giảm độc lực trung gian gây viêm trong đại thực bào được kích thích bằng LPS.

Vì các đại thực bào được kích hoạt tạo ra các cytokine tiền viêm và các chất trung gian gây viêm như NO [8], chúng tôi đã kiểm tra tác động của fisetin đối với các chất trung gian gây viêm trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS. Đầu tiên, để nghiên cứu xem liệu fisetin có tác dụng chống viêm ở cấp độ phiên mã hay không, chúng tôi xác định mức độ biểu hiện mRNA A của các gen gây viêm như MCP -1, IL -1 và iNOS (Hình 1 (a) ). Đúng như dự đoán, các biểu hiện của các gen gây viêm này đã bị ngăn chặn bởi fisetin theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tiếp theo, để xác nhận liệu fisetin có ngăn chặn phản ứng viêm ở đại thực bào hay không, chúng tôi đã đánh giá khả năng của nó trong việc ngăn chặn sản xuất NO ở các đại thực bào được điều trị bằng LPS (Hình 1 (b)). Như mong đợi, fisetin làm giảm sản xuất NO một cách phụ thuộc vào liều lượng.

3.2. Fisetin làm giảm Kinase của protein kích hoạt Mitogen trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS.

Vì fisetin được báo cáo là ức chế con đường kích hoạt protein kinase (MAPK) của mitogen trong các loại tế bào khác nhau [31, 32], chúng tôi đã kiểm tra tác động của fisetin đối với MAPK trong đại thực bào. Đầu tiên, sự kích hoạt MAPK do LPS gây ra trong các đại thực bào được quan sát (Hình 2 (a)). Sự gia tăng p-ERK của LPS đạt đỉnh vào 15 phút sau khi kích thích, trong khi sự gia tăng của p-JNK bởi LPS đạt đỉnh sau 30 phút. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo, các đại thực bào được kích thích bằng LPS trong 30 phút. Điều trị chung với fisetin làm giảm đáng kể sự tăng cường do LPS gây ra của p-ERK và p-JNK (Hình 2 (b) và 2 (c)).

3.3. Fisetin Giảm uPA và uPAR trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS.

Sự hoạt hóa của đại thực bào có tương quan chặt chẽ với sự xâm lấn của tế bào. Ngoài ra, uPA và uPAR trong đại thực bào góp phần vào quá trình xâm nhập của tế bào. Do đó, ảnh hưởng của fisetin đến sự biểu hiện của uPA và uPAR đã được nghiên cứu. LPS tạo ra sự phong phú protein của uPA (Hình 3 (a)) và uPAR (Hình 3 (b)). Xử lý bằng fisetin làm giảm sự gia tăng của uPA (Hình 3 (a)) và uPAR bởi LPS (Hình 3 (b)).

3.4. Fisetin Giảm MMP -2 và MMP -9 trong Đại thực bào được kích thích bằng LPS.

Hơn nữa, để làm sáng tỏ ảnh hưởng của fise-tin đối với MMP, chúng tôi đã kiểm tra các biểu thức MMP -2 và MMP -9, các chất trung gian hạ lưu của uPA / uPAR. Về mức mRNA, LPS làm tăng đáng kể sự biểu hiện mRNA MMP -2 và MMP -9, so với phương pháp điều trị (Hình 4 (a)). Fisetin làm giảm sự tăng cường các biểu hiện gen này của MMP -2 hoặc MMP9 do LPS gây ra theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 4 (a)). Hơn nữa, các hoạt động protein của MMP -9 được đánh giá bằng phương pháp chụp cắt lớp vi tính (Hình 4 (b)). Các hoạt động của protein MMP -9 (92kDa) được tăng lên khi kích thích LPS, hoạt động này bị giảm bởi fisetin (Hình 4 (b)).

4. Thảo luận

Chúng tôi nhận thấy tác dụng quan trọng của fisetin chống lại chứng viêm ở đại thực bào. Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng fisetin làm giảm cảm ứng của các thành phần gây viêm như MCP -1, IL -1, iNOS và NO, do LPS gây ra trong đại thực bào. Ngoài ra, fisetin ngăn chặn sự kích hoạt MAPK và làm giảm sự gia tăng do LPS của biểu hiện uPA và uPAR. Hơn nữa, fisetin làm giảm sự gia tăng của mRNA phong phú của MMP -2 và MMP -9 và hoạt động của MMP -9.

Trong nhiễm trùng huyết do nhiễm trùng gram âm, LPS thường được coi là tác nhân gây nhiễm trùng huyết. Trong nhiều nghiên cứu, LPS đã được sử dụng như một mô hình của nhiễm trùng huyết cũng như viêm. Hơn nữa, viêm mãn tính gây ra ung thư sớm bằng cách kích hoạt các tế bào viêm và sản xuất không đúng chất trung gian tiền viêm như iNOS và các yếu tố phiên mã như yếu tố phiên mã hạt nhân kappa B (NF-xB) [33]. Bên cạnh đó, người ta cũng báo cáo rằng stress oxy hóa được giảm thiểu bằng cách làm giảm sự biểu hiện của iNOS [34]. Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh rằng fisetin có thể có hiệu quả trong việc phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng huyết và sốc nhiễm trùng, do tác dụng ức chế sự phong phú mRNA của các gen tiền viêm và sản xuất NO. Trong nghiên cứu này, fisetin hỗ trợ sản xuất NO bằng cách giảm sự biểu hiện của mRNA của gen tiền viêm (iNOS); do đó, rất có thể fisetin đã làm giảm stress oxy hóa. Do đó, những kết quả này hỗ trợ tác dụng chống viêm, kháng u và chống oxy hóa của fisetin.

Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng LPS gây ra quá trình phosphoryl hóa MAPK, bao gồm ERK và JNK [35]. -phages, một số báo cáo có sẵn về tác dụng của fisetin đối với sự biểu hiện và hoạt động của uPA và uPAR. Nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên chứng minh rằng fisetin ngăn chặn sự biểu hiện của uPA và uPAR do LPS gây ra thông qua việc ngăn chặn tín hiệu MAPK trong đại thực bào, như đã được báo cáo trước đây ở các tế bào ung thư.

MMP là một họ các protease có biểu hiện liên quan đến các quá trình nhất định, chẳng hạn như phát triển, sinh lý và bệnh lý. Nói chung, MMP -9 đã được công nhận là dấu hiệu của các bệnh viêm nhiễm khác nhau, chẳng hạn như xơ vữa động mạch, viêm khớp và lupus ban đỏ hệ thống [37]. Ngoài ra, MMP -9 được kết hợp chặt chẽ với việc di chuyển ô [38,39]. Một số nghiên cứu đã đặc biệt báo cáo rằng MMP -2 và MMP -9 có liên quan đến quá trình hình thành xơ vữa và đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định các mảng xơ vữa động mạch 40-42]. Về điểm này, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các chất ức chế của MMP -9 có thể hứa hẹn như một phương pháp điều trị để ổn định các mảng dễ bị tổn thương. Hơn nữa, các cuộc điều tra gần đây đã chứng minh rằng việc chữa lành vết thương trên da bị suy yếu do kích hoạt quá mức MMP -9 [43]. Do đó, người ta cho rằng fisetin cũng có tiềm năng như một phương pháp điều trị để chữa bệnh trên da. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ được yêu cầu để làm sáng tỏ chi tiết của nó về cơ chế phân tử.

Một xu hướng gần đây trong ngành công nghiệp dược phẩm đang khám phá các chiến lược để phát triển bản thân cây cỏ tự nhiên như một loại thuốc mới. Thật vậy, hai nghiên cứu trên động vật gần đây đã chứng minh rằng viêm phổi cấp do LPS và viêm khớp do collagen đã được cải thiện khi điều trị bằng fisetin|32,44. Một nghiên cứu ex vivo khác cũng chứng minh rằng fisetin có thể làm giảm sự giải phóng cytokine do LPS gây ra từ bạch cầu của bệnh nhân mắc bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính hoặc bệnh tiểu đường loại 2 [45]. Nhiều loại thuốc ức chế miễn dịch đã được phát triển để làm giảm các bệnh viêm và tự miễn [46-50]; tuy nhiên, hầu hết các com-pound đều có tác dụng phụ đáng kể. Vì polyphenol thường có trong trái cây và rau quả ăn kiêng nên có lẽ chúng có thể là chất ức chế miễn dịch an toàn hơn [51, 52]. Trái cây và rau quả chứa nhiều chất phytochemical bao gồm sesquiterpene lactones, terpenoids, polysaccharides và các hợp chất phenolic. Kết quả của chúng tôi, chứng minh tác dụng chống viêm, kháng u và chống oxy hóa của fisetin, chỉ ra rằng nó có thể được phát triển như một loại thuốc mới. Mặc dù fisetin là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho liệu pháp miễn dịch, nhưng tiềm năng của các sản phẩm tự nhiên có chứa fisetin như một tác nhân điều trị cho một bệnh nhất định cần được xác minh thêm trong môi trường lâm sàng.

5. Kết Luận

Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng fisetin làm giảm sự gia tăng củaviêmgen (MCP -1, IL -1 b, và iNOS), sản xuất NO và quá trình phosphoryl hóa MAPK, uPA, uPAR và MMPs, được cảm ứng bởi LPS trong đại thực bào. Những kết quả này cho thấy rằng fisetin có thể là một tác nhân gây bệnh cho một số bệnh liên quan đến đại thực bào.